패혈증 관련 급성 신장 손상(SA-AKI)은 상당한 사망률과 관련이 있습니다. 이 연구는 LPS 유도 HUVECs(시험관 내 SA-AKI)에서 circZBTB46이 하향 조절된 것을 발견합니다. 과발현은 HUVEC 생존성을 높이고, ERBB2/AKT 신호와 관련된 세포자멸사, 염증, 산화 스트레스를 감소시켜 SA-AKI와 관련된 잠재적 치료 표적을 시사합니다.
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연구 논문
패혈증 관련 급성 신장 손상(SA-AKI)은 상당한 사망률과 관련이 있습니다. 이 연구는 LPS 유도 HUVECs(시험관 내 SA-AKI)에서 circZBTB46이 하향 조절된 것을 발견합니다. 과발현은 HUVEC 생존성을 높이고, ERBB2/AKT 신호와 관련된 세포자멸사, 염증, 산화 스트레스를 감소시켜 SA-AKI와 관련된 잠재적 치료 표적을 시사합니다.
원형 RNA는 스트레스 반응의 신흥 조절자로 떠오르고 있지만, 패혈증 관련 급성 신장 손상으로 이어지는 내피 손상에서의 역할은 아직 완전히 정의되지 않았습니다. 우리는 원형 RNA ZBTB46 (circZBTB46)이 ERBB2-AKT 신호를 활성화하여 내피 보호를 제공한다고 가설을 세웠습니다. 인간 탯줄 정맥 내피 세포가 지포다당류로 도전받는 세포 기반 모델을 사용하여 circZBTB46 발현을 정량화하고, 강제 발현이 생존, 세포자멸사, 염증 매개체, 산화환원 항상성에 미치는 영향을 검증하였습니다. 세포 생존 가능성 검사와 유세포 검사를 통해 생존율과 세포자살사를 평가하였습니다. 효소 결합 면역흡착 분석법에서는 인터루킨-6, 종양 괴사 인자 α, 인터루킨-1β가 측정되었으며, 활성 산소종, 말론디알데히드, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제, 카탈라아제는 산화 손상 및 항산화 능력의 지표로 평가되었습니다. 기전을 정의하기 위해 전사체 프로파일링을 수행하고 유전자 집합 풍부도 분석을 수행하고, 웨스턴 블롯팅을 통해 경로 단백질을 확인했으며, ERBB2 억제제 AG-825를 사용해 필요성을 평가하였습니다. 지포다당류가 억제된 circZBTB46. CircZBTB46 과발현은 생존력을 높이고, 세포자멸사를 감소시키며, 염증성 사이토카인 및 활성 산소종을 감소시키고, 말론디알데히드를 감소시키며, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 및 카탈라아제 활성을 증가시켰습니다. 전사체 및 단백질 분석은 ERBB2-AKT 축의 활성화를 지지했으며, 약리학적 ERBB2 차단은 세포보호 효과를 둔화시키고 산화환원 균형의 증가를 역전시켰습니다. 이 발견들은 circZBTB46 이 ERBB2-AKT 신호를 통해 지다당류에 의한 내피 손상을 억제하는 내인성 제약 역할을 하며, circZBTB46 을 패혈증 관련 급성 신장 손상의 기전적 결절이자 잠재적 치료 표적으로 지명합니다.
