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SOD1-ASO의 요추 수막내 주사, 인간 SOD1-G93A ALS 마우스에서 정밀한 중추신경계 표적 지정과 예측 효능을 위한 방법

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DOI:

10.3791/69788

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2026년 2월 24일

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1Biogen

이 논문에서

요약

이 글에서는 성체 마우스에서 CNS 표적 치료제의 테스칼 내 전달 방법을 자세히 설명하며, 프로토콜의 정확성과 반복 주사 허용에 중점을 둡니다. 이 연구에는 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 SOD1-ALS 모델 마우스에서 돌연변이 SOD1 발현을 감소시킨 검증 연구 결과가 포함되어 있어, 신경퇴행성 질환 전임상 연구에서 이 접근법의 유용성을 뒷받침합니다.

초록

중추신경계(CNS) 표적 치료제의 간수체(IT) 투여는 뇌척수액(CSF)으로 직접 약물을 전달하는 최소 침습 경로를 제공하여 특이성과 표적 결합을 촉진합니다. 쥐에서 IT 카테터 삽입은 지속 전달에 표준이지만, 쥐에서는 해부학적 제약과 척추 손상 및 감염 등 시술 관련 합병증 위험 증가로 인해 적용이 제한됩니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 성체 마우스에서 IT 약물 전달에 급성 바늘 천공 기법을 사용하여 단일 또는 반복 투여 요법과 호환되는 재현 가능하고 덜 침습적인 대안을 제공했습니다. SOD1-G93A 돌연변이를 보유한 근위축성 측삭경화증(ALS) 형질전환 마우스 모델에서 SOD1 유전자를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드(ASO)의 효율적인 IT 전달을 달성했습니다. 이 접근법은 돌연변이 SOD1 발현을 효과적으로 하향 조절하고 질병 표현형을 현저히 완화시켰으며, 이는 전기생리학적 및 바이오마커 평가에서 입증되었습니다. 이 결과는 IT 전달 방법과 치료 효능을 모두 검증하며, 결과는 뇌실내(ICV) 투여와 유사합니다. 무엇보다도, 이 기법은 인간 임상 연구에서 사용되는 절차를 반영하여 중추신경계 중심 중재의 전임상 평가에 강한 번역적 관련성과 유용성을 제공합니다. 일관성을 확보하고 비표적 효과를 피하기 위해서는 기술적 전문성이 필요하지만, 이 IT 전달 전략은 소동물 모델에서 치료 개발을 진전시키는 견고하고 재현 가능하며 임상적으로 적합한 방법론을 제공합니다.

서론

본 연구에서는 요추 수막 내 주사법을 설명하고, 이를 뇌실내(ICV) 전달과 비교하며, 중추신경계(CNS) 표적 치료제 개발을 안내하기 위한 약리역학적 결과 및 내약성을 평가합니다. RNA 표적 치료, 특히 안티센스 올리고뉴클레오타이드(ASOs)는 전사 후 유전자 발현 조절을 가능하게 하여 중추신경계 질환에 유망한 치료법입니다. 이러한 접근법은 진행성 신경 손실이 질병 진행을 조절하기 위해 정밀하고 국소적이며 시기적절한 개입의 필요성을 강조하는 신경퇴행성 질환에 특히 중요합니다. 여기서는 IT 주사 프로토콜과 ASO 치료제의 ICV 투여 효과를 직접 비교합니다.

전임상 연구에서는 성체 쥐(수컷 또는 암컷, 30-70일, 체중 13-20g)를 대상으로 하추 내 주사를 사용하여 중추신경계 1,2를 표적으로 하는 약리학적 제제나 생물학적 벡터를 뇌척수액(CSF)에 직접 전달하는 방법이 사용되었습니다. 5-10 μL 주입량은 일반적으로 일시적인 뇌척수액 압력 상승과 역류를 제한하기 위해 천천히 투여되며, L5-L6 척간공간을 통해 척막내 접근이 가능합니다 1,2. 시술 성공은 신경학적 손상을 피하기 위한 신중한 기술에 달려 있으며, 나이와 체중이 뇌척수액 양과 취급에 영향을 미칩니다. 미세 게이지 바늘(예: 27-30G 바늘과 25 μL 해밀턴 주사기)을 사용하면 신뢰할 수 있는 전달이 가능합니다2. 주요 기술적 과제로는 사공간 손실 최소화, 경막외 오주사 및 누출 방지, 투여 정확도 및 뇌척수액 분포에 영향을 줄 수 있는 수술자 의존적 변동성 감소 등이 포함됩니다.

