방법 논문

인간 지방세포에서 지질 방울 축적의 분화 및 유도 연구를 통한 시험관 내 비만 연구

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DOI:

10.3791/69759

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2026년 3월 20일

 ,  ,  , 
1Department of Cell Pathology, Faculty of Biotechnology, University of Wroclaw

이 논문에서

요약

제시된 프로토콜은 인간 비만을 모방하는 세포 모델을 개발하는 것을 목표로 합니다. 이를 위해 인간 지방유래 줄기세포를 지방세포로 분화시키고, 선택된 지방산 혼합물로 지방을 살롱합니다.

초록

비만 관련 지방 조직 변화는 국소 분비 프로필을 변화시키고 암세포를 포함한 주변 세포와의 상호작용에 영향을 미칩니다. 영양분의 지속적인 전달은 지방 세포의 신진대사를 변화시켜 지방 세포가 지질 저장소 역할을 하게 만듭니다. 일반적으로 비만 메커니즘 연구는 동물 모델에 의존하지만, 이는 세포 수준에서의 대사 과정을 분석할 수 없습니다. 따라서 비만 지방세포의 기능 변화를 탐구할 수 있는 신뢰할 수 있는 시험관 내 비만(in vitro ) 모델을 개발할 필요가 있습니다. 이 연구는 인슐린, 이소부틸-1-메틸잔틴, 덱사메타손, 인도메타신의 혼합물을 사용하여 인간 지방세포를 그 전구체(지방유래 줄기세포)로부터 구분하는 프로토콜을 제시합니다. 이후 분화된 지방산을 리놀레이트, 팔미테이트, 올레이트 등 일련의 지방산과 함께 배양하여 지질 축적을 촉진했다. 그 결과, 비만 조건에서 비대 세포를 모방하는 귀중한 모델이 만들어졌으며, 이는 추가 연구에 활용될 수 있습니다.

서론

비만은 근골격계 질환, 심혈관 질환, 인슐린 저항성, 대사 증후군, 당뇨병, 특정 암 유형 등 다양한 질병의 주요 위험 요인으로 여겨집니다. 비만은 가장 인지되고 과소평가된 공중보건 문제 중 하나로, 원인은 다원천적입니다. 간단히 말해, 비만은 섭취한 칼로리와 소비하는 칼로리의 불균형에 의해 유발되며, 이는 지방 저장 증가로 이어집니다2. 칼로리 과잉은 신체의 에너지 항상성 조절에 핵심 요소인 지방 조직(AT)의 병리적 팽창과 기능 장애를 초래합니다.

지방 세포는AT3의 주요 세포 구성 요소입니다. 비만 상태에서 AT 성장의 주요 원인은 세포 비대, 즉 세포질 내에 지질 방울(LDs) 형태로 저장된 지방의 양이 증가하여 지방혈구의 부피가 증가하는 것입니다. 비만이 복잡한 병리학적 장애이더라도, 지방세포의 생물학적 기능에 대한 연구는 그 원인을 분석하고 새로운 치료 전략을 탐색하는 모델이 될 수 있습니다. 이는 지방 세포 기능 변화를 촉진하는 분자 메커니즘에 대한 더 깊은 이해가 비만 관련 질병을 표적으로 하는 새로운 치료 전략을 개발할 필요성을 강조합니다.

동물 모델은 생리학적 조건을 가장 잘 반영하여 비만의 생체 내 연구에 널리 사용됩니다. 그러나 이러한 다층 시스템에서 세포 수준에서의 근본적인 생물학적 과정에 대한 결론을 도출하는 것은 여전히 매우 어렵기 때문에, 시험관 내 지방세포 모델 사용이 유리하다. 시험관 내 연구는 대부분 마우스 3T3-L1 세포 모델을 기반으로 하며, 적절한 조건에서 지방세포 유사 표현형6을 획득합니다. 그러나 기원 때문에 이 모델은 인간 세포와의 공동 배양 조건과 같은 더 복잡한 분석에 사용할 수 없으며, 결과가 항상 인간 지방세포로 직접 번역될 수 없습니다. 이 모든 이유들로 인해, 인간의 비만을 모방하는 모델이 연구 중이며, 인간 지방유래 줄기세포(ADSC)와 이들의 분화를 이용하는 것이 합리적인 것으로 보입니다. 따라서 이 모델은 복잡성이 낮아 인간 지방세포 비대를 시험관 내에서 연구하는 데 가장 적합합니다. 이는 지방 조직에 여러 세포 유형이 존재하기 때문에 생체 내에서 불가능한 단일 세포 배양 유형의 매개변수를 서로 다른 조건에서 비교할 수 있게 합니다.

