우리는 온도 구배 블록을 소개하고 그 구성 및 활용법을 자세히 설명합니다. 이 블록은 사용자가 정의한 0에서 90 °C 범위 사이에 선형적으로 분포된 22가지 개별 온도를 제공합니다. 이 환경에서 수집된 데이터는 토양 유기물 분해 속도의 온도 반응에 관한 새로운 이론을 검증하고 개발하는 데 도움을 줍니다.
이 논문에서
요약
초록
토양은 지구에서 가장 큰 탄소(C) 저장소로, 대기보다 거의 두 배에 달하는 양의 C를 저장하고 있습니다. 기후 변화로 인한 온도 상승은 토양 유기물(SOM) 분해를 촉진하여 이산화탄소(CO2)를 대기 중에 방출할 수 있으며, 이는 기후 변화에 긍정적인 피드백을 가져올 수 있습니다. 이로 인해 SOM 분해 속도가 단기 온도 변화에 어떻게 반응하는지 어떻게 정의할 수 있을까 하는 질문이 제기됩니다. 이 데이터를 활용해 기후 예측을 위한 지구 시스템 모델에 기계적으로 정의된 방정식을 적합시킬 수 있을까요? 지금까지 대부분의 연구는 다양한 이산 온도에서의 실험실 토양 인큐베이션에 초점을 맞추고 있습니다. 그러나 이는 고분자 속도 이론(MMRT)과 같은 최신 발전에 의해 제기된 새로운 가설을 검증하는 데 필요한 상세한 온도 반응 곡선으로 이어지지 않습니다. 본 논문에서는 이전 연구에서 수정 및 개선된 온도 구배 블록을 소개하고, 그 구성 과정을 상세히 설명하며, 활용에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 온도 구배 블록은 알루미늄 블록으로, 4열에 22개의 개별 구멍이 있어 88개의 마이크로코스마스(60mL 바이알)를 동시에 배양할 수 있습니다. 블록은 한쪽 끝에서 냉각되고 다른 쪽 끝에서 가열되어 선형 온도 분포를 만듭니다. 0에서 90°C 범위 내에서 사용자 정의 범위 내에서 22개의 개별 온도 지점을 제공합니다. 3.5시간 배양 후에는 88개의 미시우주 각각에서CO2 생성량을 측정합니다. 결과는 이 블록이 사용자 정의 온도 구배를 생성하고 SOM 분해의 온도 응답 곡선 구성을 용이하게 한다는 것을 보여줍니다. 또한, 이 환경에서 수집된 데이터는 온도 변화가 SOM 분해 속도에 미치는 영향에 관한 새로운 가설과 이론을 검증하고 개발하는 데 활용될 수 있으며, 이는 기후 변화 맥락에서 점점 더 중요해지는 영역입니다.
서론
대기 중 이산화탄소(CO2) 농도가 증가하면 지구1의 온도가 높아집니다. 이 현상은 1856년 유니스 푸트2에 의해 처음 보고되었으며, 그녀는 단순하지만 획기적인 실험을 수행했습니다. 한 실린더에는 주변 공기를, 다른 한 실린더에는CO2 를 채우고 두 실린더의 온도를 기록했습니다. 결과는 명확했습니다:CO2 농도가 높은 실린더는 더 높은 온도를 보였으며, 이는 대기 중CO21 증가의 온열 효과를 입증했습니다. 이 관찰은 기후 변화에 중요한 시사점을 가집니다. 오늘날 푸트의 초기 통찰은 현대 기후 과학에 계속 영향을 미치며,CO2 농도 상승이 지구 온난화와 다양한 생태계에 미치는 영향을 연구하는 데 기여하고 있습니다.
토양은 첫 번째 미터 내에서 대기 중보다 거의 두 배에 달하는 탄소(C)를 저장하며, 전 지구 C 사이클3에서 중요한 역할을 합니다. 토양 C 재고에 영향을 미치는 주요 과정 중 하나는 토양 유기물(SOM) 분해로, 이는 C가 대기로 다시 방출되는 속도를 결정합니다 4,5. 기후 변화에 의해 촉발되는 연평균 기온의 상승은 토양 유기물(SOM) 분해를 자극하여CO2의 대기 배출을 가속화할 잠재력을 가지고 있습니다 6,7. 이는 특히 기온이 광합성 탄소 입력보다 SOM 분해를 통한 탄소 손실을 더 가속화할 때 기후 변화에 대한 양의 피드백 메커니즘을 나타냅니다. 광범위한 연구에도 불구하고, 이른바 토지-탄소-기후 피드백의 규모와 방향은 여전히 널리 논쟁 중입니다8, 9, 10, 11. 이러한 불확실성은 주로 SOM 분해 속도의 온도 반응에 관한 근본적인 지식 공백에서 비롯됩니다. 이러한 공백을 해결하는 것은 지구 시스템 모델을 정교하게 다듬고 SOM 분해 속도의 온도 반응을 이론적으로 근거 있게 표현하는 데 필수적입니다.
SOM 분해 속도의 온도 반응은 일반적으로 Q10 값과 아레니우스 방정식으로 표현됩니다. Q10 값은 온도가 10 °C까지 상승할 때 속도에 곱하는 계수로 정의됩니다. 12, 13, 14, 15의 타당성에 대한 도전에도 불구하고, Q10은 다양한 처리와 토양의 온도 반응을 비교하는 기본 접근법이 되었습니다. 아레니우스 이론은 온도16이 상승할수록 SOM 분해와 같은 공정 속도가 지수적으로 증가함을 제안한다. 그러나 실제 효소 활성은 뚜렷한 열 최적(thermal maximum al)을 가진 단일 양식 형태를 따르며, 높은 온도(17, 18, 19)에서는 감소하는 경향이 있습니다. 아레니우스 기반 방정식은 열 최적6을 넘어서는 효소 변성을 제안하여 이 감소를 설명하려 시도합니다. 그러나 효소 변성은 토양에서 흔히 발견되는 온도보다 더 높은 온도에서 일어나므로, 효소가 변성이 일어나기 전에 열적 최적에 도달함을 나타냅니다19,20. 더불어, 변성에 의한 호흡율 붕괴를 아레니우스 방정식에 단순히 두 번째 함수로 추가하는 것은 호흡 변화율이 최대가 되는 변곡점 온도(21,22)를 추정할 수 없습니다. 따라서 아레니우스 기반 방정식은 토양에서 일반적으로 관찰되는 온도 범위 내에서 SOM 분해 속도의 전체 온도 반응 형태를 완전히 포착하지 못한다14,23.
아레니우스 이론의 한계를 해결하기 위해 생물학적 과정의 온도 민감도를 나타내는 여러 방정식이 개발되었습니다; 그러나 생물학 이론에 근거하거나 토양에 적용된 연구는 드물다 24,25. 생물학적 기반 접근법 중에서, 고분자 속도 이론(MMRT)은 효소26과 같은 생물학적 고분자의 열역학적 특성을 통합함으로써 아레니우스 방정식의 일부 한계를 극복합니다. 마찬가지로, 효소 보조 아레니우스 이론(EAAR)은 효소가 반응의 활성화 에너지를 낮추는 데 있어 온도 의존적 역할을 설명한다. 두 방정식은 토양과 미생물의 생화학적 반응 온도 반응 연구에 성공적으로 적용되었습니다 17,24,27,28. 이 방정식들은 SOM 분해의 온도 반응과 기저 반응 단계에 대한 귀중한 메커니즘적 통찰을 제공합니다. 그러나 이러한 개념의 광범위한 채택과 매개변수화는 종종 실험적 도전 과제로 인해 방해받습니다.
