방법 논문

아그로박테리움 매개 피토프토라 팜미보라의 변형을 위한 간소화된 방법

DOI:

10.3791/69753

⸱

2026년 3월 20일

 ,  , 
1Department of Plant Pathology, University of Georgia

이 논문에서

요약

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우리는 P. capsici 에도 적용 가능한 Phytophthora palmivora의 아그로박테리움 매개 변형을 위한 간단하고 효과적이며 재현 가능한 프로토콜을 제시합니다.

초록

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파이토프토라는 수많은 파괴적인 식물 병원체를 포함하는 오마이세테 속으로, 그 중에는 광범위한 숙주 종인 P. palmivora가 포함되어 있습니다. 파이토프토라의 기능적 유전체학은 견고하고 구현이 쉬운 변형 방법의 제한된 가용성에 의해 제약을 받아왔습니다. 사용 가능한 방법 중 아그로박테리움 매개 형질전환(AMT)은 최소한의 전문 장비가 필요하고 단일 복제 유전자 삽입으로 안정적인 형질전환체를 생산하는 경우가 많아 특히 매력적입니다. 대부분의 AMT 프로토콜은 곰팡이 및 난균류 형질전환을 위해 최소 배지(MM) 염을 아그로박테리움 유도 및 공동 배양 배양 배지에서 사용합니다. 이 매체를 준비하는 과정은 일반적으로 여러 스톡 용액을 만들고 혼합하는 과정이며, 일부는 서로 다른 농도의 여러 성분을 포함하고 있습니다. 이 과정은 시간이 많이 걸리고 오류가 잦아 변환 성공률이 일관되지 않습니다. 여기서는 상업적으로 이용 가능한 무라시게(Murashige)와 스쿠그(Skoog, MS) 기저 배지를 사용하여 아그로박테리움 유도 및 공동 배양 배지를 준비하는 P. palmivora에 대한 간소화되고 간단하며 재현 가능한 AMT 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 P. capsici 변형에도 성공적으로 적용되었으며, 다른 Phytophthora 종에도 적용될 수 있습니다.

서론

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난균류의 속인 식물균류(Phytophthora)는 세계에서 가장 파괴적인 식물 병원체를 포함하며, 심각한 경제적 손실을 초래했습니다 1,2. 그중 Phytophthora palmivora는 카카오와 파파야 3 등 경제적으로 중요한 작물을 감염시키는 광범위한 숙주 감염체입니다. 카카오는 수십억 달러 규모의 초콜릿 산업의 주요 성분을 생산하는 열대 다년생 나무인 카카오에서 흑꼬투리 부패의 가장 널리 퍼진 원인 원인입니다. 이 파괴적인 병원체의 분자적 병원성 메커니즘을 이해하는 것은 새롭고 효과적인 질병 방제 전략을 설계하는 데 매우 중요하며, 유전자 변형은 이러한 연구를 가능하게 하는 필수 도구입니다.

Phytophthora 속을 형질전환하기 위해 마이크로 투사체 폭격7, 폴리에틸렌글리콜 및 염화칼슘(PEG/CaCl2) 매개 원형질 변환 8,9,10,11, 주즈스포어 전기포자 전기포자 12,13,14, 아그로박테리움 매개 형질전환(AMT)15 등 여러 방법이 개발되었습니다.16. 이러한 접근법 중에서 AMT는 일반적으로 단일 복제 유전자 통합15,16을 생성하고 전문 장비 없이도 비교적 쉽게 수행할 수 있다는 점에서 주요 장점을 제공합니다.

AMT를 이용한 P. palmivora의 효율적인 변형 프로토콜은이전에 개발되었습니다. 이 방법을 통해 우리는 여러 구성체로 P. palmivora를 성공적으로 변형시켰다17,18. 이 방법은 곰팡이 및 난균류 형질전환에 일반적으로 사용되는 최소 배지(MM) 염 기반 아그로박테리움 유도 및 공동 배양 배지를 사용합니다15, 16, 19. MM 기반 변환 프로토콜이 변환 생성에 효과적임이 입증되었지만, 여러 스톡 용액을 준비하고 이를 결합해 미디어를 만드는 작업은 시간이 많이 걸리고 오류가 발생할 수 있습니다.

여기서는 상업용 Murashige and Skoog(MS) 기저 배지를 사용하여 Agrobacterium 유도 및 공동배양 배지의 MM 염분 기반 배지 성분을 대체하는 P. palmivora AMT의 훨씬 단순화된 방법을 제시합니다. 이 방법은 여러 화학 용액을 준비할 필요가 없어, 과정을 덜 소모하고 재현성이 높습니다. 더불어, 이 방법은 앞서 설명한 방법보다 더 높은 변환 효율을 제공하는 것으로 보이며, P. capsici에도 적용 가능합니다.