인간 전지방세포와 지방유래 줄기세포가이 조직의 기능 장애를 연구하는 가장 일반적인 예입니다. 이 세포들은 분화 후 지방세포의 LD 수치를 추가적인 비육으로 조절하는 매력적인 모델입니다. 그럼에도 불구하고, 인간 세포 7,8,9의 비대를 조사한 연구는 상대적으로 적으며, 대부분은 LD 축적을 유도하기 위해 한 가지 종류의 지방산(FA)만을 사용합니다.

이 프로토콜은 인간 지방혈구에 팔미테이트, 올레이트, 리놀레이트 혼합물을 보충하여 비만 환경을 모방하는 것을 제안합니다. 이로 인해 지질이 과부하된 인간 지방세포를 기반으로 한 도구를 개발할 수 있으며, 이는 대조(순진) 지방세포와 직접 비교할 수 있습니다. 이 모델은 이후 정상 및 비대 지방세포 간의 표현형 및 기능 변화를 연구하거나, 필요 시 공동 배양 조건을 이용한 실험에 활용될 수 있습니다.

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프로토콜

무균 기법을 사용하여 층류 세포 배양 후드에서 프로토콜의 모든 단계를 수행하세요. 모든 시약과 장비에 대한 자세한 내용은 재료표를 참조하세요. 아래에 설명된 분화 프로토콜은 인간 지방유래 줄기세포에 적합하며, 다른 세포 유형과 그 기원에 따라 다를 수 있습니다. 시약과 사용된 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 미분을 위한 ADSC의 준비

  1. ADSCs 성장 배양지(ADSCs GM) 준비: 1g/L 포도당을 포함한 Dulbecco's 변형 Eagle 배지(DMEM)에 10% 태아 소 혈청(FBS), 2 mM 글루타민, 항생제 - 항균류 용액(100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 0.25 μg/mL 암포테리신 B)을 보충합니다.
  2. ADSC의 GM, 인산 완충식염수(PBS), 트립신/EDTA 용액을 37°C로 가열합니다.
    참고: ADSC는 상업용 출처에서 얻습니다. 초기 통로에서 세포를 사용하세요. 다중 통과는 ADSCs의 분화 잠재력을 감소시킵니다.
  3. 세포 배양용 T75 플라스크에서 ADSCs GM을 무균으로 제거하세요.
  4. 잔류 ADSC를 5mL PBS로 세포 배양 접시를 세척하여 GM을 세척합니다.
  5. 플라스크에서 PBS 전체 부피를 제거하세요.
  6. 배양 접시에 2mL의 트립신/EDTA를 추가하고 37°C에서 세포가 분리될 때까지 배양합니다. 이 과정을 거꾸로 현미경으로 관찰하세요.
    참고: 배양 접시를 두드리면 세포 박리가 빨라집니다.
  7. 신선 ADSCs GM 6mL를 추가하여 트립신 활성을 차단합니다.
  8. 배양 접시에서 세포 부유액 전체를 원심분리에 적합한 튜브로 옮깁니다.
  9. 셀을 300 x g 온도에서 실온(RT)에서 5분간 원심분리합니다.
  10. 상정액을 제거하세요.
  11. 새로 첨가된 ADSCs GM 2mL에 세포를 현탁합니다.
  12. 혈세포계나 자동 세포 계수기로 세포 밀도와 생존 가능성을 계산하세요.
    참고: 세포 생존성은 트리판 블루 염색법을 사용하여 평가할 수 있습니다.
  13. 원하는 수의 웰, 15,000 셀/웰, 96웰 플라스틱 플레이트를 100 μL ADSCs 성장 배양지에 씨앗 뿌립니다.
    참고: 종자 세포는 항상 두 개로 사용하여 FAs 상태에서 대조 및 배양을 위한 지방세포를 얻어야 합니다. 실험 종류에 따라 ADSC는 다양한 종류의 플라스틱 플레이트나 접시에 시딩될 수 있습니다. 권장 파종 밀도는 30,000-60,000 세포/cm²입니다. 후속 분석이나 후속 실험에 필요한 세포 수에 따라 세포 배양 접시의 포맷을 6웰 또는 12웰 플레이트에 맞게 조정하세요.
  14. 세포를 5%CO2가 포함된 가습 대기에서 37°C에서 배양합니다.
  15. 세포가 100% 합합에 도달하면(일반적으로 플레이트 후 24-48시간 후), 아래 지침에 따라 세포를 지방세포로 분화시킵니다.
    참고: 분화 유도 전에 높은 수준의 세포 수합에 도달하는 것이 중요합니다. 다른 경우에는 미분의 효율성에 영향을 줄 수 있습니다. 플레이트 세포의 경우 높은 수율에 도달하는 데 48시간 이상 걸린다면, 신선한 ADSCs 성장 배양지를 위해 3-4일마다 배양지를 교체하세요.