현장 및 실험실 연구 모두 SOM 분해 속도의 온도 반응을 이해하는 데 장단점이 있습니다. 현장 실험은 SOM 분해 속도의 장기 온도 반응에 대한 귀중한 통찰을 제공합니다. 그러나 현장에서CO2 플럭스 측정을 해석하는 것은 자가영양 호흡, 습도 변동성, 기질 접근성 29,30,31,32,33과 같은 교란 변수 때문에 어려울 수 있습니다. 이러한 상호작용은 실제 과정을 정량화하는 데 필수적이지만, 이러한 연구는 일반적으로 단기적 메커니즘 과정의 측정보다는 장기적인 생태계 반응에 초점을 맞추고 있습니다. 단기 온도 반응을 이해하는 것은 MMRT와 EAAR와 같은 최근 이론에 의해 정의된 방정식을 매개변수화하는 데 매우 중요하며, 이를 위해서는 실험실 연구가 핵심입니다. 많은 실험실 연구는 일반적으로 배양 시간과 온도 처리에 따라 증가하는 기질 고갈의 혼란 효과를 겪는다 34,35,36. 또한 대부분의 실험실 실험은37, 38, 39, 40 같은 몇 가지 온도 처리만 사용하여, 더 많은 이산 온도에서 측정하는 속도를 요구하는 더 고급 방정식 대신 간단한 지수 방정식을 적합하거나 Q10 비율을 계산하는 경우가많습니다.. 이러한 문제를 해결하기 위해서는 더 넓은 온도 범위에서 SOM 분해 속도를 정확하게 측정할 수 있는 새로운 실험적 접근법을 개발하여 온도 반응과 관련된 SOM 분해 이론의 엄격한 검증과 개발을 지원하는 것이 매우 중요합니다.
이 논문에서는 온도 구배 블록의 구성 및 활용을 설명하는데, 이는 현재의 실험적 한계를 해결할 뿐만 아니라 SOM 분해가 온도에 미치는 단기 반응을 입증하는 최첨단 연구도 제공합니다. 여기 제시된 설계는 Thomas 등(1963)42가 처음 개발하고 이후 Robinson 등(2017)41에 의해 수정된 방법론을 변형한 것입니다. 주요 차이점으로는 1) 냉각 시스템의 개선, 2) 블록을CO2 분석기에 연결해CO2 농도를 직접 측정함으로써 작동 시간 단축, 3) 실험 중 바이알 운반 필요성 없애는 점이 있습니다. 이전 보고서 21,41,43은 온도 블록에 대한 광범위한 설명을 제공했지만, 상세한 설계, 제작 방법, 시험은 최소한으로 이루어져 다른 연구자들이 이 방식을 활용하는 데 한계가 있었습니다. 여기서는 설계와 시공에 대한 완전한 세부 사항을 제공하며, 다양한 토양 샘플에 맞는 설치 기능성을 보여주기 위한 여러 시험 결과를 제시합니다.
프로토콜
여기서는 온도 구배 블록의 상세한 구조와 심층적인 활용법을 소개합니다. 모든 재료와 해당 사양은 보충 표 1 과 재료 표에서 확인할 수 있습니다. 온도 구배 블록의 건설 및 조립 비용은 가스 분석기 비용을 제외한 약 €20,000이었습니다. 이 온도 구배 블록은 유니스 푸트의 이름을 따서 '유니스'라고 불렸습니다.
1. 온도 구배 블록의 구성
- 온도 구배 블록의 본체 설계는 그림 1 을 참조하십시오.
- 알루미늄 블록 제작
- 원시 알루미늄 블록을 범용 밀링 머신에 위치시키고 고정하세요. 각 구멍의 측정값과 위치를 기계 소프트웨어에 입력하세요. 그림 2 는 각 구멍의 위치와 직경을 지정합니다.
- 가열봉을 위한 구멍을 뚫으세요. 블록 한쪽 끝에 직경 16mm, 깊이 133mm의 구멍을 두 개 뚫습니다. 이 구멍들은 중앙이 상단 가장자리에서 25mm, 측면 가장자리에서 36.25mm 떨어지도록 위치시키세요(그림 2).
- 냉각제를 위한 캐슬 패턴을 만드세요. 블록의 반대편 끝에는 180mm 길이에 걸쳐 성 패턴을 드릴링합니다(그림 3A). 성 패턴의 두께가 16mm, 깊이가 140mm인지 확인하세요. 성 패턴 내에 직경 10mm, 깊이 140mm의 추가 구멍 12개를 뚫습니다. 이 구멍들의 정확한 위치와 분포는 그림 3B 를 참조하십시오.
참고: 캐슬 패턴은 냉각제와 블록의 접촉을 높이기 위해 만들어졌으며, 12개의 구멍은 넘침을 방지하는 역할을 합니다. - 캐슬 패턴에 맞는 가스켓을 만드세요. 냉각제를 블록 안에 감싼 알루미늄 가스켓을 잘라서 캐슬 패턴 위에 올려놓으세요. 이는 냉각제의 누출을 방지하기 위해 사용됩니다.
- 쿨러 연결부를 위해 구멍을 뚫으세요. 블록의 앞면과 뒷면에 쿨러 연결을 위해 직경 15mm의 구멍을 뚫습니다(그림 4). 구멍 중앙을 75mm 깊이로 위치시키세요. 앞쪽 구멍이 가장자리에서 18mm 떨어져 있고, 뒷면 구멍이 가장자리에서 162mm 떨어져 있는지 확인하세요. 이 두 구멍이 성 패턴의 시작과 끝을 연결하는지 확인하세요.
- 온도 센서용 구멍을 뚫으세요. 직경 3mm, 깊이 150mm의 구멍 8개를 뚫습니다. 이 센서들은 블록 중앙에 위치하며 길이를 따라 고르게 분포되어 있습니다. 첫 번째 센서 구멍의 중심이 가장자리에서 940mm, 마지막 센서 구멍이 가장자리에서 205mm가 되도록 하세요.
- 60mL 바이알을 위한 구멍을 뚫으세요. 직경 28mm, 높이 144mm의 88개의 구멍을 만드세요. 이 구멍들은 블록 전체에 고르게 분포되어 있습니다. 첫 번째와 마지막 바이알 구멍의 중심은 첫 번째와 마지막 센서 구멍의 중심과 정렬됩니다.
- 단열 준비
참고: 단열 재료는 두께 40mm의 폴리이소시아누레이트로 만들어졌습니다.- 원형톱을 사용해 단열 재료를 135° 각도로 사다리꼴 모양으로 자릅니다. 알루미늄 블록의 네 긴 면을 덮기 위해 단열 재료를 1080mm x 230mm 크기의 직사각형으로 잘라냅니다. 이 직사각형의 네 변을 각각 135° 각도로 잘라서 블록에 딱 맞게 맞춥니다. 이 중 한 쪽은 블록 뚜껑에 붙일 예정입니다. 블록 뚜껑의 단열 재료를 보호하기 위해 알루미늄 테이프를 사용하세요.
- 블록의 두 짧은 면에 대해 단열재를 230mm x 230mm 크기의 정사각형으로 잘라내세요. 다시 한 번, 정사각형의 각 면을 135° 각도로 잘라서 적절한 맞춤을 확보하세요.
- 냉각 시스템 연결 (그림 5)
참고: 이 구성에 사용된 냉각 시스템은 컴팩트하고 에너지 효율적입니다. 이 냉각 시스템은 최대 -30 °C까지 냉각 용량을 가진 자연 냉각제를 순환시켜 작동합니다.- 무릎 커플링과 호스 바브를 블록에 부착하세요(그림 5C). 그 다음, 냉각제를 쿨러로 전달하는 호스를 연결하세요.
- 호스를 유연한 단열재로 덮어 호스 전체를 덮으세요. 이렇게 하면 냉각제가 원하는 온도에 머무를 수 있습니다. 유연한 단열재를 잘라서 호스에 단단히 맞춘 뒤, 접착제 실란트로 단열재를 고정하세요.
- 히팅 로드와 센서를 블록에 삽입하여 적합한지 확인하세요(그림 5D).
- 위에서 설명한 단계에 대한 개요는 그림 5 를 참조하십시오.
그림 1: 차체 설계와 온도 구배 블록의 일부. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
그림 2: 여러 용도에 사용되는 구멍의 위치와 직경을 표시한 온도 구배 블록. "S"는 센서를 의미합니다. 치수는 밀리미터(mm) 단위입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
그림 3: 냉각제에 사용되는 캐슬 패턴의 설계 및 측정. (A) 캐슬 패턴의 두께, 길이, 직경 측정, 그리고 (B) 넘침을 방지하기 위해 사용된 12개의 구멍의 거리와 위치. 치수는 밀리미터(mm) 단위입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
그림 4: 각 구멍의 깊이와 냉각기 연결 위치를 나타내는 온도 구배 블록의 측면 모습. "S"는 센서를 의미합니다. 치수는 밀리미터(mm) 단위입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
그림 5: 온도 구배 블록의 구조 개요. (A) 60mL 바이알 설치를 위한 구멍 뚫기; (B) 알루미늄 블록을 덮는 절연재를 제작하는 것; (C) 냉각제의 연결 및 인클로저; (D) 가열봉과 센서를 블록에 삽입하는 것. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
2. 스테인리스 하우징 제작.