패혈증은 병원성 침범에 의해 시작되는 생명을 위협하는 전신 염증 연쇄 반응으로, 종종 다기관 부전으로 절정에 이르는경우가 많습니다 1. 이러한 중요한 맥락에서 SA-AKI는 중환자실에서 주요하고 임상적으로 중요한 합병증으로 부각합니다. 전신 감염과 함께 신장 여과 능력이 급격히 저하되는 것이 특징이며, 임상 코호트2에서 비패혈성 AKI보다 38%-42% 높은 사망률을 보입니다. 패혈증 또는 패혈성 쇼크 진단을 받은 환자의 약 60%가 SA-AKI3로 발병할 것으로 예상됩니다. 따라서 SA-AKI는 중환자실에서 주요 도전 과제가 되어 이환율과 사망률에 크게 기여하고 있습니다. 현재 SA-AKI의 기전은 완전히 밝혀지지 않았습니다. 전임상 연구에서는 미세순환 기능 장애, 세포 대사 변화, 레닌-안지오텐신-알도스테론계(RAAS) 내 불균형, 미토콘드리아 기능 장애, 염증 조절 이상이 포함되었으나, SA-AKI의 병태생리학적 기전은 여전히 밝혀지지 않았으며, 조기 진단과 지속적인 관리를 지원할 최적의 조치가 현재 부족합니다
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이 프로토콜은 circZBTB46 조절이 HUVEC에서 염증 신호, 산화 스트레스, ERBB2-AKT 경로 활성화에 미치는 영향을 조사하는 데 사용되는 실험적 절차를 설명합니다.
세포 배양
이 연구에 사용된 HUVECs 셀은 상업용 공급원에서 얻었습니다. HUVEC는 광범위한 이용 가능성, 재현 가능한 배양 조건, 높은 형질전환 효율 덕분에 염증 스트레스 하에서 유전적 조작과 내피 신호 전달 경로의 기전적 연구를 용이하게 하여 대표적인 내피 세포 모델로 사용되었습니다15,16. HUVEC는 10% (v/v) 태아 소 혈청과 1% 농도의 항생제-항균제 혼합 요법을 보충한 DMEM에서 배양하였다. 모든 세포 배양은 표준 생리학적 조건 하에 가습 챔버(37 °C, 5%CO2)에서 유지되었으며, 이는 지속적인 세포 증식을 촉진하면서도 >95% 생존율을 유지하였으며, 이는 트리판 블루 배제 검사로 확인되었습니다. 장기 HUVEC 유지에는 일반적으로 내피 특이적 배지(예: EGM-2 또는 M199와 내피 성장 보충제를 ....
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시험관 내 SA-AKI 모델에서 circZBTB46 발현의 qRT-PCR 분석
이 실험들은 circZBTB46 발현이 LPS 자극 하에서 변화하고, circZBTB46 조절이 내피세포 생존력과 세포자멸사에 영향을 미친다는 가설을 시험 관 내 SA-AKI 모델에서 검증하기 위해 수행되었습니다. 초기에는 circZBTB46 발현을 대조군 조건과 시험관 내 SA-AKI 시스템에서 조사하였다. 그림 1A에 나타난 것처럼, LPS 처리된 HUVEC에서 circZBTB46 발현은 처리되지 않은 대조군에 비해 현저히 감소했습니다. 이 결과는 LP.......
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패혈증 동안 병원체가 방출하는 LPS와 같은 병원체 관련 분자 패턴(PAMPs)이 Toll 유사 수용체(예: TLR4)를 활성화하여 전신 염증 반응을 시작한다26. 이 과정은 TNF-α, IL-6, IL-1β 등 여러 염증성 매개체의 분비를 촉진하여 사이토카인 폭풍27을 일으킵니다. 동시에 LPS는 혈관 내피 세포를 직접 손상시켜 미세순환 장애, 혈관 투과성 증가, 혈전증을 유발하여 궁극적으로 신혈류를 저해합니다27. 또한, LPS에 의해 유발된 산화 스트레스는 과도한 ROS를 발생시켜 신장 세뇨관 상피 및 내피 세포를 추가적으로 손상시키고, 미토콘드리아 의존 경로를 통해 세포 세포자멸사를 촉진합니다. 이 과정들은 모두 관성 기능 장애, 사구체 여과율 감소, 궁극적으로 급성 신장 손상을 초래합니다
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저자들은 상충하는 이해관계가 없다고 선언한다. 저자들은 이 원고에 제시된 주요 결과가 이전에 출판된 적이 없으며 다른 곳에서 출판 검토 중이 없다고 선언합니다.