중추신경계 질환에 대한 효과적인 치료법 개발은 구조적 복잡성과 세포 이질성 때문에 여전히 큰 도전 과제로 남아 있습니다. 이러한 특징들은 표적 약물 전달을 방해하고 여러 해부학적 및 생리학적 장벽에 걸친 생물 분포를 제한하여 특수한 전달 전략을 필요로 합니다. 주요 장애물은 중추신경계 전역에 존재하는 생리적·해부학적 장벽에서 발생하여 약물 침투를 제한합니다. 뇌와 척수는 경막, 지미막, 피아막 세 개의 수막층에 둘러싸여 있으며, 이 층과 함께 혈액 내 순환 치료제와 혈액 내 다른 분자에 대한 강력한 방어 역할을 합니다. 중추신경계 안정성 유지에 필수적이지만, ASOs, 단클론 항체, 바이러스 벡터 1,2,3,4와 같은 큰 친수성 분자의 전달을 크게 방해합니다. IT 관리는 지주막하 공간의 뇌척수액에 직접 치료제를 투여함으로써 이러한 제한을 우회할 수 있는 방법을 제공합니다. 이 전달 경로는 중추신경계 구획 전반에 약물을 분포하여 조직 침투를 촉진하고, 이를 통해 중추신경계 내 다양한 세포 유형에서 발현된 표적과 효과적으로 상호작용할 수 있게 합니다. 1980년 Hylden과 Wilcox가 쥐1에서 모르핀 전달을 위해 처음 사용한 이후, IT 주사는 소분자, 생물학적 제제, 유전자 치료 벡터, ASO5, 6, 7, 8, 9, 10 등 다양한 치료제를 전달하는 데 더 널리 사용되는 방법이 되었습니다.

ASO는 상보적인 RNA 서열에 결합하고 RNase H 매개 분해, 접합 조절, 그리고 번역의 입체 억제 같은 메커니즘을 통해 유전자 발현을 조절하도록 화학적으로 설계된 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드입니다. 포스포로티오에이트 골격 변형, 2'-O-메톡시에틸(2'-MOE) 치환, 제한된 에틸 잔기와 같은 화학적 향상은 안정성, 결합 친화력, 그리고 뉴클레아제에 대한 저항성을 향상시킵니다. 이러한 특성들은 신경유전 질환과 관련된 병원성 유전자를 표적으로 하는 데 적용되는 데 이를 뒷받침합니다. ASO 기반 치료법은 척수성 근위축증(SMA) 및 근위축성 측삭경화증(ALS)과 같은 질환에서 임상적 이점을 입증했습니다(12,13,14,15). 예를 들어, Nusinersen(Spinraza)은 SMN2 전사체에서 엑손 7 포함을 강화하여 SMA7,14에서 SMN1 손실을 보상합니다. 헌팅턴병12,13에서도 돌연변이 헌팅틴 전사체를 표적으로 하는 유사한 전략이 탐구되었다. 이 시험들은16일 초에 종료되었지만, CNS 주도 ASO 접근법에 대한 지속적인 관심을 강조합니다.

