여기서는 등방성 및 단축 변형 파형을 세포에 적용하면서 조절 가능한 강성과 맞춤형 단백질 매트릭스를 가진 기질에서 배양을 지원하는 새로운 장치를 소개합니다. 이 간단하고 경제적인 플랫폼 덕분에 연구자들은 기초 연구와 질병 관련 맥락에서 기계적 단서가 세포 기능을 어떻게 조절하는지 조사할 수 있습니다.
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방법 논문
시험 관 내 세포 신장 및 영상 촬영을 위한 새로운 플랫폼
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
세포는 세포 운명 결정, 세포 간 소통, 발달 등 세포 내 기질 강성 변화와 주기적 변형과 같은 환경의 기계적 신호에 반응합니다. 이러한 힘의 변화는 천식, 고혈압, 암과 같은 질환의 진행에 기여하거나 촉진합니다. 기존의 시험관 내 신장 장치는 단축 또는 등방성 변형을 가할 수 있지만, 종종 비생리적 강성을 사용하거나 실시간 영상 촬영을 제한하거나 생리적 및 병리학적 조건에 적합한 높은 변형 진폭을 달성하지 못합니다. 여기서는 엘라스토머 배양 접시의 부착 세포에 제어된 등방성 또는 단축 변형을 가하는 소형 현미경 호환 스트레처 장치를 소개합니다. 이 접시들은 조정 가능한 영스 모듈러스를 특징으로 하며, 세포 접착을 위한 다양한 매트릭스 단백질 코팅과 호환되어 기질 강성과 ECM 조성을 독립적으로 조절할 수 있습니다. 특히, 이 장치의 조작 용이성은 스테퍼 모터 구동 설계 덕분에 프로그래머블 사이클 파형 생성이 가능하다는 점입니다. 기계적 신장 하에 1차 기도 평활근 세포에서 세포 내 칼슘 역학과 세포 견인력을 정량화하여 장치의 능력을 입증합니다. 이 플랫폼은 건강한 상황과 질병 관련 맥락 모두에서 기계적 신호가 세포 기능에 미치는 영향을 조사할 수 있는 다목적 도구를 제공합니다.
서론
세포는 주변 환경으로부터 기계적 힘을 경험하며, 이는 세포 운명 1,2, 세포 간 통신 3,4,건강한 성장 등 세포 기능의 여러 측면을 조절하는 데 중요한 역할을 합니다. 또한, 이러한 기계적 힘의 변화는 세포외기질(ECM) 재형성6과 종양 성장 7,8,9,10을 포함하여 질병 진행....
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프로토콜
본 연구에 사용된 1차 인간 기도 평활근 세포(ASMC)는 버지니아 ATCC(ATCC)에서 수집했으며, 기증자 정보는 NIH 지침에 따라 식별 해제되었습니다. 이 연구는 실험 전에 노스이스턴 대학교 생명안전 위원회의 승인을 받았습니다.
참고: 장치 제작 및 장치 치수에 관한 지침은 GitHub 저장소에서 이용 가능한 CAD 파일을 참조하시기 바랍니다: https://github.com/Breathe-Lab/A-Novel-Platform-for-In-Vitro-Cellular-Stretching-and-Imaging.
1. 3D 프린팅 금형 설계
- 등방성 몰드 치수
- 몰드의 외경은 37mm입니다.
- 몰드의 외부 높이는 4.1mm입니다.
- 외벽 두께는 2.1mm입니다.
- 몰드의 기본 두께는 2mm입니다.
- 부착 구멍은 가장자리에서 2mm 떨어진 곳에 위치해 있습니다.
- 내부 세포 배양 구역의 지름은 20mm, 깊이는 1.9mm입니다.
참고: 완성된 PDMS 몰드의 세포 배양 면적 두께는 200 μ....