프로토콜

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1. 변환에 필요한 스톡 용액, 배지 및 기타 재료 준비

  1. 항생제 재고 용액
    1. 카나마이신(50 mg/mL), G418(15 mg/mL), 세포탁시임(100 mg/mL) 기본 용액을 준비하세요: 적절한 양의 항생제를 물에 녹이고 정액을 여과하여 멸균한 뒤 1 mL 알리코트를 준비하여 -20 °C에 보관합니다.
    2. 리팜피신 정액(15 mg/mL) 준비: 적절한 양의 리팜피신을 DMSO에 녹이고 1 mL 알리코트를 준비한 후 호일에 감싸 -20 °C에서 보관합니다.
      참고: DMSO로 제조된 화학 용액은 나일론이나 PTFE(테플론)와 같은 DMSO 호환 재료로 만든 주사기 필터를 사용하여 반드시 여과-멸균해야 합니다.
  2. 아그로박테리움 성장용 배지
    1. 루리아-베르타니(LB) 액체 배지: 250 mL의 배지를 준비하려면 6.25 g 파우더 가루를 250 mL의 물에 넣고, 용액을 오토클레이브하여 실온(RT)에서 보관합니다.
    2. LB 한천 배지: 250 mL의 배지를 준비할 때, 6.25g LB 분말과 3.75g 한천을 250 mL의 물에 넣고 오토클레이브하여 RT에 보관합니다. 플레이트를 만들기 전에 녹인 LB 한천에 적절한 항생제를 첨가하세요. 항생제를 보충한 플레이트를 4°C에서 보관하세요.
  3. P. palmivora의 성장 및 변형 매체
    1. 10% V8 한천: 500mL를 준비하려면 50mL 오리지널 100% 식물성 주스를 450mL 물에 넣습니다. 그 다음 부유액에CaCO3 0.5g을 넣고 잘 섞도록 저어줍니다. 용액을 오토클레이브한 후 접시에 부으세요.
      참고: 필요할 때 적절한 항생제를 추가하세요. 항생제를 보충한 플레이트를 4°C에서 보관하세요.
    2. 반 농도 무라시게와 스쿠그(1/2 MS) 액체 배지: 무라시게와 스쿠그 기저 배지(MS) 2.15g을 950mL 물에 넣고, 1 N KOH로 pH를 5.6으로 조절한 후 최대 1리터까지 물을 추가합니다. 직접 사용해 1/2 MS 한천(1.3.3단계)을 만들고, 남은 1/2 MS 액체는 오토클레이브하여 RT에 보관합니다.
    3. 1/2MS 한천 농천 아 가(Agrobacterium-zoospore co-cultivation agar, AZCA): 600 mL AZCA를 준비하기 위해 1.3.2단계 1/2 MS 액체 567 mL를 9g 한천과 혼합합니다. 용액을 오토클레이브해서 RT에 보관하세요.
    4. 50% 글리세롤: 50 mL 글리세롤과 물 50 mL를 섞어 용액을 오토클레이브한 후 RT에 보관하세요.
    5. 1M MES (pH 5.6): 200 mL를 준비하려면 39.048g MES 하이드레이트를 160 mL의 물에 넣고, NaOH 용액으로 pH를 5.6으로 조절합니다. 다음으로 최대 200mL의 물을 넣고, 용액을 여과하여 멸균한 뒤, 어두운 환경에서 RT에 보관하세요.
      참고: MES는 pH가 증가함에 따라 점차 용해됩니다. 처음에는 10 N NaOH를 사용해 pH를 5.6에 가깝게 만들고, 이 정도면 가루가 거의 녹아버릴 수 있습니다. 그 다음 1 N NaOH를 추가해 pH를 정확히 5.6으로 만듭니다.
    6. 20% 포도당: 10g의 포도당을 40mL의 물에 녹인 후 최대 50mL까지 물을 추가한 뒤 용액을 여과하여 멸균한 후 RT에 보관합니다.
    7. 200 mM 아세토시린곤(AS): 4'-하이드록시-3', 5'-디메톡시아세토페논 40mg을 1 mL DMSO에 녹이고 용액을 호일로 덮습니다. 변신하는 날에 신선하게 만들어 주세요.
    8. 아그로박테리움 유도 배지(AIM): 40 mL 배지를 준비하기 위해, 멸균 50 mL 튜브에 50% 글리세롤 400 μL 400 μL, 20% 포도당 400 μL 400 mL, 1/2 MS 액체(pH 5.6) 용액 37.6 mL(1.3.2 단계에서 준비됨)를 무균 50 mL 튜브에 첨가합니다. 용액을 잘 섞고, 튜브를 호일로 덮은 후 몇 시간 내에 신선하게 사용하세요.
    9. 아그로박테리움-조주포자 공동 배양 한천(AZCA): 600 mL의 한천을 준비하기 위해 50% 글리세롤 6 mL, 20% 포도당 3 mL, 1 M MES(pH 5.6) 24 mL, 200 mM AS 600 μL 용융 567 mL 1/2 MS 한천(pH 5.6)(1.3.3단계에서 준비됨)을 첨가합니다. 용액을 접시에 부어 검은 천으로 덮어 빛을 차단하세요.
      참고: 온도가 55-60 °C일 때 화학 용액을 녹인 1/2 MS 한천에 첨가하세요(단계 1.3.9). AS는 빛에 민감하므로 1.3.7-1.3.9 단계에서 보닛 내 조명을 끄세요. 변신하는 날에 이 세 단계를 수행하세요.
    10. 플리치 아가: 1L 아가르를 950 mL의 물에 넣기 위해 0.5 g KH2PO4, 0.25 g MgSO4·7H2O, 1g L-아스파라긴 1g, 5g 포도당, 0.5g 효모 추출물, 10 μL 티아민(100 mg/mL 물, 4 °C 저장), 10 mg β-시토스테롤(첨가 전 3 mL 에탄올에 용해). 용액을 저어 모든 재료를 녹인 후, 물을 넣어 1L까지 부피를 만듭니다. 용액을 500mL씩 나누고, 각 500mL에 7.5g 한천을 넣으세요. 용액을 오토클레이브한 후 온도가 55°C로 떨어지면 적절한 항생제를 첨가한 후 플레이트에 부어줍니다.
    11. 하이본드 N+ 멤브레인: 보호판이 있는 멤브레인을 5cm x 6cm 크기로 잘라내고, 알루미늄 호일로 감싼 후 오토클레이브합니다. 오토클레이브된 막을 AZCA 배지에 올릴 때는 멸균 겸자로 만지고 보호 시트는 버리세요.