ALS는 상부 및 하부 운동 뉴런의 점진적 퇴행을 특징으로 하는 치명적인 신경퇴행성 질환입니다. 이 질병은 전 세계 인구 10만 명당 6명에서 9명 사이이며, 약 10만 인년당 2건의 발생률로 발생하며, 점차 악화되는 근육 약화와 경직을 보이며, 대부분의 환자는 증상 시작 후2-3년 이내에 신경근호흡부전으로 사망합니다. 대부분의 사례는 산발적(sALS)이지만, 약 10%는 가족성 질환(fALS)으로, 이는 질병의 유전적 요인에 대한 통찰을 제공합니다. 가장 많이 연구된 유전자 중 하나는 Cu/Zn 초산화물 디무타제 1(SOD1)으로, 이는 fALS의 약 15%에서 20%, sALS의 2% 미만을 차지하며, 상염색체 우성 방식으로 유전됩니다18. SOD1은 세포질 항산화 효소를 암호화하여 과산화물 라디칼을 과산화수소로 전환하여 반응성 산소 종을 해독합니다. G93A, A4V, H46R과 같은 돌연변이 SOD1은 구조 불안정성을 보여 단백질 응집과 독성 기능 획득을 유발하여 산화 스트레스, 미토콘드리아 기능 장애, 흥분독성에 기여합니다 19,20,21,22,23,24,25. 더불어, ALS 병리는 미세아교세포와 성상교세포를 관여하는 비세포 자율 기전으로 인해 악화되며, 이는 만성 염증 환경과 진행성 신경 손상에 기여합니다 26,27,28,29. 따라서 ASO를 이용한 SOD1 발현을 침묵시키는 것은 질병 발병 기전을 완화하는 유망한 치료적 길을 제시합니다.

SOD1-G93A 형질전환 마우스 모델(Jax Strain #: 004435)은 내인성 인간 SOD1 프로모터의 조절 하에 인간 G93A 돌연변이 형태의 SOD1을 발현하며, 초기 운동 장애, 척수 신경퇴행, 생존 단축 등 ALS의 임상적 특징을 밀접하게 재현합니다30. 이전 전임상 연구들은 SOD1-G93A 쥐에서 출생 후 65일에 삼투압 펌프를 이용한 지속적인 심실 내 전달을 통해 하루 100 μg을 28일 연속 투여하면 SOD1 수치가 유의미하게 억제되고 신경염증 반응이 감소하며, 임상 징후 발현이 지연되고 운동 능력이 향상된다는 결과가 나타났습니다31. 더불어, SOD1-ALS 환자에서 ASO 매개 SOD1 다운은 신경섬유 경쇄(NfL) 수치 감소와 연관되어 있으며, 이는 축삭 손상을 나타내는 혈액 기반 바이오마커입니다32. 본 연구에서는 SOD1-G93A 마우스에서 IT 주입을 통해 SOD1 표적 ASO를 투여하고, 분자, 전기생리, 바이오마커 판독값 전반에 걸쳐 그 영향을 평가하였습니다. 척수 조직의 정량적 분석에서 SOD1 mRNA 수치가 유의미하게 감소한 것으로 나타났습니다. 복합 근 활동전위(CMAP)의 전기생리학적 평가는 신경근 기능이 보존된 것으로 나타났습니다. 동시에 혈청 NfL 수치도 감소하여 지속적인 신경 손상 완화를 반영했습니다.

대체 CNS 전달 방법의 공간적 분포와 상대적 효능을 평가하기 위해, 치료제를 측심실에 주입하여 뇌수액 흐름을 통해 뇌실과 혈관 주변 공간을 통해 확산하는 비교 군을포함했습니다. IT와 ICV 투여 경로를 비교함으로써 약리역학적 결과 및 조직 표적 선정의 차이를 명확히 하고, 이를 통해 CNS 지향 ASO 치료의 전달 전략을 정교하게 개선하고자 했습니다. 또한, 전환 타당성을 평가하기 위해 동물당 최대 4회의 IT 주사를 8주 간격으로 독립적으로 내약성 연구를 수행했습니다. 모든 시험 요법에서 명백한 고통이나 이환 징후는 관찰되지 않아 생존 맥락에서 IT ASO 투여의 내약성을 뒷받침하였다. 이 결과는 쥐에서 반복적인 수막 내 주사의 내약성을 입증한 이전 보고서들과 일치한다34.