- 긴 면을 위해 스테인리스 스틸을 잘라내고, 크기는 1080mm x 230mm x 230mm입니다. 짧은 면은 스테인리스 스틸을 230mm x 230mm 크기로 절단하세요. 냉각 호스, 센서, 히팅 로드, 손잡이 구멍을 꼭 뚫으세요.
참고: 긴 면들 중 하나는 블록의 뚜껑으로 사용됩니다. - 손잡이, 뚜껑 경첩, 스테인리스 하우징에 닫는 부분을 열로 연결하세요.
3. 전자 장치 건설
참고: 전자 장치는 자격을 갖춘 전기기사만이 제작할 수 있습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 네덜란드 및 EU 법률에 따라 개발되었습니다. 아래는 사용되는 주요 부품에 대한 간략한 개요입니다; 자세한 배선 지침은 보충 파일 1에 제공되어 있습니다.
- 전자 도표를 설계하세요(그림 6).
- 접속함을 설치하세요.
참고: 분속 박스는 외부 물체와 손상으로부터 전기 부품과 연결을 보호하기 위해 설치됩니다.- 세 개의 접속함을 장착 나사를 사용해 스테인리스 하우징에 단단히 고정하세요.
- 케이블 출입 지점을 준비하세요. 메인 접속함에 케이블 글랜드 구멍 여섯 개를 뚫어. 두 개의 작은 박스에는 케이블 글랜드를 위한 구멍 두 개를 뚫으세요. 한 박스에는 양방향 스위치가, 다른 하나는 히터 로드 케이블 연결부를 보관합니다.
참고: 2방향 스위치는 유닛을 켜고 끄는 데 사용되며, 미니 차단기에 전원을 공급합니다. - 메인 접속함에는 상단에 녹색 LED를 위한 구멍 하나를 뚫으세요.
참고: 이 LED 불빛은 기기가 켜져 있고 모든 부품에 전원이 공급될 때 표시됩니다. - DIN 레일을 잘라서 메인 접속함에 끼우세요. 그 다음, DIN 레일을 고정할 나사를 고정할 구멍 세 개를 표시하세요. DIN 레일을 메인 접속함에 장착하세요.
참고: DIN 레일은 전기 부품 장착을 용이하게 하는 데 사용됩니다. 가능하면 메인 접속함 대략 중앙에 배치하세요.
- 전기 부품 설치.
참고: 그림 7 을 참고하여 각 전기 부품을 설치하세요.- 2방향 스위치의 접속함을 찾아보세요. 스위치의 윗부분을 분리해서 커버 플레이트를 통과해야 할 부분을 찾아보세요. 스위치 접속함 덮개 판에 구멍을 뚫고 구멍을 뚫으면, 스위치가 덮개 판에 딱 맞게 고정되어야 합니다. 스위치 장착 설명서를 사용하세요.
- 메인 접속 박스에 PE/GND 단자를 DIN 레일에 배치하세요. 그 다음 미니어처 차단기(MCB)를 DIN 레일 위에 올려놓습니다.
참고: PE/GND 단자는 끝 상단으로 사용됩니다. MCB는 소형 차단기이며, 고장이나 단전 시 주요 안전 차단기 역할을 합니다. MCB가 켜져 있으면 AC/DC 전원 공급 장치에 전원을 공급합니다. - DIN 레일에 두 개의 트리플 피드스루 단자를 설치하세요. 두 개의 단자 이중 브리지 단자를 사용해 피드스루 단자의 상단과 하단에서 연결합니다.
참고: 두 개 이상의 전선을 연결할 때는 피드스루 단자를 사용하고, 여러 피드스루 단자를 연결하는 데는 브리지를 사용하세요. 페룰 커넥터를 사용하여 안전하고 신뢰할 수 있는 연결을 보장합니다. - 사진처럼 DC 전원 공급 장치를 DIN 레일 위에 올려놓으세요.
참고: 이 연구는 24V, 2.5A AC/DC 전원 공급 장치를 사용했습니다. 이 장치는 교류 전력을 사용해 다른 부품들의 입력 전력 요구량을 위해 24VDC로 변환합니다. - 사진처럼 온도조절기를 DIN 레일에 올려놓으세요. 케이블 연결 모듈( 그림 7의 초록색)을 잃지 않도록 주의하세요.
참고: 온도를 조절하고 모니터링하기 위해 온도조절기를 사용했습니다. 이 시스템은 웹 브라우저 기반 소프트웨어로, 기기의 IP 주소가 로그인되어 가열봉의 온도를 설정하고 데이터를 기록해야 합니다. 이 장비는 로컬 영역 네트워크(LAN)에 연결되어 캠퍼스 내 어떤 컴퓨터에서든 유닛에 연결할 수 있었습니다. - 사진과 같이 DIN 레일에 7개의 트리플 피드스루 단자를 배치하세요. 세 개의 5중형 브리지를 사용해 상단, 중간, 하단 피드스루 단자에서 처음 다섯 개의 피드 스루를 연결합니다.
- 두 개의 5중다리를 사용해 마지막 두 피드 스루를 상단과 하단 피드 스루에서 연결하세요.
- 사진처럼 DIN 레일에 퓨즈 홀더 하나를 설치하세요.
참고: 단락 및 전력 서지 시 유닛 부품 손상을 방지하기 위해 630 mA 퓨즈가 사용되었습니다. - 사진과 같이 DIN 레일에 두 개의 단일 단자 연결 장치를 설치하세요.
- 사진처럼 고체 상태 릴레이를 DIN 레일에 배치하세요.
참고: 고체 상태 릴레이는 가열봉을 켜고 끄는 데 사용됩니다. - PE/GND 단자 하나를 끝 스톱으로 배치하세요.
- 전선 연결 절차에 대해서는 보충 그림 1을 참조하십시오.
- 전자 장치에 대한 개요는 그림 7을 참조하세요.
그림 6: 전자 장치의 도면. 전선 색상은 다음과 같습니다: 갈색 = 전압 교류(VAC) 선, 파란색 = VAC 중성, 초록과 노랑 = GND(접지/접지), 빨강 = 전압 직류(VDC) 양성, 검정색 = VDC 음수. 데이터 와이어는 흰색이지만, 식별을 쉽게 하기 위해 이 그림에서는 녹색으로 표시되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
그림 7: 온도 구배 블록에 연결된 전자 장치의 메인 접속 박스. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
4. 온도 구배 블록 조립
- 단열재를 스테인리스 하우징에 접착하기 위해 접착제 실란트를 사용하세요. 하룻밤 동안 말리세요.
- 센서와 가열봉을 알루미늄 블록 안에 삽입하세요.
- 알루미늄 블록을 스테인리스 하우징 안에 넣고, 케이블을 각자의 구멍을 통해 전자 장치와 연결되도록 안내하세요.
- 경첩을 이용해 단열된 스테인리스 뚜껑을 블록에 부착하세요.
- 냉각 시스템을 알루미늄 블록에 부착하세요.
- 온도 구배 블록을 실험실에 설치하여 모든 연결이 안전하고 정상적으로 작동하는지 확인하세요(그림 8A). 실험실에는 최소 2m 길이의 튼튼한 테이블이 설치되어 있어야 합니다. 이더넷과 전기 연결 연결이 가능한지 확인하세요. 최적의 작동을 위해 통제된 주변 온도가 필요합니다.
5. 플러싱 시스템 건설
참고: 플러싱 라인은 배양 시작 시 각 바이알의CO2 농도를 표준화하도록 설계되었습니다. 온도 구배 블록이 포함된 플러싱 시스템을 시각화하려면 그림 8B 를 참고하세요.
- 직경이 작은 유연한 튜브를 10조각으로 잘라내고, 각 조각은 길이 15cm입니다. 10개의 작은 관 각각의 한쪽 끝에 바늘을 연결하세요.
- 더 큰 직경의 튜브를 길이 1m 크기의 단일 조각으로 잘라냅니다. 이 튜브 한쪽 끝에 마개를 놓고 다른 쪽 끝을 실험실 내 주변 공기 도체에 연결하세요.
