방법 논문

시험 관 내 세포 신장 및 영상 촬영을 위한 새로운 플랫폼

407 조회수

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DOI:

10.3791/69779

⸱

2026년 3월 10일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, Northeastern University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기서는 등방성 및 단축 변형 파형을 세포에 적용하면서 조절 가능한 강성과 맞춤형 단백질 매트릭스를 가진 기질에서 배양을 지원하는 새로운 장치를 소개합니다. 이 간단하고 경제적인 플랫폼 덕분에 연구자들은 기초 연구와 질병 관련 맥락에서 기계적 단서가 세포 기능을 어떻게 조절하는지 조사할 수 있습니다.

초록

세포는 세포 운명 결정, 세포 간 소통, 발달 등 세포 내 기질 강성 변화와 주기적 변형과 같은 환경의 기계적 신호에 반응합니다. 이러한 힘의 변화는 천식, 고혈압, 암과 같은 질환의 진행에 기여하거나 촉진합니다. 기존의 시험관 내 신장 장치는 단축 또는 등방성 변형을 가할 수 있지만, 종종 비생리적 강성을 사용하거나 실시간 영상 촬영을 제한하거나 생리적 및 병리학적 조건에 적합한 높은 변형 진폭을 달성하지 못합니다. 여기서는 엘라스토머 배양 접시의 부착 세포에 제어된 등방성 또는 단축 변형을 가하는 소형 현미경 호환 스트레처 장치를 소개합니다. 이 접시들은 조정 가능한 영스 모듈러스를 특징으로 하며, 세포 접착을 위한 다양한 매트릭스 단백질 코팅과 호환되어 기질 강성과 ECM 조성을 독립적으로 조절할 수 있습니다. 특히, 이 장치의 조작 용이성은 스테퍼 모터 구동 설계 덕분에 프로그래머블 사이클 파형 생성이 가능하다는 점입니다. 기계적 신장 하에 1차 기도 평활근 세포에서 세포 내 칼슘 역학과 세포 견인력을 정량화하여 장치의 능력을 입증합니다. 이 플랫폼은 건강한 상황과 질병 관련 맥락 모두에서 기계적 신호가 세포 기능에 미치는 영향을 조사할 수 있는 다목적 도구를 제공합니다.

서론

세포는 주변 환경으로부터 기계적 힘을 경험하며, 이는 세포 운명 1,2, 세포 간 통신 3,4,건강한 성장 등 세포 기능의 여러 측면을 조절하는 데 중요한 역할을 합니다. 또한, 이러한 기계적 힘의 변화는 세포외기질(ECM) 재형성6과 종양 성장 7,8,9,10을 포함하여 질병 진행과 질병 발병을 증가시킬 수 있습니다. 세포는 ECM4의 강성 변화뿐만 아니라 심장, 폐, 근육과 같은 장기의 주기적 긴장 변화를 포함해 이러한 기계적 신호를 감지하고 반응할 수있습니다. 시험관 내 연구는 ECM의 강성과 조성이 휴식 시와 수축성 작용제 노출 후 세포 골격의 강성에 영향을 미칠 수 있음을 보여주었다13. 수많은 시험관 내 및 현장 연구에서 일시적, 정적, 주기적 균주가 세포와 조직에 미치는 영향을 조사했으며, 반응은 균주 유형, 속도, 진폭에 따라 달라진다는 것을 보여주었다. 예를 들어, 최근 연구들은 일시적 스트레칭이 가해진 변형에 비례하여 부착 세포의 강성을 감소시키며, 지속적인 긴장 증가는 처음에 급격히 강성이 증가한 후 점진적인 이완으로 이어진다는 것을 발견했습니다. 또한, 힘 생성의 주요 분자 조절 요인인 칼슘 신호는 신장 및 기타 기계적 힘(4,16,17,18,19,20)에 의해 영향을 받습니다. 강성과 변형이 기계생물학적 경로에 미치는 영향을 연구하려면 세포 반응을 모니터링하면서 두 요인을 조절해야 합니다. 따라서 우리는 등방성 또는 단축 신장을 유도할 수 있는 새로운 현미경 호환 세포 스트레처를 개발했으며, 기질 강성, 기질 단백질 코팅, 다양한 프로그래밍 가능한 파형을 독립적으로 제어할 수 있습니다.