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| AG-825 (ErbB2 억제제) | 메드켐익스프레스 | HY-10197 | 10 & 뮤; M은 경로 차단을 의미합니다 |
| 애질런트 2100 바이오분석기 | 애질런트 | G2939BA | RNA 무결성 (RIN≥ 7) |
| AKT 항체 | 단백질 기술 | 60203-2-Ig | WB (1:15000) |
| 부속 V-APC/PI 세포자퇴증 키트 | 일러브사이언스 | E-CK-A327 | 세포자멸증 검출 |
| 항생제-항균류 | 깁코 | 15240062 | 1% 농도 |
| BCA 단백질 정량 키트 | 비요타임 | P0012 | 단백질 농도 |
| 캣 엘리사 키트 | 메이미안 | MM-0897H2 | 항산화 효소 |
| CCK-8 키트 | 도진도 | CK04 | 세포 생존성 검사 |
| CircRNA 시퀀스 | 푸저우 화롱커후이 바이오테크놀로지 유한회사. | PE150 | CircRNA 시퀀싱 및 관련 생물정보학 분석 |
| CytoFLEX 유량 세포계 | 벡먼 쿨터 | B53000 | 세포자멸증 분석 |
| DMEM | 깁코 (인비트로젠) | 11965092 | 세포 배양 배지 |
| ECL 기질 키트 | 밀리포어 | WBKLS0100 | 단백질 검출 |
| ERBB2 항체 | 시노 바이오컬 | 100271-T32 | WB (1:10000) |
| 태아 소 혈청 (FBS) | 생물학적 산업 | 04-001-1ACS | 10% (v/v) 보조제 |
| GAPDH 항체 | 단백질 기술 | 60004-1-Ig | WB (1:50000) |
| HUVEC | 프로셀 시스템 | CP-H082 | 세포주의 출처 |
| IL-1&베타; 엘리사 키트 | 메이미안 | MM-0181H2 | 염증 인자 |
| IL-6 ELISA 키트 | 메이미안 | MM-0049H2 | 염증 인자 |
| 일루미나 노바세쿼터 6000 | 일루미나 | 20012850 | RNA 시퀀싱 |
| 리포펙타민 3000 | 인비트로젠 | L3000008 | 트랜스펙션 시약 |
| LPS (대장균 O111:B4) | 시그마-올드리치 | L2630 | 10 & 뮤; SA-AKI 모델의 g/mL |
| MDA ELISA 키트 | 메이미안 | MM-2037H2 | 산화 스트레스 지표 |
| 나노드롭 2000 | 써모피셔 | ND-2000 | RNA 정량 |
| NEBNext 울트라 II RNA 라이브러리 키트 | NEB | E7770S | RNA-seq 라이브러리 준비 |
| OE-circZBTB46 플라스미드 | 젠스크립트 | 커스텀 합성 | circZBTB46 과발현 벡터 |
| OE-NC 플라스미드 | 젠스크립트 | 커스텀 합성 | 음성 통제 벡터 |
| p-AKT (Ser473) 항체 | 단백질 기술 | 66444-1-Ig | WB (1:1200) |
| PrimeScript RT 시약 키트 | 타카라 | RR047A | cDNA 합성 |
| PVDF 멤브레인 | 밀리포어 | IPVH00010 | 서부 블롯 전이 |
| QuantStudio 5 시스템 | 써모피셔 | A28137 | 실시간 PCR |
| 리보뉴클레아제 R | 루시겐 | RNR07250 | rRNA 제거 |
| RIPA 용해 버퍼 | 비요타임 | P0013B | 단백질 추출 |
| RNAiso 플러스 | 타카라 | 9109 | 총 RNA 추출 |
| 소드 엘리사 키트 | 메이미안 | MM-25469H2 | 항산화 효소 |
| TB 그린 프리믹스 엑스 타크 | 타카라 | RR420A | qPCR 시약 |
| TNF-&α; 엘리사 키트 | 메이미안 | MM-0122H2 | 염증 인자 |
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