- 굵은 관을 길이를 따라 5cm 간격으로 측정하고 표시하세요. 표시된 간격마다 바늘을 작은 관 중 하나에 연결해 넣습니다.
그림 8: 온도 구배 블록. (A) 뚜껑을 닫고 (B) 플러싱 시스템이 전시된 상태로 실험실에 설치된 온도 구배 블록. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
6. 가스 분석기 주입 장치의 설명
참고: 이 구성의 가스 분석기는 60 mL 유리 바이알에서CO2 농도를 직접 측정할 수 있습니다. 이 가스 분석기의 범위는 0 ppm에서 10000 ppm 사이이며, 400 ppm 시 정밀도는 0.04 ppm입니다. 가스 분석기에는 1.17 mL/s 속도로 측정하는 유량 감소 키트가 함께 제공됩니다.
- 가스 분석기의 주입관을 외부 0.45 μm 필터와 주입 바늘을 추가하여 수정합니다(그림 9).
참고: 0.45 μm 필터는 가스 분석기에 물이 들어가지 않도록 추가 예방 조치로 추가되었습니다. 바늘의 크기는 18G이고, 크기는 1.2mm x 25mm입니다. 바늘은 60mL 유리 바이알의 고무 격격 손상을 최소화하기 위해 직경을 기준으로 선택되었습니다. - 가스 분석기의 주입관을 기기의 연결 입구에 연결합니다.
- 주입관 끝에 수컷 루어 락 커넥터를 부착하세요. 내부 직경 1/4의 유연한 튜브를 사용해 루어 락을 주입관에 고정합니다. 그 후 유연한 튜브를 사용해 0.45 μm 필터를 부착하여 모든 부품을 기밀로 고정합니다.
- 0.45 μm 필터의 나사 끝에는 수암 커넥터를 사용해 바늘을 단단히 고정합니다.
그림 9: 가스 분석기 주입 장치. (A) 가스 분석기의 주입관. (B) 외부 0.45 μm 필터와 주입 바늘. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
7. 배양용 처리 설계
- 토양 샘플을 선택하세요.
참고: 이 원고에 선택된 토양 샘플은 프로토콜의 기능을 보여주고, 이 시스템을 통해 수집할 수 있는 데이터 유형을 보여줍니다. - 블록 배양 온도를 선택하며, 사용자가 정의한 0 °C에서 90 °C 사이의 온도 범위입니다.
참고: 이 원고의 온도 범위는 4°C에서 60°C였습니다. 이 범위를 초과할 경우, 고온이나 영하 온도를 다룰 때 실험실 안전 프로토콜을 따르세요. - 표본의 무작위 배정을 계획하세요.
참고: 이 원고에서는 샘플을 온도 블록(위치: A-D 위치) 내에서 무작위로 배분하였습니다. 이 연구는 처음에 인큐베이션 후 표본 판독값을 무작위로 적용했으나, 읽기 과정에서 라벨링 오류가 발생했습니다. 따라서 일관된 측정 순서(즉, 고온에서 저온까지)가 우선시되었습니다.
8. 사전 배양을 위한 샘플 준비
참고: 토양 미생물 군집의 이동을 제한하기 위해, 토양 샘플은 샘플링 후 가능한 한 빨리 신선한 상태로 배양하는 것이 좋습니다. 그러나 실험적 제약과 물류에 따라 토양 샘플은 배양 전에 운송 및 저장을 위해 공기 건조가 필요할 수 있습니다. 이 원고에서는 배양 전 샘플 처리를 위한 자연 건조 절차가 표준화되었습니다.
- 신선한 흙은 2mm 체로 체로 체를 내립니다. 체로 체를 낸 흙을 40°C에서 24시간 건조시킵니다. 이 공기 건조 토양은 추가 가공 때까지 보관할 수 있습니다.
- 토양 샘플을 금속 통에 넣고 충분히 섞으세요. 혼합된 흙을 미리 표시된 60mL 유리 바이알 22개에 분포하세요. 무게 측정지를 사용해 각 60mL 바이알에 3± 0.03g의 흙을 넣습니다.
- 피펫을 사용해 깔때기 방식에 따라 원하는 수분 보유 용량(WHC)으로 토양을 조절합니다. 목표 % WHC로 수분 함량을 조정한 후, 각 바이알의 정확한 무게를 기록하세요.
참고: 이 원고에 선정된 토양 샘플은 60% WHC로 조정되었습니다. - 바이알을 면으로 덮어 주변 공기 교환을 가능하게 하세요.
- 샘플을 20°C의 온도 조절 실험실에서 10일간 사전 배양하세요.
9. 부화 전 단계 조정
- 7일간의 사전 인큐베이션 후 바이알 무게를 기록하고 목표 WHC에 맞게 조정합니다. 피펫을 사용해서 정확히 확인하고 필요에 따라 물을 넣으세요. 각 바이알에 넣을 물을 식 1을 사용해 계산하세요.
물 첨가 = 무게T0 (g) - 무게T7 (g) (1)
여기서 무게T0는 시간 0에서의 바이알 무게를, 무게T7 은 7일 후 바이알의 무게를 나타냅니다.
10. 온도 구배 블록 초기화
참고: 냉각 시스템은 계측기 전면의 패널을 통해 제어됩니다. 난방 시스템은 계측기 뒤의 스위치와 온라인 인터페이스를 통해 제어됩니다.
- 제조사의 지침을 따라 냉각 시스템을 켜세요. 전원 버튼을 한 번 누르세요(항목 A, 보조 그림 2). 온도 °C와 rpm 수치가 깜빡이며 OFF 메시지가 뜨도록 하세요. 이는 시스템이 켜져 있지만 현재 비활성화되어 있음을 나타냅니다.
- 펌프를 작동하려면 OK/펌프 버튼(항목 E, 보조 그림 2)을 누르고 + 또는 - 버튼(항목 G와 F, 보조 그림 2)을 눌러 rpm을 3500으로 설정하세요. 냉각 시스템을 작동시키기 전에 액체 레벨에 녹색 불이 켜져 있는지 확인하세요(항목 L, 보충 그림 2). 유체 레벨이 빨간색이면 냉각제가 충분하지 않다는 뜻입니다. 실험실 관리자에게 연락하거나 제조사 매뉴얼을 참고하세요.
- 냉각 시스템을 활성화하려면 온도 (항목 B, 그림 S2)를 누르고 + 또는 - 버튼(항목 D와 C, 보조 그림 2)을 눌러 온도를 -1.6 °C로 설정하세요. 설정 지점(항목 O, 보조 그림 2)은 깜빡여야 합니다. 이는 냉각 시스템이 아직 설정 지점에 도달하지 않았음을 의미합니다.
참고: 냉각 시스템의 설정 온도는 블록 내부의 온도와 동일하지 않습니다. - 블록 뒤의 스위치를 켜 세요(보조 그림 3). 녹색 불이 켜지는지 확인하세요. 이는 난방 시스템이 켜져 있지만 온도 조절이 활성화되어 있지 않음을 의미합니다.
- 난방 시스템의 온도 제어를 활성화하려면 브라우저에서 IP 주소 10.75.117.227을 입력하여 온도 구배 블록의 온라인 인터페이스를 열어야 합니다. 제공된 사용자 이름과 비밀번호로 로그인하여 각 센서의 온도를 확인하세요(보조 그림 4). 이 인터페이스는 센서 값을 보여주며, 3초마다 업데이트됩니다.
- 상하 화살표를 눌러 설정 난방 온도를 60.00 °C로 조절하세요. ON 버튼을 눌러 난방 시스템을 작동시키세요.
참고: 블록이 안정적인 선형 온도 구배에 도달하는 데 약 한 시간이 걸립니다. - 블록이 켜진 지 10분 후에 히터 제어가 제대로 작동하는지 확인하세요. 각 센서의 온도가 달라질 때 기기가 작동하는 것입니다.
11. 가스 분석기 설치
- 제조사의 설명서에 따라 전원 버튼을 한 번 눌러 가스 분석기를 켜세요. 악기가 예열될 때까지 45분을 기다립니다.
- PC를 가스 분석기의 Wi-Fi 네트워크(고유 호스트명인 TG15-XXXXX)에 연결하고, 비밀번호를 입력해 연결하세요.