과거에도 연구자들은 세포 배양과 조직에 특정 동작과 기계적 신장을 가하는 장치를 유사한 방식으로 만들었습니다21,22. 가장 단순한 경우인 단축 운동은 단일 차원에 가해진 기계적 신장입니다. 예를 들어, 일부 장치는 조직 스트립23과 콜라겐 섬유24에 기계적 신장과 긴장을 가하거나, 세포 방향을 정렬하여 세포 이동을 유도하는 장치들이 개발되었습니다. 등방성 신장은 모든 방향에서 젤이나 기판에 동일한 힘을 가하여 재료 전체에 균일한 변형을 일으키는 일종의 신장 방식을 의미합니다. 이 스트레칭은 폐의 폐포와 같은 특정 생리학적 환경에서 세포가 호흡 과정에서 방사각으로 팽창과 수축을 겪는 고르게 분포하는 힘을 시뮬레이션합니다26,27.

기존의 스트레처 장치는 기계생물학 관련 연구에 사용되는 데 제약이 있는 여러 한계가 있습니다. 많은 설계는 기계적 변형을 견디고세포 배양 배지의 무게를 지지하기 위해 일반적인 생리학적 범위를 초과하는 기질 강성 값을 사용합니다. 그러나 이러한 비생리적 강성의 사용은 세포 행동에도 영향을 줄 수 있어, 모델이 자연 조직 환경에 미치는 중요성을 제한할 수 있다29. 또한 일부 스트레처 설계는 대물렌즈나 빛 경로를 가려 영상 촬영을 방해하며, 다른 설계는 명확한 관찰을 위해 너무 두꺼운 막을 사용합니다28. 스트레처가 현미경과 호환되고 얇은 기질을 사용하더라도 막 처짐이나 초점 손실 같은 문제가 흔합니다. Flexcell과 같은 상업용 플랫폼은 진공 기반 변형을 이용해 유연한 막을 늘립니다. 이 방법은 안정적이고 균일한 변형장을 생성할 수 있지만, 생세포 현미경에는 최적화되어 있지 않으며, 현미경 호환 구성은 고가의 추가 액세서리가 필요합니다. 또한, 이 플랫폼들은 최대 21.8%의 변형을 달성할 수 있는 반면, 깊은 흡입 방식은 30%를 초과하는 균주를 생성할 수 있으며, 천식과COPD 같은 질환에서는 더 높은 균주가 관찰됩니다.

따라서 우리는 기판 강성과 ECM 조성을 정밀하게 제어할 수 있는 새로운 세포 신장 장치를 설계했으며, 부착 세포에 가변 등방성 및 단축 변형을 적용할 수 있게 하였습니다. 이 플랫폼은 생리학적으로 중요한 강성을 가진 기판을 이용한 기계적 자극 중 실시간 영상이 필요한 기계생물학적 질문을 연구하는 연구자들에게 적합합니다. 이 장치는 2차원 호버만 구의 기하학에서 영감을 받은 기계적으로 구동되는 방식을 사용하며, 가위 모양의 관절을 통해 팽창하고 수축합니다(그림 1, 보조 그림 1). 단일 스테퍼 모터가 16개의 방사형 암을 링크 메커니즘을 통해 구동하며, 8개의 부착 포스트를 조화롭게 팽창 및 수축시킵니다. 이 구성은 모든 기둥에 동일한 반경 변위를 동시에 가하여 균일한 평면 내 변형을 생성합니다. 이 장치의 독특한 설계와 컴팩트한 크기는 인플레인 등방성 및 단축 신장 시 역형 형광 현미경으로 생세포 영상을 가능하게 하며, 상업용 대안의 일부만큼의 비용으로 가능합니다. 선형 스테퍼 모터는 맞춤형 아두이노 코드로 제어되어 주기와 진폭을 조절할 수 있는 프로그래밍 가능한 순환 파형을 가능하게 합니다. 본 연구에서는 이 장치가 1% 미만에서 15%까지 정밀하고 재현 가능한 변형을 전달하며, 기하학적 용량이 200%를 초과함을 입증했습니다. 또한, 기계적 신장이 세포 내 칼슘 역학과 인간 기도 평활근 세포의 세포 견인력에 미치는 영향을 정량화합니다.