2. 지방생성 분화 유도

  1. 분화 배지(DM) 준비: DMEM/F12 배지에 10% FBS, 2 mM 글루타민, 항생제 - 항균류 용액(100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 0.25 μg/mL 암포테리신 B), 5 μg/mL 인슐린, 0.5 mM 3-이소부틸-1-메틸잔틴(IBMX), 5 μM 덱사메타손, 200 μM 인도메타신을 보충합니다.
    참고: DM은 직접 사용할 수 있는 부피만을 준비하세요. 오랜 기간 보관하지 말고, 항상 신선하게 준비한 DM을 사용하세요. 사용 전에 DM을 물욕에서 37°C까지 데웁니다. IBMX와 인도메타신은 37°C 이하의 낮은 온도에서 배지에 첨가되면 침전될 수 있습니다. 용해시키려면 물을 37°C로 물에 데우세요.
  2. 무균으로 매질의 전체 부피를 합류 ADSC에서 제거하고 버려.
    참고: DM을 추가하기 전에 ADSC의 성장 배지를 완전히 제거해야 합니다.
  3. 96웰 플레이트에서 자라는 세포에 100 μL/웰의 DM을 조심스럽게 추가하세요.
    참고: 배지를 교체할 때 세포가 마르지 않도록 하세요.
  4. 세포를 인큐베이터 내에서 37°C, 5%CO2 온도에서 7일간 배양합니다.
  5. ADSC에서 DM 전체 볼륨을 제거하고 버려.
  6. 96웰 플레이트에서 성장하는 세포에 신선한 DM 100 μL/웰을 조심스럽게 첨가합니다.
  7. 세포를 인큐베이터 내에서 37°C,CO2 5% 온도에서 7일간 배양합니다.
    참고: 지방생성 분화의 진행 상황은 유도된 세포 내에 나타나는 지질 공포의 밝은 시야 관측을 통해 감지할 수 있습니다.

3. 지방세포의 비육

  1. 지방세포 배양지를 FA로 보조합니다: DMEM/F12 배지에 10% FBS, 2 mM 글루타민, 항생제 - 항균류 용액(100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 0.25 μg/mL 암포테리신 B), 0.33 mM 리놀레이트, 0.17 mM 팔미테이트, 0.17 mM 올레이트를 보충합니다.
  2. 대조군 지방세포 배양 배양액을 준비하세요: DMEM/F12 배지에 10% FBS, 2 mM 글루타민, 항생제 - 항진균제 용액(100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 0.25 μg/mL 암포테리신 B), 0.44% 소 혈청 알부민(BSA), 0.26% 에탄올(후자의 두 화합물은 FA 용매로도 사용됨)을 보충합니다.
    참고: 직접 사용에 필요한 양의 FA 지방세포 배양 배지를 대조군과 보충제로 준비하세요. 오랜 기간 보관하지 말고, 항상 갓 준비된 매체를 사용하세요. 사용 전에 매체를 물욕에서 37°C까지 데우세요.
  3. 총 14일간의 분화 후, 96웰 플레이트에서 분화된 지방세포에서 DM 배지 전체를 조심스럽게 제거하여 폐기합니다.
  4. 세포가 96웰 플레이트에서 배양된 웰의 절반에 FA를 첨가한 지방세포 배양 배양지 100 μL/웰을 조심스럽게 추가합니다.
  5. 웰의 후반부에 100 μL/웰의 대조군 지방세포 배양지를 조심스럽게 추가하고, 세포는 96웰 플레이트에서 배양됩니다.
    참고: 배지를 교체할 때 세포가 마르지 않도록 하세요.
  6. 세포를 37°C에서 5%CO2 가 포함된 습윤 환경에서 48시간 동안 배양합니다.
  7. 48시간 후에는 대조 세포와 FA와 함께 배양한 세포를 사용해 후속 실험을 진행합니다.
    참고: 이 단계에서 지방화된 지방 세포는 세포 염색, 세포 대사 분석, 또는 다른 세포 유형과의 공동 배양 등 다양한 실험 목적으로 사용할 수 있습니다.