- 웹 브라우저에 호스트명이나 IP 주소를 입력한 후 엔터 를 눌러 연결하세요. 그 다음 설정 섹션을 열고 '줄여라'를 선택하세요. 이미 선택된 옵션이라면 소프트웨어에서 아무것도 변경하지 마세요.
12. 샘플 적재 준비
- 부화 시작 1시간 전에 프로토콜 6절에 따라 WHC를 조정하세요.
- 샘플을 블록에 넣기 10분 전에 히터 제어장치를 점검하여 원하는 온도에 도달했는지 확인하세요.
- 실험실에 있는 주변 도체를 켜세요.
- 플러싱 시스템을 연결하고 가스 분석기를 컴퓨터에 연결하세요.
13. 빈칸 수집
- 다음 두 가지 절차를 따라 빈칸을 기록하세요:
- 플러싱 라인을 가스 분석기 주입 시스템에 연결하고, 플러싱 라인의CO2 (ppm 단위)를 직접 기록합니다.
- 빈 홀더에 60mL 유리병 다섯 개를 넣으세요. 각 바이알마다 플러싱 라인 한 줄을 놓으세요. 1분 후에 플러싱 라인을 빼고 병을 뚜껑으로 막으세요. 바이알 안의CO2 수치를 측정하기 전에 4시간 기다려야 합니다.
14. 온도 구배 블록에 샘플 적재
참고: 블록 내에는 A, B, C, D가 위치합니다. 동일한 샘플을 블록 전체에 같은 블록 위치에 배치합니다(그림 10). 예를 들어, 샘플 번호 175는 블록 위치 A에서 1부터 22까지, 샘플 번호 45는 블록 위치 B에 1부터 22까지 배치하는 식입니다.
그림 10: 블록 내부의 바이알 위치. "S"는 센서를 의미합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
- 블록을 열고 컴퓨터와 플러싱 시스템을 블록 뚜껑 위에 올려놓으세요(그림 11). 이동식 테이블 위에 샘플이 든 상자를 놓으세요.
참고: 샘플 내CO2 변동성을 최소화하기 위해 KN95 마스크를 착용하세요. 이로 인해CO2 가 호흡으로 바이알을 오염시키는 것을 방지합니다. - 각 바이알의 닫는 시간(시간: 분)을 기록하는 스프레드시트를 준비하고, 동시에 가스 분석기 시간도 시각화하세요.
참고: 각 바이알의 닫힘 시간은 데이터 처리 중 속도 정규화에 사용됩니다. - 온도 구배 블록에 샘플을 적재하기 시작하세요. 8개 샘플씩 배치로 작업하세요. 캡이 없는 샘플을 쿨러 쪽부터 블록 안에 넣으세요. 즉, 처음 8개의 샘플은 A1, B1, C1, D1, A2, B2, C2, D2입니다.
- 플러싱 라인을 8개의 바이알에 넣고 1분간 기다립니다. 플러싱 라인을 빼고 즉시 바이알을 닫으세요. 스프레드시트에 각 바이알이 뚜껑을 채운 정확한 시간을 기록하세요.
참고: 플러싱 라인을 각 바이알에 조심스럽게 삽입하여 토양과 접촉하지 않도록 하세요. 이로 인해 교차 오염을 방지하고 샘플의 무결성 유지에 도움이 됩니다. - 처음 8개의 바이알이 세척되는 동안, 다음 샘플 배치를 온도 구배 블록에 넣으세요. 예를 들어, 플러싱 샘플은 다음과 같습니다: A1, B1, C1, D1, A2, B2, C2, D2. 다음으로 추가될 샘플은 A3, B3, C3, D3, A4, B4, C4, D4입니다.
- 플러싱 라인을 다음 샘플 배치에 넣으세요.
- 이 과정을 블록이 완전히 적재될 때까지 반복합니다.
- 블록을 닫고 마지막 샘플이 닫힌 순간부터 3.5시간을 기다립니다.
- 가스 분석기를 절전 모드로 설정하세요. 전원 버튼을 3초 이내에 두 번 누르면 됩니다.
- 벽에 있는 빨간 밸브를 사용해 플러싱 시스템을 끄 세요.
그림 11: 부하 온도 구배 블록 설정. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
15.CO2 측정부터
- 일산화탄소2 측정을 시작하기 1시간 전에 전원 버튼을 한 번 눌러 가스 분석기를 절전 모드에서 해제하세요. 8절에 표시된 분석기 설정을 확인하세요.
- 플러싱 시스템을 켜고 가스 분석기를 이동식 테이블 위에 올려놓으세요(그림 12).
참고: 이동식 테이블은 가스 분석기의 주입 시스템이 모든 샘플에 도달할 수 있을 만큼 충분히 높아야 합니다. - 가스 분석기의 진단 섹션을 확인해 보세요(보조 그림 5). 모든 부품의 기기 상태가 녹색인지 확인하세요. 여기서는 두 가지 가능성이 있습니다:
- 모든 것이 초록색이면 분석을 시작하세요.
- 빨간색 또는 노란색 성분이 있다면 가스 분석기 매뉴얼을 확인하고 필요하다면 기술 도움을 요청하세요. 오차가 수정되면CO2 측정을 진행하세요. 오류가 수정되지 않으면 실험을 중단하세요.
- 가스 분석기의 그래프 섹션을 열어 실시간 측정값을 시각화하세요. 기기는 공기 중에서CO2 를 지속적으로 측정하고 있다는 점을 기억하세요.
참고: 측정 표시는 ~3-5초 정도 지연됩니다. - 3.5시간 배양 후 샘플을 측정하기 시작하세요. 우선 더 높은 온도부터 시작해서요. 예를 들어, 가장 먼저 읽어야 할 샘플은 A22, B22, C22, D22입니다.
참고: <15 °C에서 샘플을 측정할 때는 KN95 마스크를 착용하세요. 이렇게 하면 데이터의 노이즈가 줄어듭니다. - 분석기의 주입 니들을 샘플 사이의 플러싱 라인에 연결합니다. 이렇게 하면 데이터 정리가 더 쉬워집니다.
- 화면 상단에는 가스 분석기 소프트웨어의 REMARK 기능이 있습니다. 샘플을 측정할 때마다 유일하고 간단한 주석을 작성하세요. 각 샘플을 실행하기 전에 REMARK를 누르는 것을 잊지 마세요.
참고: REMARK로 고유 번호 또는 샘플의 고유 ID를 사용하세요. REMARK에 오류가 있을 경우, 샘플이 측정된 시간을 기록하세요. 예를 들어, 늦은 주입 기록, REMARK가 조기 종료되었는지 늦게 종료되었는지 등을 기록하세요. - 60 mL 샘플 바이알에 바늘을 20초간 삽입하세요. 이 시간이 지나면 바늘을 바이알에서 꺼내세요.
참고: 바늘이 60mL 바이알 안에 38초 이상 남아 있으면 가스 분석기에 압력 문제가 생깁니다. 가스 분석기가 몇 분간 작동을 멈추다가 압력이 다시 안정될 수 있으니 피하세요. - 가스 분석기로 샘플과 다섯 개의 빈칸을 읽기 위한 다음 단계를 따르세요:
참고: 가스 분석기 온라인 소프트웨어에서 비고를 시작하고 종료하려면 REMARK 버튼을 누르세요.- HH:mm:00에 MARK 시작.
- hh:mm:10에서 바늘을 바이알에 삽입하세요.
- hh:mm:30에 바늘을 바이알에서 빼세요.
- 멈춰 말: hh:mm:45.
- 분석기 주입 바늘에 연결된 0.45 μm 필터를 16시료마다 교체하세요. 이 필터는 수분을 포집하고 분석기 내부 필터의 막힘을 방지하기 위해 만들어졌습니다.
- 이 과정을 모든 샘플에 대해 반복하세요.
그림 12: 가스 분석기를 이동식 테이블 위에 올려놓습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
16. 온도 구배 블록에서 샘플 하역
- 하나씩 샘플을 블록에서 꺼내 상자에 넣으세요. 다음 옵션 중 하나를 따르세요:
- CO2 측정 중 하역.
- 마지막CO2 샘플을 측정한 후 하역합니다.