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프로토콜

본 연구에 사용된 1차 인간 기도 평활근 세포(ASMC)는 버지니아 ATCC(ATCC)에서 수집했으며, 기증자 정보는 NIH 지침에 따라 식별 해제되었습니다. 이 연구는 실험 전에 노스이스턴 대학교 생명안전 위원회의 승인을 받았습니다.

참고: 장치 제작 및 장치 치수에 관한 지침은 GitHub 저장소에서 이용 가능한 CAD 파일을 참조하시기 바랍니다: https://github.com/Breathe-Lab/A-Novel-Platform-for-In-Vitro-Cellular-Stretching-and-Imaging.

1. 3D 프린팅 금형 설계

  1. 등방성 몰드 치수
    1. 몰드의 외경은 37mm입니다.
    2. 몰드의 외부 높이는 4.1mm입니다.
    3. 외벽 두께는 2.1mm입니다.
    4. 몰드의 기본 두께는 2mm입니다.
    5. 부착 구멍은 가장자리에서 2mm 떨어진 곳에 위치해 있습니다.
    6. 내부 세포 배양 구역의 지름은 20mm, 깊이는 1.9mm입니다.
      참고: 완성된 PDMS 몰드의 세포 배양 면적 두께는 200 μm이어야 합니다.
  2. 단축 몰드 치수
    1. 금형의 외부 치수는 41 mm x 12 mm x 4 mm (L x W x H)입니다.
    2. 부착 구멍은 너비 가장자리에서 3mm, 길이 가장자리에서 4mm이며, 기둥 깊이는 1mm입니다.
    3. 외벽 두께는 너비 가장자리 1.5mm, 길이 가장자리 2mm입니다.
    4. 내부 세포 배양 우정의 크기는 26 mm x 5.5 mm x 1 mm (L x W x H)입니다.
    5. 바닥 두께는 2mm입니다.
      참고: 몰드는 SolidWorks에서 설계되었고, FormLabs의 액체 회색 수지 시스템을 사용해 3D 프린팅되었으며, 노스이스턴 대학교 메이커스페이스에서 제작되었습니다.
  3. 몰드 초기 사용 지침만
    1. 몰드 프린트의 거친 가장자리를 사포질하세요.
    2. 네거티브 몰드에 투명 매니큐어를 발라서 경화 후 PDMS 몰드를 쉽게 제거할 수 있도록 하세요. 곰드를 24시간 동안 자연 건조시키세요.

2. 세포 배양을 위한 광학 투명 탄성 젤 제작, 기판 강성을 조절하는

참고: PDMS와 NuSil을 다룰 때는 적절한 개인 보호 장비(장갑, 실험복, 안경 보호구)를 착용하세요.