IT ASO 전달의 임상적 관련성은 SOD1 관련 ALS35에 대한 tofersen(QALSODY)® 의 최근 규제 승인에 의해 더욱 뒷받침됩니다. 임상 연구에서는 CSF SOD1 단백질 감소와 이어서 신경축삭 손상의 바이오마커인 신경섬유 경쇄 수준 감소로 나타나는 강력한 표적 결합이 입증되었습니다. 초기 3상 VALOR 시험에서는 주요 평가변수가 충족되지 않았으나, 오픈 라벨 연장을 포함한 통합 분석은 조기 치료 시작의 잠재적 이점을 시사했다35.

여기 데이터는 SOD1-G93A ALS 마우스 모델에서 SOD1 표적 ASO의 IT 전달이 효과적인 분자 넉다운, 바이오마커 개선, 기능 보존을 우호적인 내약성과 함께 달성함을 보여줍니다. 이 결과들은 중추신경계 유전 질환에 대한 합리적이고 임상적으로 실현 가능한 접근법으로서 IT ASO 전달을 뒷받침하며, 지속적인 중개 개발을 위한 견고한 전임상 틀을 제공합니다.

프로토콜

이곳의 모든 절차는 IACUC가 승인한 프로토콜과 기관의 화학 위생 및 생물안전 지침에 따라 승인 및 수행되었습니다.
참고: 표준 조건(12시간 밝음/어둠 주기, 22-24 °C, 자유롭게 먹이와 물 접근) 하에 사육된 C57BL/6J(JAX #000664)와 SOD1-G93A 형질전환 마우스(JAX #004435)에서 연구를 수행하십시오.

1. 인간 SOD1을 표적으로 화학적으로 변형한 ASO를 적용하는 방법

  1. 검증된 안티센스 올리고뉴클레오타이드(ASOs)를 사용하여 인간 SOD1 유전자의 3' 비번역 영역(UTR) 내 뉴클레오티드 613-629를 특이적으로 표적으로 합니다 (RefSeq: NM_000454.5)36: A*GoToG*T*T*T*A*A*T*T*ToToA*T*C
  2. 안정성과 효능을 향상시키기 위해 검증된 화학적 변형을 포함하며, 이전에 보고된36 명에 따르면 MOE(2'-O-메톡시에틸), cEt(제한 에틸)(이탤릭체), DNA(굵은), 인산염 결합(o), 인산염 결합(*)을 포함합니다. 보조 파일 1 에는 ASO 화학과 해당 색상 코딩이 포함되어 있습니다.
  3. 인간이나 설치류 게놈과 상보성이 없는 비표적 대조군 ASO를 준비하며, 대조군으로 사용할 수 있는 동일한 변형 체계를 따릅니다: C*CoToAoT*G*G*A*C*T*T*T*T*T*C*AoGoGoA*A

2. 무균 조건에서 ASO 용액을 준비하고 취급하는 것

  1. 멸균 인공 뇌척수액(aCSF; 표 1) 멸균 조건에서 10 mg/mL 농도로 적용하며, 최종 주입량은 동물당 10 μL(100 μg)입니다.
  2. 분자 완전성을 유지하기 위해 멸균 피펫으로 용액을 부드럽게 섞은 후, 5-10초간 가볍게 소용돌이를 돌려 잘 혼합되도록 하세요.
  3. 희석된 용액을 멸균 0.2mm 주사기 필터로 걸러내어 입자와 오염물질을 제거합니다.
  4. 최종 용액을 멸균 마이크로 원심분리관에 분리하여 4°C에서 최대 1주일간 모니터링되고 온도 조절되는 장치에 보관하며, 동결-해동 과정을 피하여 안정성을 유지합니다.