2. P. palmivora 배양

  1. 전환 7일에서 8일 전에, P. palmivora 파파야를 새로 만든 10% V8 한천 플레이트에 이전에 키운 피토프토라 배양물(또는 육축에서 가져온 한천 플러그 하나)을 페트리 접시 중앙에 올려 배양합니다.
    참고: 더 높은 농도의 수주포자를 얻으려면 신선하게 준비된 10% V8 한천을 사용하는 것이 중요합니다.
  2. 판을 25°C에서 12시간의 빛/12시간의 암색 주기 아래 7-8일간 배양하여 변형이 일어납니다.

3. 아그로박테리움 투메파시엔스의 제제

  1. 형질전환 3일 전, 스트릭 A. 투메파시엔스 가 LB 한천 플레이트에 pCB301TOR-GFP16 을 운반한 EHA105를 변주시키고, 리팜피신(15 μg/mL)과 카나마이신(50 μg/mL)을 보완했습니다. 플레이트를 28°C에서 2일간 부양하세요.
    참고: 아그로박테리움의 초기 준비(3.1단계)는 형질전환 일주일 전에 할 수 있으며, 2일간의 배양 후 플레이트는 4°C에서 보관할 수 있습니다.
  2. 형질전환 전날, 소량의 아그로박테리움 세포를 제거하여 무균 1.5 mL 마이크로 원심분리관의 하단과 평평한 바닥을 사용해 항생제를 보충한 새로운 LB 한천 플레이트에 발랐습니다(3.1단계에서 설명됨). 더 쉽게 확산하기 위해 LB 한천 플레이트 중앙에 20 μL LB 액체 배지를 넣고, 박테리아 세포를 LB 배지와 혼합한 후 플레이트 전체에 고르게 펴 퍼뜨리세요. 플레이트를 28°C에서 하룻밤 약 16-18시간 부화하세요.
  3. 1mL 피펫 팁으로 하룻밤 동안 배양한 세포를 퍼내고, 위아래로 피펫팅하여 1mL 아그로박테리움 유도 배지(AIM)에 재현탁합니다. 멸균된 50mL 튜브에 호일로 덮인 상태에서 AIM으로 OD600 = 0.4로 희석합니다. P. palmivora zoospores와 공동 배양할 때 최소 5mL를 만드세요(5.1단계).
    참고: OD600 범위는 0.1에서 0.8 사이로, 성공적인 변환을 가능하게 합니다. OD600 = 0.4는 최소 배지(MM) 염 기반 아그로박테리움 유도 및 공동 배양 배지를 사용했을 때 가장 높은 형질전환 효율을 보였기 때문에 일상적으로사용됩니다.
  4. 박테리아를 RT에서 어두운 환경에서 약 70rpm 부드럽게 교반하며 1.5-2시간 동안 배양합니다.
    참고: 3.3단계에서는 후드 조명을 끄고, 인큐베이션(3.4단계) 50mL 튜브 뚜껑을 풀어주는 것이 권장됩니다.