  1. 실가드 184 베이스와 경화제를 무게 대비 10:1 비율로 플라스틱 접시에 넣으세요.
  2. 혀압박기(또는 비슷한 도구)와 함께 2-3분간 격렬하게 섞으세요.
  3. 혼합물을 1시간 동안 배출하세요.
  4. PDMS 혼합물을 맞춤형 네거티브 몰드(그림 2A,B)에 부어줍니다.
    1. 등방성 몰드에 1.3g을 추가하세요.
    2. 단축 몰드에 0.5g을 추가하세요.
      참고: 젤을 몰드 전체에 고르게 펴 바르도록 주의하세요.
  5. 몰드를 1시간 동안 제기하세요.
  6. 몰드 안의 젤이 실온에서 평평한 표면에 2시간 동안 가라앉도록 두세요.
  7. 하룻밤 60°C에서 경화.
  8. NuSil Gel-8100의 A와 B 부분을 1:1 비율로 15분 동안 섞어 놓습니다.
    1. 전체 부피의 0.36%에 Sylgard 184 가교재와 혼합하여 13 kPa 32의 강성을 가진 기판을 만듭니다.
    2. 가교제를 첨가하지 않으면 0.3 kPa의 강성을 가진 기질을 만들 수 있습니다.
  9. 혼합물을 30분간 제가스하세요.
  10. 맞춤 몰드에서 PDMS 젤을 조심스럽게 제거하세요. 젤을 40mm 커버슬립에 올려놓으세요.
    참고: 젤은 깨지기 쉬우니 찢지 않도록 주의하세요.
  11. NuSil 혼합물을 PDMS 겔의 음수 부위에 부어줍니다.
    1. 등방성 겔: 100 μL.
    2. 단축 젤: 50 μL.
  12. 스핀 코터를 사용해 7 x g 에서 50초간 NuSil 혼합물을 해당 PDMS 젤에 코팅하여 100 μm의 균일한 기판 두께를 얻습니다.
  13. 젤을 실온에서 평평한 표면에 2시간 동안 가라앉힌 후 60°C에서 하룻밤 경화시킵니다.
    참고: 모든 경화 과정은 평평한 표면에서 수행되도록 주의하세요. 불균일한 젤은 관심 영역 전체가 현미경의 이미징 평면에 남아 있지 않게 만듭니다. 영상에서 시야 전반에 걸쳐 초점 변화가 나타나면, 젤이 평평하지 않은 표면에서 경화되었을 수 있으므로 다시 만들어야 합니다.
  14. 완성된 세포 배양 배양 접시는 사용 전까지 덮개가 있는 페트리 접시에 보관하세요(그림 2D-E).

3. 매트릭스 단백질 코팅

  1. 각 기질에 500 μL poly-L-라이신(PLL, 500 μg/mL)을 첨가합니다.
  2. 실온에서 1시간 정도 배양하세요.
  3. 3× 바닥재에 1 mL PBS를 사용하고, 이어서 10 mM HEPES 완충제(pH 8.0)를 1 mL로 3× 세척합니다.
  4. 각 기판에 500 μL mPEG-SVA(50 mg/mL)를 첨가합니다.
  5. 실온에서 1시간 정도 배양하세요.
  6. 3× 바닥재에 1mL PBS를 세척합니다.
  7. PBS를 500 μL PLPP(14.5 mg/mL)로 대체하세요.
  8. PRIMO 마이크로패터닝 시스템과 레오나르도 소프트웨어를 사용하여, 미리 정의된 패턴을 자외선으로 기판 표면에 30초간 투사합니다.
  9. 기질을 3× 동안 1mL PBS로 세척한 후 UV 아래에 15분간 두어 멸균합니다.
  10. 각 기판에 0.1% 플루오레세인 결합 젤라틴 500 μL를 첨가합니다.
  11. 실온에서 1시간 정도 배양하세요.
  12. 3×을 1mL PBS로 세척하세요.
    참고: 패턴을 시각화하기 위해 0.1% 형광 결합 젤라틴과 상온에서 1시간 동안 인큐베이션하세요.
  13. 영상 촬영을 진행하세요.

4. 탄성 접시에서의 인간 기도 평활근 세포 배양

참고: 모든 세포 배양 절차는 표준 무균 기법을 사용하여 생물안전 후드에서 수행하십시오.