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결과
세포 스트레처는 국소적인 변형을 반영하는 거시적 면적 변화를 유도합니다. 등방성 거동을 평가하기 위해, 우리는 등방성 기판에서 신축성 세포 배양 웰에서 "BREATHE"라는 단어를 형성하는 형광 젤라틴 단백질 패턴의 면적 변화와 개별 글자들을 측정했습니다. 결과는 단어와 개별 글자 모두 면적에서 동등한 변화를 보임을 보여주었습니다(그림 3A,B). 그림 3B에서 파란색 원과 오차 막대는 400 μm 단위의 변위로 측정된 일곱 글자의 면적의 평균 및 표준편차를 나타냅니다. 주황색 사각형은 기질이 늘어나고 해제될 때 "BREATHE"라는 단어의 전체 면적을 개별 측정한 값에 해당합니다. 측정 영역(문자 대 단어)과 선형 변위를 독립적인 요인으로 한 2자 ANOVA에서는 두 영역.......
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토론
이 프로토콜에서는 등방성 및 단축 변형을 모방하면서 동시에 생세포를 이미징할 수 있는 새로운 현미경 호환 세포 스트레처의 설계, 개발, 검증 및 구현을 설명합니다. 이 장치는 컴팩트하며 라이카 DMi8 현미경 스테이지에 장착할 수 있으며, 모든 움직이는 부품을 단일 평면에 가두어 라이브 이미징을 가능하게 하면서 기판과 그 아래 세포에 초점을 유지할 수 있습니다. 이는 2차원 호버만 구체의 기하학에서 영감을 받은 각도 있는 팔을 활용해 이루어졌습니다. 이 2D 구성은 운동을 단일 평면으로 제한하여 생세포 영상 시 현미경 초점을 유지하는 데 필수적입니다. 이 기하학적 구조는 큰 변형을 가능하게 하며, 회전 운동을 선형 운동으로 간단히 변환할 수 있게 합니다. 8개의 포스트가 중앙에 배치되어 장치가 적용할 수 있는 기계적 변형 유형에 유연성을 제공합니다. 8개의 기둥 모두 대칭적으로 움직이지만, 특정 기둥을 기질에 선택적으로 연결하면 같은 플랫폼이 등방성 및 단축 변형을 전.......
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공개 사항
저자들 중 누구도 상반되는 이해관계를 선언할 필요가 없습니다.
감사의 글
저자들은 몰드 제작에 도움을 준 노아 조셉 씨에게 감사를 표합니다. 저자들은 보스턴 대학교 과학기기 시설의 헤이토르 무라토와 글렌 테이어에게 기계 가공에 도움을 준 데 감사를 표합니다. 이 연구는 하리크리슈난 파라메스와란에게 수여된 국립과학재단(NSF) 경력보조금 #2047207의 지원을 받았습니다. H.P.가 이 연구를 구상했습니다. S.E.S.와 S.R.P.가 장치의 전체 설계를 개발했고, S.E.S.와 H.P.가 등방성 실험을 설계했습니다. S.E.S.는 등방성 몰드 실험을 수행하고, 실험 데이터를 분석했으며 결과를 해석했으며, V.C.는 단축 몰드를 설계하고 젤 준비와 비딩을 최적화했습니다. B.M.G는 단축 젤 실험을 수행하고, 실험 데이터를 분석했으며, H.P.와 V.C.와 함께 결과를 해석했습니다. S.E.S.와 B.M.G는 수치를 준비했습니다. B.M.G, S.E.S, V.C., H.P가 원고 초안 작성과 편집에 기여했다. H.P.는 원고의 최종 버전을 승인했다.
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| 0.1% 젤라틴 용액 | 시그마-올드리치 | ES-006 | 500 mL |
| 1 & mu; 직경 m 적색 형광 카복실레이트 변형 미세구 | 플루오스피어 | F8816 | |
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참고문헌
- Alvarez, Y., Smutny, M. Emerging role of mechanical forces in cell fate acquisition. Front Cell Dev Biol. 10, 864522(2022).
- Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nat Rev Mol Cell Biol.....
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