4. 수수포자 방출

  1. Agrobacterium tumefaciens의 배양 1시간(단계 3.4) 후, 7-8일 된 P. palmivora 플레이트에 4°C로 미리 냉각된 10mL 물을 담고, 피펫 팁으로 부드럽게 두드려 배지 표면의 기포를 제거한 뒤, 4°C에서 15분간 배양한 뒤, 빛 아래 RT에서 15분간 배양합니다.
  2. 방출된 동물성 포자(약 7-8mL)를 균사체와 포자낭을 손상시키지 않고 피펫으로 15mL 멸균 원심분리관으로 부드럽게 옮깁니다.
  3. 주주포자 농도를 측정하기 위해, 주주포자 부탁액 일부(예: 20 μL)를 1.5 mL 미세원심분리관에 옮기고 물을 10배 희석합니다(20 μL 수주포자는 180 μL H2O). 튜브를 1분간 소용돌이로 돌려 수농포자를 낭포로 만들어 쉽게 세기 후, 현미경으로 헤마세포미터를 사용해 수주포자의 수를 세세요. 계산된 숫자에 10배를 곱하여 4.2단계에서 준비한 주즈포자 현탁액의 농도를 계산합니다.
    참고: 주즈포자 농도는 변환 효율을 계산하기 위해 측정됩니다. 일반적으로 1.5 × 10 6에서 5 × 106 Zoospore/mL 사이의 농도를 사용하며, 형질변환 성공률을 보입니다.

5. 아그로박테리움과 수수포자의 공동 배양

  1. 5mL의 아그로박테리움(3.4단계에서 준비됨)을 5mL의 주전자 포자 현탁액(4.2단계에서 준비)을 멸균된 50mL 튜브에 호일로 덮은 채로 넣습니다. 튜브를 부드럽게 섞어 RT에서 어둠 속에서 2시간 배양하세요. 뚜껑을 느슨하게 유지하고 공동 인큐베이션 중에는 튜브를 흔들지 마세요.
  2. 동인큐베이션 기간(단계 5.1) 동안 AZCA 플레이트를 준비합니다(단계 1.3.9). 배지가 굳으면 각 AZCA 플레이트 위에 멸균된 하이본드 N+ 막 한 조각(1.3.11단계에서 준비됨)을 놓고 플레이트를 어둠 속에 둡니다.
  3. 아그로박테리움과 동물포자 공동 배양 2시간(단계 5.1) 후, 피펫 팁으로 각 Hybond N+ 막에 300 μL을 발라(단계 5.2), 가장자리를 액체에서 자유롭게 둡니다.
  4. 페트리 접시를 덮지 않고 후드에서 약 10분간 자연 건조시키세요. 막의 용액이 흐르지 않게 되면 바로 플레이트를 덮으세요.
    참고: 5.1-5.4 단계에서는 보닛 조명을 꺼두세요. 필요하다면 혼합물을 멤브레인에 추가하고 펴 놓는 동안 조명을 사용하세요(5.3단계).
  5. 자연 건조 후에는 25°C에서 어두운 환경에서 2일간 배양합니다.