  1. 버지니아주 ATCC에서 인간 기도 평활근 1차 세포(ASMC)를 확보하고, NIH 지침에 따라 기증자 정보가 식별 해제되도록 하세요. 실험 전에 기관 생물안전 위원회의 승인을 확인하세요.
  2. 천식/질병 병력이 없는 세 명의 건강한 인간 기증자(성별과 연령대)의 세포를 사용하세요. 예시: 여성 1명(18세)과 남성 2명(34세, 59세).
  3. 표준 조건(37 °C, 5% CO₂)에서 세포를 배양하고, 모든 실험에서 6번째 통과 세포까지 사용합니다.
  4. 다음 완전한 배양지에서 세포를 배양합니다:
    1. DMEM/F12 (500 mL)
    2. 10% 태아 소 혈청(FBS) (50 mL)
    3. 페니실린/스트렙토마이신 1× (5 mL)
    4. 1× MEM 비필수 아미노산 (5 mL)
    5. 암포테리신 B (0.5 mL)
  5. 측정 최소 24시간 전에는 세포를 혈청 없는 배지로 전환하세요. 혈청 없는 배지를 다음 재료로 준비하세요:
    1. 햄의 F-12 미디엄 (500 mL)
    2. 페니실린/스트렙토마이신 1× (5 mL)
    3. 암포테리신 B (50 μg/L)
    4. 1× MEM 비필수 아미노산 (5 mL)
  6. 신축성 세포 배양 접시를 15분간 UV 소독하세요.
  7. 멸균된 접시를 0.1% 젤라틴과 함께 실온에서 1시간 배양한 후 씨앗을 뿌립니다(그림 2F).
    1. 패턴 기판의 경우:
      1. 탄성 세포 배양 내 씨앗 세포는 104 cells/cm 2의 밀도로 우웰을 형성합니다.
      2. 패턴 부위에 부착을 촉진하기 위해 10% 혈청 배지에 10분간 배양하세요.
      3. 우물에 PBS를 세척해 부착되지 않은 세포를 제거하세요.
      4. 웰에 10% 혈청 배지를 채우고 24시간 배양하세요.
      5. 혈청 무첨가 배지로 교체하고 24시간 배양한 후 측정하세요.
    2. 무늬가 없는 기질의 경우:
      1. 원하는 밀도의 씨앗 세포: 분리된 세포의 경우 102 cells/cm2. 103 셀/cm, 희소 세포2. 104셀/cm, 2 합류 셀.
      2. 10% 혈청 배지에 24시간 배양하세요.
      3. 혈청 무첨가 배지로 교체하고 24시간 배양한 후 측정하세요.

5. 형광 칼슘 영상 및 분석

  1. 24시간 동안 혈청 부족 기도 ASMC를 사용하세요.
  2. 제조사 지침에 따라 FLIPR Ca2+ 6 염료를 준비하세요.
  3. FLIPR Ca+ 6 염료를 세럼 프리 매체와 1:1 비율로 섞으세요.
  4. 세포를 37°C, 5% CO₂에서 FLIPR Ca ²⁺ 용액으로 2시간 배양합니다.

6. 영상 설정

  1. 다음 기능을 갖춘 라이카 DMi8 역현미경을 사용하세요:
    1. 라이카 DFC6000 카메라
    2. 라이카 LED8 라이트 엔진
    3. 5×/0.12 건조 대물
  2. 여기 거리를 480/40 nm, 방출 거리를 527/50 nm로 설정하세요.
  3. 스트레치 실험 중 2Hz 프레임 속도로 16비트 이미지를 획득할 수 있습니다.