참고: 블록 배양 후 향후 샘플 분석 요구사항 또는 실험실 일정에 따라 두 가지 옵션 중 하나를 선택하세요. 예를 들어, 16.1.1단계는 일부 샘플의 배양 시간을 변경할 수 있으며, 이는 이후 분석 결과에 영향을 줄 수 있습니다. 실험실 일정(예: 개장 및 폐쇄 시간)도 제한 요소가 될 수 있습니다.
- 샘플을 가공하고 보관하여 향후 분석을 위해 사용하세요.
참고: 이 경우 88개 샘플 전원이 블록 인큐베이션 후에 보존되었습니다. 주걱을 사용해 60mL 유리병에서 샘플 전체를 사전 라벨이 붙은 비닐봉지로 옮겼습니다.
17. 데이터 다운로드
- 가스 분석기로 수집된 데이터를 추출하려면 가스 분석기의 온라인 소프트웨어를 방문하세요. 설정을 클릭한 후 다운로드 아이콘을 누르세요.
- 첫 번째와 마지막 샘플이 측정된 구체적인 시기를 선택하세요. 다운로드를 클릭하세요.
- 새 스프레드시트를 열고 파일 열기를 선택하세요. 파일 검색을 '모든 파일'(*.*) 로 바꾸고 이전 단계에서 저장된 문서를 찾아보세요. 새 창이 열리고, 그 후 '끝내기'를 선택하세요.
18. 기기 끄기
- 전원 버튼이나 소프트웨어 인터페이스를 통해 가스 분석기를 끄세요. 버튼으로 기기를 끄려면 5초 이내에 전원 끄 기 버튼을 세 번 누르세요.
- 냉각 시스템을 꺼 . 락 (항목 I, 보충 그림 2)과 OK/펌프 버튼(항목 E, 보충 그림 2)을 누르세요. 백색소음은 멈춰야 해. 백색소음이 완전히 사라지면 OFF 버튼을 하단에 누르세요.
- 난방 시스템을 꺼 . 기기 뒤에 있는 스위치를 이용해 온도 그라디언트 블록 제어 시스템을 끕니다. 초록불이 꺼지는지 확인하세요(보조 그림 3).
19.CO2 ppm을 호흡율(μg C/kg 토양/시간)으로 변환하기
- 가스 분석기 데이터를 후처리 소프트웨어(저희는 R을 사용)로 가져오고, REMARK, TIME,CO 2, H2O의 변수를 추출합니다.
- 관심 있는 초, 특히 >30초에서 <35초 사이의 초를 추출하는 새 열을 생성하세요.
- 압력 강하 관련 문제가 있는 관측은 모두 제거하세요. 실험 중 압력 강하로 인해 예상보다 약간 낮은CO2 수치가 나타났을 수 있습니다. 이러한 미세한 하강(이전 또는 다음 값보다 3%에서 5% 낮음)은 실제 CO₂ 변화가 아니라 압력 강하로 인한 인공(오류)입니다. 따라서 이전 또는 다음CO2 값에 비해 약간 떨어진CO2 수치는 ~3-5% 제거하세요.
- 나머지 데이터 포인트의 평균CO2 농도(ppm)를 계산합니다. 각 샘플에 대해 측정한 다섯 개의 빈칸 평균을 빼세요.
- 실험실 데이터를 후처리 소프트웨어(예: R)로 가져오고, 다음 변수들을 추출합니다: REMARK, 건조 토양 중량, 폐쇄 시간.
- 분석기가 측정한CO2 ppm을 μg C당 g당 토양으로 변환하려면 식2를 적용하세요:
여기서 가스 분석기로 측정된CO2 농도는 ppm 단위로 표현됩니다; CO2 분자량은 44.01 g·mol-1에 해당합니다; P는 기압이며, 1이고 대기압(atm)으로 표현됩니다; R은 0.082058의 보편 가스 상수로, atm·mol-1·로 표현됩니다. K-1; 헤드 스페이스는 60 mL 유리 바이알의 헤드 스페이스를 기준으로 계산됩니다. T는 기기의 가정 내부 온도로, 293.15이며 K로 표현됩니다; 건조 토양 무게는 g 단위로 표현됩니다. - 그 다음 잠복 시간(시간 단위)으로 나누고 1000을 곱하면 1그램을 토양 킬로그램으로 변환합니다.
- 마지막으로,CO2와 C의 분자량을 이용해 μgCO2를 μg의 탄소로 변환합니다. 이로 인해 호흡 속도는 토양 1kg당 시간당 μg C 단위로 표현됩니다.
- 처리된 데이터를 저장하거나 내보내서 추가 분석을 하세요.
결과
블록 온도의 안정성과 분포
이 프로토콜 개발 과정에서 우리는 블록 내부 온도의 선형성과 시간적 안정성을 테스트했습니다. 냉각 시스템과 히터를 켜면 블록의 초기화 시간은 약 1시간이 되며, 이 기간 동안 8개의 고르게 분포된 온도 센서 대부분이 목표 온도에 도달한 후 오버슈트 후에도 일정하게 유지됩니다(그림 13A). 이 기간 이후, 8개의 센서가 기록한 온도는 알루미늄 블록을 따라 온도가 완벽하게 선형화되어 있음을 확인시켜 줍니다(그림 13B).
그림 13: 온도 구배 블록 내부의 선형성과 시간적 안정성. (A) 잠복 기간 동안 블록 내부 온도의 시간적 안정성, 그리고 (B) 부화 시작 시 센서가 기록한 온도. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
블록 온도와 토양 온도
우리는 블록 내부의 토양 샘플이 8개의 센서가 기록한 온도에 도달하는 데 걸리는 시간을 테스트했습니다(그림 14). 이 연구에서는 센서 근처에 위치한 블록 내 8개의 서로 다른 위치에서 토양 샘플의 온도를 측정했습니다. 블록 내부에 위치한 센서들은 목표 온도에 미리 안정화되어 있었다. 위에서 설명한 프로토콜에 따라 블록 온도가 안정되면 토양 샘플을 블록 안에 넣었습니다. 이번 테스트에서는 블록과 분리된 추가 센서를 사용했습니다. 우리는 15g의 흙을 사용해 센서 프로브가 토양과 완전히 접촉하도록 했습니다. 토양 샘플은 뚜껑을 덮지 않은 채 보관되었고, 총 30분간 매분 온도가 기록되었습니다. 이 시험 중에는 온도 변화를 최소화하고 실제 이용 조건을 최대한 재현하기 위해 블록을 약간 닫아두었습니다(완전히 닫힌 상태). 토양 샘플이 목표 온도에 안정화되는 데 약 12분이 걸린다는 것을 발견했습니다. 이 안정화 시간은 최소 3.5시간 동안 지속되므로 허용 가능한 것으로 판단했습니다. 또한, 12분간의 블록 인큐베이팅 후 토양 온도의 선형성을 평가했습니다. 결과는 토양 온도가 선형 관계를 보이며, 8개의 센서에서 관찰된 선형성과 밀접하게 일치함을 나타냅니다(그림 15).
그림 14: 다양한 온도에서 배양된 기록된 토양 온도. 샘플 A, B, C, D는 해당 센서 근처에 위치한 바이알에 배양되었습니다(참고용으로 그림 10 참조). 토양 온도는 토양 샘플에 직접 삽입된 열전대로 기록되었습니다. 각 센서가 모니터링하는 구체적인 온도는 다음과 같습니다: (A) 센서 1(S1) 4.1 °C, (B) 센서 2(S2) 12.5 °C, (C) 센서 3 (S3) 20.1 °C, (D) 센서 4 (S4) 28.1 °C, (E) 센서 5 (S5) 36.1 °C, (F) 센서 6 (S6) 43.8 °C, (G) 센서 7 (S7) 51.9 °C, 그리고 (H) 센서 8(S8)을 60 °C에서 사용했습니다. 토양 샘플을 블록에 넣은 후 목표 온도에 도달하는 데 약 12분이 소요됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
그림 15: 토양 온도와 센서 온도 간의 강한 선형 상관관계. 네 개의 흙이 담긴 바이알이 8개의 센서 근처에 블록 위치인 A, B, C, D에 배치되었다. 토양 온도는 토양 샘플에 직접 삽입된 열전대로 기록되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
온도-습분 상호작용
잠복 기간 동안 온도와 습도 사이에 불가피한 상호작용이 있어 평가해야 합니다. 예를 들어, 높은 온도는 증발을 가속화할 수 있고, 낮은 온도는 물이 응결될 수 있습니다. 이번 검사에서는 서로 다른 질감을 가진 무작위로 선정된 네 개의 토양 샘플을 사용했습니다(보충표 2). 프로토콜에 따라 각 토양 샘플은 22가지 온도 모두에서 동일한 블록 위치에 배치되었습니다. 결과는 평균 3.5시간의 잠복 시간 이후, 토양 질감과 관계없이 낮은 온도보다 높은 온도가 더 많은 수분 손실을 초래했음을 보여줍니다(그림 16). 60 °C에서 배양된 토양은 전체 첨가물의 평균 12%를 잃었고, 4.1 °C에서 배양된 토양은 평균 1.88%만 손실되었습니다. 즉, 3.5시간의 블록 인큐베이팅 동안 토양은 부화 온도44.45와 관계없이 50%에서 60% 사이의 최적 수분 조건 내에서 유지되었습니다(보완 그림 6).