6. G418 내성 변형체의 선택

  1. 48시간의 공동 인큐베이션(단계 5.5) 후, 멸균된 겸자를 사용해 Hybond N+ 막을 거꾸로 옮겨 G418(30 μg/mL)과 세포탁시임(100 μg/mL)을 보충한 플리치 한천 플레이트에 옮깁니다. 막을 플레이트 위에 올릴 때는 매체 표면에 끌어당기지 마세요.
    참고: 각 P. palmivora 분리주별 변형체 선택을 위한 G418 농도를 결정해야 하며, 이는 분리주마다 민감도 수준이 다르기 때문입니다. 이를 위해 Plich 한천 플레이트 중앙에 직경 0.5cm의 균사체 플러그를 놓고, 0부터 시작해 5 μg/mL 단위로 G418 농도를 보충합니다. 각 농도별로 복제판 3개를 준비하세요. 판을 25°C에서 7일간 부양하세요. 피토프토라 분리물의 성장을 완전히 억제하는 가장 낮은 G418 농도를 찾아 변형체 선별에 활용합니다.
  2. 1.5 mL 마이크로 원심분리관의 평평한 바닥을 사용해 막 표면을 부드럽게 누르고 미끄러뜨려 배지와 밀접하게 접촉하도록 합니다. 판 밑면을 관찰하여 막과 배지 사이에 공기 방울이 있는지 확인하세요. 같은 마이크로 원심분리기 튜브의 평평한 바닥을 사용해 공기 방울이 있다면 부드럽게 짜내세요.
  3. 판을 25°C에서 12시간 조명/12시간 암 주기 아래 2-3일간 배양합니다.
  4. 3일간의 배양 후에는 멸균 겸자로 막을 제거하고 같은 조건에서 판을 계속 배양합니다. 플레이트에 눈에 띄는 집락이 나타나면 2일 후에 막을 제거할 수 있습니다.
    참고: 변형체는 보통 막 제거 후 1-3일 이내에 나타나지만, 일부 콜로니는 더 늦게 나타날 수 있습니다. 더 많은 변형체를 얻으려면, 막을 제거한 후 약 일주일간 플레이트를 관찰하세요.
  5. 변환체를 같은 농도의 G418 또는 30% 감소된 10% V8 한천 플레이트에 옮깁니다.

결과

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이 프로토콜을 따라, 우리는 pCB301TOR-GFP16을 운반한 A. tumefaciens EHA105를 이용해 P. palmivora를 변형하는 두 가지 독립 실험을 수행했습니다. 예상대로 수주포자를 아그로박테리움과 공동 배양했을 때, 30 μg/mL G418을 보충한 플리치 한천 플레이트에서 G418 내성 군락이 형성되었으나, 대조판에서는 아그로박테리움 감염이 없는 군락이 관찰되지 않았습니다(그림 1A). 이 두 실험에서 생성된107개의 수주포자당 G418 내성 변환체의 수는 각각 55개와 50개였으며(표 1), 이는 이전 프로토콜16으로 얻은 최고 수치인 27± 5개의 거의 두 배에 달하는 수치입니다.

진정한 형질전환체는 두 가지 방법으로 검증되었습니다: 첫째, 형광 현미경을 이용한 GFP 형광 관찰, 둘째, EGFP-F2(5'- GACGTAAACGGCCACACAGTT-3')와 EGFP-R2(5'-GGGTGCTCGTAGTAGGGTTG-3')를 이용한 Taq 2X 마스터 믹스(NEB)를 이용한 EGFP 유전자 550 bp 조각의 PCR 증폭입니다. 실험(실험) 1에서는 18개의 G418 내성 변환체 중 15개, 실험 2에서는 21개 중 17개가 GFP 형광을 보였습니다(표 1, 그림 1B). 두 실험에서 형광을 보이지 않은 7개의 G418 내성 변환체에 대해 3개는 PCR을 통해 진정한 변환체임이 확인되었습니다(그림 1C). 총 확산율은 90%로 추정됩니다.

또한, P . capsici 호박 분리주인 PC2024-14sz를 성공적으로 형질전환하는 데 성공했으며, pCB301TOR-GFP를 탑재한 A. tumefaciens EHA105를 사용해 프로토콜에 따라 조주포자 현탁액 준비에 약간의 수정을 가했습니다(7일 된 P. capsici 플레이트를 미리 냉각된 물로 침수한 후 4°C에서 4°C에서 잠복 기간이 30분으로 연장됨). 단일실험에서 10 7명당 13개의 G418(30 μg/mL) 내성 변환체가 13개였습니다. 형광 현미경으로 관찰된 9종의 형광체가 모두 형광을 방출하여 이들이 진정한 형광체임을 시사합니다(보조 파일 1).