7. 데이터 분석

  1. 이미지 시퀀스를 Fiji (ImageJ) 33으로 가져오기.
  2. 각 세포의 세포질에서 관심 영역(ROI)을 수동으로 정의하세요.
  3. 각 ROI의 평균 회색 강도 값을 시간에 따라 추출합니다.
  4. 형광 강도 데이터를 맞춤형 MATLAB 스크립트로 처리합니다.
    참고: 형광 강도는 세포질 [Ca2+]에 비례합니다.

8. 견인력 측정 및 분석

참고: 영상 분석, 견인력 현미경, 운동 제어를 포함한 모든 코드는 저희 GitHub 저장소에서 확인할 수 있습니다: https://github.com/Breathe-Lab/A-Novel-Platform-for-In-Vitro-Cellular-Stretching-and-Imaging

  1. PDMS-NuSil 겔 기판에 형광 구슬 층을 코팅하여 견인력 현미경의 기준 마커로 활용합니다.
  2. 1 μm 직경의 적색 형광 카복실레이트 변형 미세구를 0.025% 용액으로 HBSS에서 1:4000 비율로 희석하여 준비합니다.
  3. 10초 동안 비드 해법인 소용돌이.
  4. 젤에 구슬 용액을 넣으세요.
    1. 등방성 겔에 880 μL.
    2. 420 μL에서 단축 젤.
  5. 구슬이 달라붙도록 실온에서 1시간 배양하세요.
  6. 1시간 후에 용액을 조심스럽게 제거하세요.
    참고: 구슬 용액을 부드러운 젤에 부드럽게 부으세요. 부적절한 제거는 비즈 분포를 방해합니다.
  7. 남은 용액은 면봉이나 킴와이프로 부드럽게 닦아내세요.
  8. 10x/0.32 드라이 대물렌즈가 장착된 라이카 DMi8 현미경으로 비즈를 상상해 보세요.
  9. 스트레칭 전 상태에서 이미지를 촬영하고, 스트레칭 프로토콜 내내 지속적으로 촬영하세요.
    참고: 모든 영상은 변형 균일성이 가장 높은 기질 중심부에서 수행하십시오. 필요하다면 이미지를 촬영하기 전에 현미경을 늘어난 위치에서 다시 초점을 맞추세요.
  10. 푸리에 견인력 현미경을 기반으로 한 맞춤형 MATLAB 코드를 사용해 이미지를 분석하여 변위 벡터와 해당 평면 변형장을 계산합니다.
  11. N개의 임상시험 평균으로 데이터를 표현합니다.

9. 셀 신장 장치의 보정

  1. 웰에 500 μL H₂O를 추가하여 세포 배지 무게를 시뮬레이션하고 단백질 패턴을 촉촉하게 유지합니다.
  2. 특정 단백질 패턴 생성에 관한 프로토콜은 3절 "기질 단백질 코팅"을 참조하십시오.
  3. 영상 형광 패턴은 모터 변위 400 μm 단계마다 나타나며, 최대 2800 μm까지 증가한 후 역방향 400 μm 단위로 다시 0으로 돌아갑니다.
  4. 스테퍼 모터에서의 선형 변위와 신축성 세포 배양 접시의 등방성 변형 사이의 관계를 거시적 및 지역적 규모에서 특성화하여, 신축성 기판에 'BREATHE'라는 형광 단백질 패턴 문자의 면적과 편심도 변화를 측정하여 특성화합니다. 모든 글자를 포함하는 직사각형 경계 상자를 사용해 단어 전체의 면적과 이심도를 계산하세요.
  5. MATLAB에서 이미지 분할을 적용하여 각 개별 글자에 대해 이러한 매개변수를 정량화합니다.
  6. 세포 배양 접시의 늘어나지 않은 치수로 제로 변위를 정의합니다.
  7. 재현성을 보장하기 위해 두세 개의 독립적으로 준비된 확장 가능한 세포 배양 웰에서 각 실험을 반복합니다.