그림 16: 네 가지 샘플에서 블록 배화 기간 동안 토양 수분의 상대적 손실. 수분 손실은 총 첨가된 물량에 대해 계산되어 WHC를 조정했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
CO2 농도 측정
가스 분석기의 정확성과 정밀도를 테스트하기 위해 인증된 기준 가스(413 ± 5 ppmCO2)를 네 차례 측정했으며, 분석기는 413.71 ± 0.60(ppmCO2, 평균 ± SD)을 기록했습니다. 이로 인해 가스 분석기가 기록한CO2 측정값의 높은 정확성과 정밀도가 확인되었습니다. 또한, 제조사 규격을 준수하기 위해 인증된 기준 가스를 사용한 연 1회 시험이 실시되어야 합니다.
주입 라인과 가스 분석기로 가는 유량 감소 키트로 인한 지연 시간을 고려하여, 최적의 측정 시간을 결정하기 위해 여러 차례 시험이 수행되었습니다. 결과는 주입 라인이 약 5초간 지연을 일으킨다는 것을 보여줍니다. 이 설정에서 이상적인 측정 시간은 20초로,CO2 검출 유닛을 채우고 5초 동안 평형에 도달할 충분한 시간이 있습니다(그림 17). 유량 감소 키트가 1.17 mL/s로 측정하므로, 이 측정 시간은 60 mL 바이알의 공기 함량의 39%를 샘플링한 것과 같습니다. 또한, 가스 분석기를 폐쇄 시스템으로 사용할 때 압력 강하가 발생하는 것을 관찰했습니다. 이 방울은 바늘이 바이알에서 추출될 때 공기 주입이 없는 1초 간격 동안 발생합니다. 데이터 처리 중 압력 하락을 고려하여, 이전 또는 다음 값보다 약간 낮은(3%에서 5% 사이)CO2 값을 제외했습니다.
그림 17: 세 가지 서로 다른 온도에서 배양한 개별 토양 샘플의 최적 측정 시간. 이 그래프는 바늘의 주입 및 추출 시간, 5초 동안CO2 의 평형, 그리고 선택된 시간 프레임과 관련된 압력 강하를 보여줍니다. Incubation_ID 블록 위치(C)와 바이알 위치(5, 10, 15)를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
전체 프로토콜 테스트
프로토콜의 기능과 재현성을 평가하기 위해, 우리는 4 °C에서 60 °C 사이의 22가지 개별 온도에서 각각 네 개의 기술적 복제 샘플을 인큐베이팅했습니다. 이 토양 샘플들은 이 장비로 생성된 데이터 유형과 성능을 보여주기 위해 선정되었습니다. 구체적인 표본 특성은 보충표 2에서 확인할 수 있습니다. 온도 구배 블록은 각 온도 지점에서 토양 샘플의 토양 호흡 속도를 신뢰성 있게 포착하여 온도 반응 곡선을 시각화할 수 있게 했습니다. 또한, 모든 복제의 온도 반응 곡선은 거의 동일했으며, 이는 모든 온도에서 평균 호흡율 주변의 작은 표준편차로 반영됩니다(그림 18). 이 결과는 높은 재현성을 보여주며 프로토콜의 정밀도를 확인시켜 줍니다.
그림 18: 두 토양의 대표적인 SOM 분해율(Rs)으로, 각 토양은 전체 온도 구배에 걸쳐 네 개의 기술적 복제체를 배양하여 측정한 결과입니다. 포인트는 각 온도에서의 호흡 평균 값을 나타내며, 오차 막대는 기술 복제 간 표준편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
두 번째 테스트는 프로토콜의 과학적 적용 가능성을 입증하기 위해 수행되었습니다. 우리는 전체 온도 구배 전반에 걸쳐 토양 호흡율을 측정하고 아레니우스 또는 MMRT 모델을 사용해 데이터를 적합시켰습니다(그림 19). 이 토양 샘플들은 온도 반응 곡선의 대조를 위한 시스템 성능을 입증하기 위해 선정되었습니다(샘플 특성 은 보충 표 2에 제공됨). 결과는 온도 구배 블록으로 수집된 데이터를 SOM 분해율의 온도 민감도에 관한 다양한 이론을 검증함으로써 추가 분석이 가능함을 보여줍니다. 하지만 신선한 토양을 다루는 실험에서는 도전 과제가 발생합니다. 10일간의 잠복 전 기간 동안, 대표 샘플 범위를 넘어선 일부 토양 샘플의 바이알 내에서 곰팡이 군집이 자라는 것을 관찰했습니다. 토양을 교란하지 않고 곰팡이 군집을 신중히 제거하려는 노력에도 불구하고, 이 성장은 일부 샘플의 결과에 영향을 미쳤습니다(그림 20). 따라서 우리는 곰팡이 증식으로 영향을 받은 개별 바이알이 아니라 전체 샘플을 제거하여 해당 샘플을 폐기하기로 결정했습니다.
그림 19: 온도 구배 블록에서 배양된 네 가지 토양 샘플의 대표 결과 및 호흡율(Rs). 빨간 선은 (A,B) 아레니우스 적합도를 나타내고, 파란 선은 (C,D) MMRT 적합을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
그림 20: 곰팡이 성장에 영향을 받은 일부 샘플의 호흡 속도 패턴. 이 결과는 추가 분석에서 제외된 (A,B) 두 개의 오염 샘플의 예입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
보조 그림 1: 기본 NO/NC 회로. C"는 공통어를 의미하는 "COM"으로도 표기될 수 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.
보조 그림 2: 냉각 시스템 제어판. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.
보조 그림 3: 시스템 스위치와 경고등 표시기. (A) 온도 구배 블록 제어 시스템 스위치; 그리고 (B) 센서와 난방 시스템이 켜져 있음을 나타내는 초록불. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하세요.
보조 그림 4: 온라인 인터페이스에서의 온도 구배 블록 히터 제어. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.
보조 그림 5: 가스 분석기의 진단 섹션. 모든 것이 녹색이면 기기가 측정 준비가 되었다는 뜻입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.
보조 그림 6: 서로 다른 온도에서 배양한 토양의 수분 보유 용량, 3.5시간 블록 인큐베이션 후 측정값. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.
보조 파일 1: 상세한 배선 지침. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.
보충표 1: 필요한 수량을 가진 자재 목록. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.
보충 표 2: 수분 손실 시험과 전체 프로토콜에 사용되는 토양 샘플의 특성. 이 샘플들은 프로토콜의 기능을 입증하기 위해 선정되었습니다. 질감 분류는 USDA 시스템을 따르며, 거칠면, 점토, 실트, 모래는 백분율로 표현됩니다. OC는 유기 탄소 함량(토양 g·kg-1 )을 의미하며, pH는 물에서 측정되었고,CaCO3 는 탄산칼슘 함량(g·kg-1)을 나타냅니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.