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그림 1: PCB301TOR-GFP를 운반한 A. tumefaciens EHA105 를 이용 한 P. palmivora 형질. (A) 30 μg/mL G418을 보조한 Plich 한천에서 G418 내성 P. palmivora 형질균의 출현. (B) 대표적인 형질변환체 및 P. palmivora 야생형(WT) 균주에서 형광현미경 하에서 GFP 발현을 검출. 이미지는 밝은 영역(BF)과 GFP 형광 채널 모두에서 촬영되었습니다. (C) GFP 형광이 검출 가능한 4개와 GFP 형광이 없는 7개의 형질전환체에서 EGFP의 PCR 증폭. 범용 프라이머 쌍 ITS4/ITS520을 사용하여 내부 전사 스페이서(ITS) 영역을 증폭하여 DNA 무결성을 확인하였습니다. GFP 형광이 없는 형질변환체는 굵고 밑줄이 그어진 글씨로 강조되어 있습니다. 약어: M = NEB 100 bp DNA 사다리; WT = 야생형 P. palmivora P1 분리어; N = H2O를 템플릿으로 사용한 음성 대조군 PCR. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

실험아그로박테리움의 OD600주스포자 농도 (/mL)주즈포자 부피 (mL)G418 내성 변형체의 수검출 가능한 GFP 신호를 가진 변질체 수 (탐지/관찰됨)G418 내성 변형체 수/107 수수포자
10.41.8 x 1064.34315/1855
20.42.9 x 1064.66717/2150

표 1: pCB301TOR-GFP를 운반 한 A. tumefaciens EHA105 를 이용 한 Agrobacteria 매개 P. palmivora 변형의 효율성.

보충 파일 1: 야생형(WT) P. capsici 및 A. tumefaciens EHA105 를 이용해 생성된 대표 형질 형 광 현미경 하에서 pCB301TOR-GFP를 운반한 GFP 발현. 이미지는 밝은 영역(BF)과 GFP 형광 채널 모두에서 촬영되었습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 반 강도의 무라시게(Murashige) 및 스쿠그 기저 배지(1/2 MS)를 사용하여 아그로박테리아 유도 및 공동 배양 배지에서 흔히 사용되는 최소 배지(MM) 염의 성분을 대체합니다. MM 염 기반 배지를 준비하려면 여러 개별 화학물질로 여러 개의 스톡 용액을 만든 후 이 용액들을 혼합해야 합니다. 1/2 MS에는 많은 화학 성분도 포함되어 있습니다; 하지만 MS는 미리 혼합된 분말로 상업적으로 널리 판매되고 있기 때문에, 미디엄 준비는 분말을 물에 녹이는 것으로 단순화됩니다. 이 개조는 미디어 준비 시간을 크게 단축하고 인적 오류 가능성을 최소화합니다. 또한, 이 프로토콜은 변환 효율을 향상시켜 앞서 설명한 AMT 방법16보다 더 많은 변환체를 생성합니다. 또한 P. capsici 변형에도 효과적이며, 다른 Phytophthora 종에도 적용 가능할 가능성이 높습니다. MS 기반 배지는 이전에 AtVIP1(Arabidopsis thaliana VirE2-상호작용 단백질 1)과 P. infestans의 수수포자 공동 배양에 사용되어 P. infestans21의 성공적인 변형을 가능하게 했습니다.

이 프로토콜은 오탐 비율이 낮을 수 있다는 점을 유의해야 합니다. GFP 형광 관찰 또는 PCR로 검사된 39종의 G418 내성 형질전환체 중 4종은 EGFP의 형광이나 증폭을 모두 보이지 않았습니다(표 1, 그림 1C). 아그로박테리움 매개 변형 과정에서 T-DNA가 부분적으로 통합되는 경우가 드물지 않으므로(22,23), 플라스미드 pCB301TOR-GFP16의 NPTII 유전자를 포함한 T-DNA 일부만이 P. palmivora 게놈에 통합되었을 가능성이 있다. 또는 위양성은 막과 선택 배지 간의 접촉이 부족해 G418 선택에서 벗어날 수 있습니다. 따라서 막이 배지와 완전히 접촉하도록 하는 것이 필수적이다(6.2단계).

이 프로토콜은 더 단순화될 수 있습니다. 예를 들어, 아그로박테리움 유도 배지(AIM)와 아그로박테리움-조종포자 공동 배양 한천(AZCA)에서의 MES는 생략될 수 있습니다. MES는 생화학 및 분자생물학 실험에서 안정적인 pH를 유지하기 위해 완충제로 흔히 사용됩니다; pH 5.6에서 1M MES 스톡 용액을 준비하는 데는 충분한 시간이 걸리고 비용도 증가합니다. 스위트 바질24 와 파파야25와 같은 식물의 AMT에서는 MES가 없는 유사한 MS 기반 아고박테리움 유도 및 공동 재배 매체가 사용되었으므로, MES가 P. palmivora 형질전환에 필수적이지 않을 수 있음을 시사합니다. MES 누락이 변환 효율성을 저해하지 않는다는 것을 확인하기 위해서는 추가 실험이 필요합니다.