10. 데이터 제시 및 통계 검정

  1. 스트레처 교정 실험의 경우, 시험을 사이클 수로 정의합니다.
  2. 각 시도를 하나의 곡선으로 합치지 않고 개별적으로 보여주어 시스템 반복성을 입증하세요.
  3. 오차 바를 표준편차로 표시하세요.
  4. 한 가지 독립적인 요인에 의해 영향을 받은 세 개 이상의 그룹이 있는 데이터셋에서 유의미한 차이를 검정하기 위해 일원 ANOVA를 사용하세요.
  5. 2자 ANOVA를 사용한 후 사후 쌍별 비교를 통해 두 독립적인 요인에 의해 영향을 받은 데이터셋 간 유의한 차이를 검정합니다.
  6. 데이터가 정규분포일 때 쌍별 비교에 t-검정을 적용하세요.
  7. 데이터가 정규분포가 아닌 경우 Mann-Whitney 랭크 합 검정을 적용하여 중간값을 비교하세요.
  8. 사용한 구체적인 검사, 샘플 수, 해당 P-값, 그리고 결과를 보고하세요.
  9. 데이터셋 간 통계적으로 유의미한 차이를 판단하기 위해 P-값 임계값 0.05를 사용하세요.
  10. SigmaStat에서 통계 검정을 수행하세요.
  11. 그래프 도표는 GraphPad 프리즈와 MATLAB에 포함되어 있습니다.

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결과

세포 스트레처는 국소적인 변형을 반영하는 거시적 면적 변화를 유도합니다. 등방성 거동을 평가하기 위해, 우리는 등방성 기판에서 신축성 세포 배양 웰에서 "BREATHE"라는 단어를 형성하는 형광 젤라틴 단백질 패턴의 면적 변화와 개별 글자들을 측정했습니다. 결과는 단어와 개별 글자 모두 면적에서 동등한 변화를 보임을 보여주었습니다(그림 3A,B). 그림 3B에서 파란색 원과 오차 막대는 400 μm 단위의 변위로 측정된 일곱 글자의 면적의 평균 및 표준편차를 나타냅니다. 주황색 사각형은 기질이 늘어나고 해제될 때 "BREATHE"라는 단어의 전체 면적을 개별 측정한 값에 해당합니다. 측정 영역(문자 대 단어)과 선형 변위를 독립적인 요인으로 한 2자 ANOVA에서는 두 영역...

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토론

이 프로토콜에서는 등방성 및 단축 변형을 모방하면서 동시에 생세포를 이미징할 수 있는 새로운 현미경 호환 세포 스트레처의 설계, 개발, 검증 및 구현을 설명합니다. 이 장치는 컴팩트하며 라이카 DMi8 현미경 스테이지에 장착할 수 있으며, 모든 움직이는 부품을 단일 평면에 가두어 라이브 이미징을 가능하게 하면서 기판과 그 아래 세포에 초점을 유지할 수 있습니다. 이는 2차원 호버만 구체의 기하학에서 영감을 받은 각도 있는 팔을 활용해 이루어졌습니다. 이 2D 구성은 운동을 단일 평면으로 제한하여 생세포 영상 시 현미경 초점을 유지하는 데 필수적입니다. 이 기하학적 구조는 큰 변형을 가능하게 하며, 회전 운동을 선형 운동으로 간단히 변환할 수 있게 합니다. 8개의 포스트가 중앙에 배치되어 장치가 적용할 수 있는 기계적 변형 유형에 유연성을 제공합니다. 8개의 기둥 모두 대칭적으로 움직이지만, 특정 기둥을 기질에 선택적으로 연결하면 같은 플랫폼이 등방성 및 단축 변형을 전...

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공개 사항

저자들 중 누구도 상반되는 이해관계를 선언할 필요가 없습니다.