4. 지질 방울 얼룩

  1. 지방세포 배양 배양지를 준비하세요: DMEM/F12 배양지에 10% FBS, 2 mM 글루타민, 항생제 - 항진균 용액(100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 0.25 μg/mL 암포테리신 B)을 보충합니다.
  2. 형광 염료를 희석하여 지방세포 배양 배지에서 LD를 1:1000 희석으로 염색합니다.
  3. 96웰 플레이트에서 자라는 세포에서 추출한 FA를 보충한 대조군 지방세포 배양지와 지방세포 배양 배양지의 전체 부피를 제거하여 폐기하세요.
  4. 형광 염료가 포함된 지방세포 배양 배지 50 μL/웰을 조심스럽게 추가하세요.
    참고: 배지를 교체할 때 세포가 마르지 않도록 하세요.
  5. 세포를 5%CO2 가 포함된 습기 환경에서 37°C에서 15분간 배양합니다.
  6. 형광 염료는 100 μL/웰 지방세포 배양 배지로 교체하여 세척합니다.
  7. 형광 현미경으로 녹색 형광 검출 채널(예: 427 nm/Em 585 nm)에서 이미지 획득.
    참고: 이것이 생체 세포 염색 프로토콜입니다. 세포에 포름알데히드 고정 후에도 염색이 시행될 수 있습니다.

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결과

여기서 설명하는 방법은 인간 ADSC를 성숙한 지방세포로 분화시키고, 이후 지질 축적이 증가하여 비만 상태에서 관찰되는 비대 세포를 모방할 수 있게 합니다. 인간 ADSC의 분화의 시간 경과는 그림 1에 나와 있습니다. 0일째에 세포가 100% 합류할 때(그림 1A), ADSC는 길쭉하고 방추 모양의 형태를 보입니다. 이 시점에서는 DM을 포함한 지방생성 유도제를 사용하여 분화 프로토콜을 적용할 수 있습니다. 24시간 후에는 세포가 형태학적 변화를 겪으며, 작은 LD를 가진 단일 세포가 관찰될 수 있습니다(그림 1B). 7일째에 DM을 신선한 것으로 교체할 때 여러 개의 작은 LD를 가진 세포가 관찰됩니다(그림 1C). 세포 분화 14일째에 7일 후, 여러 ...

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토론

본 프로토콜은 ADSC 분화를 위한 복제 가능한 2단계 절차이며, 이후 FAs와 함께 인큐베이션하여 비만을 모방하는 세포 모델을 달성합니다. 그 효과를 결정하는 중요한 단계는 분리 후 ADSC의 통과 횟수입니다. 여러 번 통과하면 이 세포들의 분화 전위가 감소합니다10.

지방세포 분화 과정에서 ADSC는 분열 세포에서 성장 중단 지방세포로 이동합니다. 전지방세포에서의 성장 정지는 분화 유도의 전제 단계입니다. 100% 합류에서 접촉 억제를 통해 달성할 수 있는 성장 정지 세포에서만 호르몬 요법(인슐린, 인도메타신, 덱사메타손, IBMX)이 지방세포 분화를 유도합니다. IBMX는 덱사메타손과 병용하여 지방 생성의 핵심 조절자인 PPARγ(과산화좀 증식물질 활성화 수용체 감마)의 발현을 자극합니다.

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공개 사항

저자들은 본 논문에서 보도된 연구에 영향을 미칠 수 있는 알려진 경쟁 재정적 이해관계나 개인적 관계가 없다고 선언한다.

감사의 글

이 논문은 폴란드 국립과학센터의 지원을 받아 도로타 노박(OPUS 22, No. 2021/43/B/NZ3/01458)과 알렉산드라 시미치예프(SONATA, 2020/39/D/NZ5/02330)가 지원금을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
3-이소부틸-1-메틸잔틴 (IBMX)머크I5879
0.25% 트립신/0.05% EDTA, pH 7.2IITD PAN, Wrocfigure-materials-1aw, 폴란드20-500
96웰 플레이트열학130188
항생제-항균류 용액시그마-올드리치A5955
소 혈청 알부민 (BSA)시그마-올드리치A3294
셀 카운터해당 없음해당 없음
원심분리기해당 없음해당 없음
덱사메타손시그마-올드리치D4902
둘벡코의 변형 독수리 미디엄(DMEM)IITD PAN, Wrocfigure-materials-2aw, 폴란드10-5001 g/L 포도당 함유
Dulbecco의 변형 독수리 배지: 영양 혼합물 F12깁코11320-033
에탄올체임푸르113964200#1L
태아 소 혈청(FBS)깁코A5256701
hADSC 인간 지방유래 줄기세포론자PT-5006
인큐베이터해당 없음해당 없음
인도메타신시그마-올드리치I8280-5G
인슐린시그마-올드리치I9278
역현미경해당 없음해당 없음
L-글루타민시그마-올드리치25030-024
리놀레산 나트륨염시그마-올드리치L8134
LipidSpot 형광바이오티움70065
인산염 완충 식염수(PBS)열학10010023
소두임 올레이트시그마-올드리치O7501
소두임 팔미테이트시그마-올드리치P9767
T75 세포 배양 플라스크열학130190
트리판 블루시그마-올드리치95896HJ

참고문헌

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