전반적으로 이 단순화된 프로토콜은 P. palmivora, P. capsici 및 잠재적으로 다른 난균류의 일상적인 유전자 조작을 위한 실용적이고 접근 가능한 플랫폼을 제공합니다. 이 연구는 감염 역학을 추적하기 위한 병원체의 형광 표지, 세포 내 위치 분석을 위한 단백질 태깅, 유전자 발현 또는 단백질 코딩 서열의 표적 변화를 통한 기능 분석 등 번역 잠재력을 가진 광범위한 기초 연구를 지원합니다. CRISPR 기반 유전체 편집과 결합되면, 이 프로토콜은 병원성 기전 해부와 이러한 파괴적 병원체의 주요 병원성 인자 식별을 가속화할 것으로 기대됩니다. 그 결과 얻은 통찰은 새로운 기전 기반 질병 통제 전략 개발을 가능하게 할 것입니다.

공개 사항

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저자들은 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

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이 연구는 미국 국립과학재단(NSF 상 번호 2418799)과 국립식품농업연구소(NIFA 상 번호 2023-67013-42262)의 지원을 받고 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1.5 mL 마이크로 원심분리관VWR525-1126
4'-하이드록시-3', 5' 디메톡시아세트페논TCID2666아세토시링곤 (AS)
50 mL 튜브그레이너 바이오-원227261
절대 에탄올피셔 바이오리시약BP28184
아가르피셔 바이오리시약BP1423-500
알루미늄 호일
하이본드-N+ 막 (30cm & 시간 3m)시티바RPN303B
탄산칼슘시그마-올드리치239216-500GCaCO3
세포탁시임 나트륨 소금열보 사이언티브 케미컬스AAJ6269006
D-(+)-포도당시그마-올드리치G8270-1KG
DNeasy PowerLyzer 미생물 키트치아겐12255-50
겸자
형광 현미경자이스ZEISS Axioscope 5 형광 현미경, 필터 세트 38 HE
G418 황산염열보 사이언티브 케미컬스AC329400010
글리세롤시그마-올드리치911046-1L
혈구계 (브라이트라인)하우서 사이언티브
카나마이신 황산염산타크루즈 바이오테크놀로지SC-257635
L-아스파라진 무수MP 생의학ICN10079425
LB 브로스, 밀러피셔 바이오리시약BP1426-2
황산마그네슘 헵타하이드레이트시그마-올드리치63138-250GMgSO4· 7H2O
MES 하이드레이트시그마-올드리치M2933-100G
무라시게와 스쿠그 기저 매체시그마-올드리치M5519-50L
페트리 접시 (100 mm x 15 mm)VWR25384-342
인산칼륨 이수소시그마-올드리치1370391000KH2PO4
리팜피신산타크루즈 바이오테크놀로지SC-200910
Taq 2X 마스터 믹스NEBM0270L
티아민 염산염시그마-올드리치T4625-5G
UV-가시광선 분광광도계피셔 사이언티브14-385-355
V8 오리지널 100% 야채 주스캠벨 수프 컴퍼니
보텍서피셔 사이언티브14-955-163
물분자생물학 등급, Mill-Q 정수 시스템을 이용해 정제됨
효모 추출물아크로스611805000현재 Thermo Scientific Chemicals를 통해 구입 가능
&β;-시토스테롤시그마-올드리치85451-100G