토론
SOM 분해 속도의 단기 온도 반응을 측정하기 위해 온도 구배 블록을 사용하는 것은 특히 저온에서 호흡 속도를 감지하는 데 어려움을 초래합니다. 저온은 세포 내 및 세포외 효소의 촉매 활성을 직접적으로 억제할 수 있습니다46,47. 따라서 수용 시간은 온도 범위의 낮은 한계에서 낮은 호흡 속도가 유리 바이알 내CO2가 가스 분석기의 검출 범위 내에 충분히 축적되도록 충분히 길어야 합니다. 이 실험 환경에서 최저 온도는 4.1 °C였으며; 이 샘플들은 블록에 가장 먼저 적재되고 마지막으로 분석되어 추가 배화 시간을 제공했다. 약 3.5시간의 블록 배화 시간은 샘플 내CO2 농도의 감지 가능한 변화를 감지하기에 충분하다고 밝혀졌습니다. 이 부화 기간은 토양 유형과 특히 유기물 함량에 따라 달라질 가능성이 큽니다. 예를 들어, 유기물 함량이 낮은 모래 토양은 탄소가 풍부한 토양보다 더 긴 배양 시간이 필요할 수 있습니다. 그러나 여기 실험에서는 3.5시간의 잠복 시간이 대부분의 토양 유형과 유기물 함량에 대해 일반적으로 충분하다고 나타났습니다.
저온에서CO2 검출을 위한 배화 시간 최적화 외에도, 온도 구배의 높은 쪽에서 수분 손실을 최소화하는 것도 똑같이 중요합니다. 토양 수분은 기질의 미생물 군집으로의 운반, 확산 및 용해에 중요한 역할을 합니다48. 예를 들어, 토양 수분은 낮은 수분 수준에서는 기질 확산을 제한하고, 높은 수분 수준에서는 산소 가용성을 감소시켜 호흡 속도를 제한할 수 있습니다45,49. 따라서 고온에서 수분 손실을 최소화하는 것이 미생물의 기질 접근을 제한하는 것을 방지하는 데 중요합니다. 이 프로토콜의 바이알은 완전히 밀봉되어 있었지만, 캡과 내부 벽에 물이 응결되었습니다. 이 응결은 토양에서 손실된 수분으로 간주되었습니다. 따라서 Robinson 등(201741)에서 4시간에서 3.5시간으로 잠복 시간을 단축했습니다. 모든 온도 처리 과정에서 완전히 일정한 수분 수준을 유지하는 것은 불가능했지만, 3.5시간의 부화 기간 동안 토양은 최적의 수분 수준을 유지했습니다. 고온에서도 토양의 WHC는 50% 이상으로 유지되어, 수분 가용성이 기질에 대한 미생물의 접근을 제한하지 않도록 했다44,45.
또 다른 중요한 고려사항은 부화의 온도 범위입니다. 냉방 시스템은 -30°C까지 도달할 수 있고, 난방 시스템은 최대 320°C까지 도달할 수 있지만, 단열 재료는 -183°C에서 148°C까지 온도 허용성을 가집니다. 이 구성에 사용되는 유리 바이알은 500 °C를 견딜 수 있습니다. 이러한 범위는 넓지만, 100 °C 이상의 인큐베이션 샘플은 운영자에게 안전 문제를 안겨줍니다. 과열을 방지하기 위해 열 저항기가 추가되어 알루미늄 블록이 90 °C에 도달하면 난방 시스템이 자동으로 차단되도록 했습니다. 이 열저항기의 포함은 초기 초기화 오버슈트가 관찰되었기 때문에 매우 중요합니다(그림 13A). 초기화 중 온도가 90 °C 이상으로 올라가면 시스템이 비활성화됩니다. 이러한 한계를 고려할 때, 안전하고 신뢰할 수 있는 성능을 위해 최대 60°C까지 이 장비를 운영할 것을 권장합니다. 0°C 이하의 토양 샘플을 배양할 때는 결로와 수분 변동이 영하 온도에서 측정에 영향을 줄 수 있으므로 추가 검사가 필요합니다. 이 프로토콜에서는 결로가 관찰되지 않는 4°C라는 낮은 온도 한계를 선택했습니다. 시스템이 더 넓은 온도 범위에서 사용된다면, 추가적인 열 안전 지침을 도입할 것을 권장합니다.
이 방법의 또 다른 잠재적 제약은 비교적 짧은 잠복 기간 때문에 미생물 군집이 온도 변화에 적응할 수 없다는 점입니다. 지속적인 온난화에 노출된 토양의 온도 반응은 많은 연구의 초점이었으며, 특히 미생물 적응 이론 27,43,47,50,51을 검증하는 것이 목적이 되었습니다. 미생물 적응이 실험적 온난화가 토양 호흡률에 미치는 영향이 시간이 지남에 따라 감소하는 현상을 설명하기 위해 제안되었습니다47. 그러나 여기 제시된 방법론은 SOM 분해 속도의 단기 온도 반응을 측정하기 위해 개발되었습니다. 미생물 적응이짧은 시간 내에 일어날 가능성은 낮지만, 최근 연구에서는 유사한 방법으로 지열 구배 토양을 배양하여 미생물 적응 속도를 정량화했습니다. 이 연구에서는 MMRT를 적합하여 온도 최적과 전환점을 포함한 주요 매개변수를 추정하였습니다. 지열 구배 토양 간 매개변수를 비교한 결과, 미생물 적응 속도가 온난화 속도보다 유의미하게 낮다는 것을 보여줍니다. 이 연구는 전체 온도 반응 곡선을 이해하는 것의 중요성을 강조하며, 특히 생물학적 토양 과정의 최적 온도 및 전환점을 포착하는 것이 중요함을 강조합니다(그림 19C,D). 이러한 발견을 바탕으로, 블록 배양 중 여러 온도점에서 미생물 군집을 샘플링하여 미생물 군집의 구성과 기능이 호흡 속도 및 온도 민감성 매개변수와 어떻게 연관되는지 평가할 것을 권장합니다.
이 논문에서 설명한 온도 구배 차단은 전통적인 방법론에 비해 상당한 이점을 제공합니다. 주요 장점 중 하나는 연구자들이 소량의 토양을 사용하여 22가지 이산 온도에서 SOM 분해 속도를 효율적이고 정확하게 측정할 수 있게 해준다는 점입니다. 이는 몇 가지 개별 온도에서 토양 샘플을 배양하는 것과 비교해 방법론적 개선을 의미하며, 이는 연구자들이 Q10 온도 계수를 적용하도록 강요하는 방식으로, 많은 연구가12, 13, 15 방법에 도전을 제기한 것입니다. 또 다른 중요한 이점은 이 시스템이 온도 반응 곡선의 형태와 경사도를 명확히 포착한 데이터를 수집한다는 점입니다. 넓은 온도 구배를 따라 이산 온도 처리가 이루어지면 전환점 온도와 생물학적 과정의 최적 방법을 식별할 수 있어 처리 간 비교가 가능합니다. 이 원고에 제시된 예시들은 두 가지 뚜렷한 패턴(그림 19A,B 대 그림 19C,D)을 보여주며, 연구자들은 서로 다른 온도 민감성 이론을 통해 이를 더 분석할 수 있습니다. 몇몇 예시는 반응 속도가 온도에 따라 지수적으로 증가하는 아레니우스 이론을 지지한다(그림 19A,B). 반면, 다른 예들은 MMRT 이론과 일치하며, 명확한 온도 최적값이 있는 단일 모드 반응을 보여준다(그림 19C,D). 이 두 가지 다른 패턴은 제시된 온도 블록 인큐베이션 프로토콜이 두 가지 반응 곡선을 모두 재현할 수 있음을 시사하며, 이는 SOM 분해 속도의 온도 민감성 이론을 검증하는 데 활용되어 열역학, 생물학, 화학에 대한 이해를 심화시킬 수 있습니다.
공개 사항
저자들은 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
블록의 프로그래밍, 전자기기, 테스트를 도와준 Pieter van de Broek에게 감사드립니다. 전자 유닛 프로토콜 작성에 도움을 준 크리스토퍼 웨데에게 감사드립니다. 이 설치 재료 주문에 도움을 준 헨크 마텐스에게 감사드립니다. 또한 실험실 배치 과정에서 도움과 지원에 주신 타마스 살란키, 파올로 디 로나르도, 윌레케 반 틴텔렌에게 감사드립니다. 또한 온도 블록의 성능 테스트로 제시된 역사적 샘플 접근을 허락해 준 공동 연구 센터에 감사드립니다. 마지막으로, 이 프로토콜을 시험하기 위한 토양 샘플링 캠페인 동안 도움을 주신 Antoine Moinet와 Tullia Calogiuri에게 감사드립니다. 이 프로젝트는 바헤닝겐 대학교 및 연구의 토양과학 클러스터의 지원을 받았습니다.
재료
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