감사의 글

저자들은 몰드 제작에 도움을 준 노아 조셉 씨에게 감사를 표합니다. 저자들은 보스턴 대학교 과학기기 시설의 헤이토르 무라토와 글렌 테이어에게 기계 가공에 도움을 준 데 감사를 표합니다. 이 연구는 하리크리슈난 파라메스와란에게 수여된 국립과학재단(NSF) 경력보조금 #2047207의 지원을 받았습니다. H.P.가 이 연구를 구상했습니다. S.E.S.와 S.R.P.가 장치의 전체 설계를 개발했고, S.E.S.와 H.P.가 등방성 실험을 설계했습니다. S.E.S.는 등방성 몰드 실험을 수행하고, 실험 데이터를 분석했으며 결과를 해석했으며, V.C.는 단축 몰드를 설계하고 젤 준비와 비딩을 최적화했습니다. B.M.G는 단축 젤 실험을 수행하고, 실험 데이터를 분석했으며, H.P.와 V.C.와 함께 결과를 해석했습니다. S.E.S.와 B.M.G는 수치를 준비했습니다. B.M.G, S.E.S, V.C., H.P가 원고 초안 작성과 편집에 기여했다. H.P.는 원고의 최종 버전을 승인했다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
그리고 nbsp; 둘벡코 수정된 독수리' s 미디엄/F12피셔 사이언티브12634010500 mL  
(4-벤조일벤질) 트리메틸암모늄 클로라이드 (PLPP)알브&아쿠테; 올레해당 없음14.5mg/mL
0.1% 플루오레세인 결합 젤라틴 인비트로젠G13187
0.1% 젤라틴 용액시그마-올드리치ES-006500 mL  
1 & mu; 직경 m 적색 형광 카복실레이트 변형 미세구플루오스피어F8816
1× MEM 비필수 아미노산 용액시그마-올드리치M7145100 mL
1× 페니실린/스트렙토마이신피셔 사이언티브15-140-122100 mL
10% 태아 소 혈청열과학A5256701500 mL  
15 mL 튜브피셔 사이언티브14-959-53A
글루타민 1회 및 nbsp;피셔 사이언티브MT10010CM
인슐린-트랜스페린-셀레늄 성장 보충제 1회코닝 생명과학25-800-CR
암포테리신 B시그마-올드리치A294225 & mu; g/liter
볼 베어링맥마스터-카르  해당 없음
염화칼슘 이하이드레이트시그마-올드리치223506
캐리지 레일맥마스터-카르  해당 없음
FLIPR Ca2+ 6분자 장치R8190
그래프패드 프리즘닷매틱스해당 없음
햄' s F-12 중형 및 nbsp;시그마-올드리치N8641500 mL  
행크스의 밸런스 소금 솔루션 열과학14025092500 mL  
HEPES 버퍼 열과학15630080100 mL
레오나르도 소프트웨어알브&아쿠테; 올레해당 없음
Matlab수학 작품해당 없음
메톡시 폴리에틸렌 글리콜 & ndash; 석시니미딜 발레레이트 (mPEG-SVA)레이산 바이오 주식회사해당 없음50mg/mL
누실 겔-8100Nusil 해당 없음
페트리 접시열과학26399190mm 
인산 완충 식염수 시그마-올드리치10010023500 mL  
폴리-L-라이신 (PLL)시그마-올드리치P8920500μ g/mL
인간 기도 평활근 세포 및 nbsp;ATCCPCS-130-011
PRIMO 광학 모듈 알브&아쿠테; 올레해당 없음
나사맥마스터-카르  해당 없음
시그마스타트Systat 소프트웨어해당 없음
스핀 코팅기로렐모델 WS-650MZ-23NPPB
들것 및 스테이지 부착 부품  보스턴 대학교 과학 기기 시설해당 없음스테인리스 스틸
실가드 184 기본 엘라스토머 및 경화제 키트다우H047J8Q026
T-25 조직 배양 플라스크 - 벤트 캡, 멸균셀트리트229331
혀 눌림근 열과학22-363-154

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