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kamoun, S., et al. The top 10 oomycete pathogens in molecular plant pathology. Mol Plant Pathol. 16 (4), 413-434 (2015).
  2. Jones, J. D., Staskawicz, B. J., Dangl, J. L. The plant immune system: From discovery to deployment. Cell. 187 (9), 2095-2116 (2024).
  3. Tocafundo, F., et al. Direct and cross-pathogenicity of Phytophthora palmivora against cacao, papaya, and peach palm. Trop Plant Pathol. 46 (6), 664-673 (2021).
  4. Morales-Cruz, A., et al. Independent whole-genome duplications define the architecture of the genomes of the devastating West African cacao black pod pathogen Phytophthora megakarya and its close relative Phytophthora palmivora. G3 (Bethesda). 10 (7), 2241-2255 (2020).
  5. Ali, S., et al. PCR-based identification of cacao black pod causal agents and identification of biological factors possibly contributing to Phytophthora megakarya's field dominance in West Africa. Plant Pathol. 65 (7), 1095-1108 (2016).
  6. Marelli, J. -P., et al. Chocolate under threat from old and new cacao diseases. Phytopathology. 109 (8), 1331-1343 (2019).
  7. Cvitanich, C., Judelson, H. S. Stable transformation of the oomycete, Phytophthora infestans, using microprojectile bombardment. Curr Genet. 42 (4), 228-235 (2003).
  8. Judelson, H. S., Tyler, B. M., Michelmore, R. W. Transformation of the oomycete pathogen, Phytophthora infestans. Mol Plant Microbe Interact. 4 (6), 602-607 (1991).
  9. Wang, W., et al. an oxathiapiprolin-resistance gene, functions as a novel selection marker for Phytophthora transformation and CRISPR/Cas9 mediated genome editing. Front Microbiol. 10, 2402(2019).
  10. Dai, T., et al. An improved transformation system for Phytophthora cinnamomi using green fluorescent protein. Front Microbiol. 12, 682754(2021).
  11. Fang, Y., Cui, L., Gu, B., Arredondo, F., Tyler, B. M. Efficient genome editing in the oomycete Phytophthora sojae using CRISPR/Cas9. Curr Protoc Microbiol. 44 (1), 21A.1.1-21A.1.26 (2017).
  12. Evangelisti, E., Yunusov, T., Shenhav, L., Schornack, S. N-acetyltransferase AAC (3)-i confers gentamicin resistance to Phytophthora palmivora and Phytophthora infestans. BMC Microbiol. 19 (1), 265(2019).
  13. Dong, L., et al. Establishment of the straightforward electro-transformation system for Phytophthora infestans and its comparison with the improved PEG/CaCl2 transformation. J Microbiol Methods. 112, 83-86 (2015).
  14. Huitema, E., Smoker, M., Kamoun, S. A straightforward protocol for electro-transformation of Phytophthora capsici zoospores. Methods Mol Biol. 712, 129-135 (2011).
  15. Vijn, I., Govers, F. Agrobacterium tumefaciens mediated transformation of the oomycete plant pathogen Phytophthora infestans. Mol Plant Pathol. 4 (6), 459-467 (2003).
  16. Wu, D., Navet, N., Liu, Y., Uchida, J., Tian, M. Establishment of a simple and efficient Agrobacterium-mediated transformation system for Phytophthora palmivora. BMC Microbiol. 16 (1), 204(2016).
  17. Gumtow, R., Wu, D., Uchida, J., Tian, M. A Phytophthora palmivora extracellular cystatin-like protease inhibitor targets papain to contribute to virulence on papaya. Mol Plant Microbe Interact. 31 (3), 363-373 (2018).
  18. Pettongkhao, S., Navet, N., Schornack, S., Tian, M., Churngchow, N. A secreted protein of 15 kDa plays an important role in Phytophthora palmivora development and pathogenicity. Sci Rep. 10 (1), 2319(2020).
  19. Minz, A., Sharon, A. Electroporation and Agrobacterium-mediated spore transformation. Molecular and Cell Biology Methods for Fungi. Sharon, A. , Humana Press. Totowa, NJ. 21-32 (2010).
  20. Bellemain, E., et al. ITS as an environmental DNA barcode for fungi: An in silico approach reveals potential PCR biases. BMC Microbiol. 10 (1), 189(2010).
  21. Wang, L., et al. A modified Agrobacterium-mediated transformation for two oomycete pathogens. PLoS Pathog. 19 (4), e1011346(2023).
  22. Wu, E., et al. Optimized Agrobacterium-mediated sorghum transformation protocol and molecular data of transgenic sorghum plants. In Vitro Cell Dev Biol Plant. 50 (1), 9-18 (2014).
  23. Sun, L., et al. TDNAscan: A software to identify complete and truncated T-DNA insertions. Front Genet. 10, 685(2019).
  24. Navet, N., Tian, M. Agrobacterium-mediated transformation of sweet basil (Ocimum basilicum). Bio Protoc. 10 (22), e3828-e3828 (2020).
  25. Hasley, J., Dinulong, R. -J., Adhikari, A., Christopher, D., Tian, M. Genome editing of papaya using both Cas9 and Cas12a. bioRxiv. , (2025).

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Agrobacterium TransformationPhytophthora PalmivoraZoospore Co IncubationGFP ExpressionGene Function AnalysisFluorescence MicroscopyOomycete TransformationMurashige Skoog MediumG418 SelectionProtein Localization

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