3. 척수막 내 주사 전 마우스 준비

  1. 디지털 저울을 사용해 마우스를 0.1g에 가장 가까운 무게로 재고, 코 콘으로 옮긴 후 산소 농도 2-2.5%의 이소플루란으로 마취를 유도합니다; 수심을 지속적으로 모니터링하고 발달 반사가 상실되어 수술용 평면을 확인하세요.
  2. 온도조절 가능한 온열 패드를 준비하고 37°C로 설정하여 쥐가 준비하고 회복하는 동안 지원하도록 하세요.
  3. 마취 유도 직후 양쪽 눈에 각막 건조를 방지하기 위해 안과 윤활제를 바르세요. 그 후 쥐를 온열 패드 위에 복측 누워 눕혀 저체온증을 예방하고 생리적 스트레스를 최소화하며 시술 내내 정상적인 심혈관 및 호흡 기능을 지원합니다.
  4. 부프레노르핀 서방형 주사막(1.3 mg/mL)을 멸균 주사기와 25G 바늘을 사용해 3.25 mg/kg의 피하 투여 후 시술 전 체중 20g당 0.05 mL를 주입합니다.
  5. 허리 부위를 중간 옆구리에서 골반 허리 부위까지 면도한 후, 이소프로필 알코올과 포비돈-요오딘을 번갈아 사용해 소독한 후 세 번 반복한 후 완전히 자연 건조시킵니다.

4. 직접 척막내 주사

  1. 마취 및 수술 부위 준비 후, 쥐를 깨끗한 주사 부위로 옮겨 온열 패드 위에 복측 누워 눕히세요.
  2. 쥐를 척추가 아치형으로 굽히는 위치에 놓아 촉진과 주사를 쉽게 하세요.
    1. 하부 흉추에서 상부 요추 부위에 곡선 주걱을 삽입하여 가벼운 척추 굴곡을 유도하고, 5번째와 6번째 (L5-L6, 선호) 또는 4번째와 5번째(L4-L5) 사이의 요추 추간을 넓히세요.
    2. 주사 안전성과 정확성을 높이기 위해 라미네 사이로 바늘 베벨을 전진시켜 요추 저장고조로 들어가 지주막하 공간에 접근하세요.
  3. 한 손의 엄지와 검지로 골반 중심선을 부드럽게 잡고, 다른 손으로 등쪽 중앙선을 촉진하여 L4-L5 또는 L5-L6 사이의 목표 추간을 찾아 골반 허리띠를 안정시킵니다.
  4. 멸균 0.3mL 인슐린 주사기를 29G 1/2인치 바늘을 등 피부 표면에 수직으로 또는 70-80° 각도로 맞춰 두개골 방향으로 정렬합니다. 바늘을 경막을 관통할 때 약간의 저항이 있을 때까지 앞으로 밀어낸 후 척강 내 공간으로 계속 밀어넣습니다.
  5. 끝이 척막 내 공간에 들어갈 때까지 꾸준히 삽입하며, 성공적으로 삽입되었음을 알리는 꼬리 튕김 반사로 확인됩니다.
  6. 상당한 저항이 있거나 꼬리 튕기는 반사가 관찰되지 않으면, 바늘을 빼고 해부학적 지점을 재확인한 후 바늘 위치를 조정한 후 주사를 재시도합니다. 처음 시도가 L5-L6 추간공간에서 이루어졌다면, 다음 시도는 L4-L5 추간공간에서 수행하세요.
  7. ASO 용액 10 μL을 천천히(10초 이상) 주입하여 압력 변화를 최소화하고 뇌척수액 역류를 방지하세요. 주사 후 바늘은 추가로 10초간 고정될 수 있습니다.
  8. 조직 손상과 역류를 막기 위해 바늘을 세로로 부드럽게 조심스럽게 빼세요.
  9. 회복 기간 동안 쥐를 지속적으로 관찰하며 호흡, 운동 기능, 자세, 통증이나 불편의 징후를 관찰하세요.
  10. 쥐가 정상적인 움직임과 행동을 회복한 후 다시 우리 케이지로 돌려보내세요.
  11. IACUC 프로토콜에 따라 주사 부위, ASO 용량, 주사량, 시술 중과 이후 행동 또는 생리학적 관찰 등 모든 관련 절차 세부사항을 문서화하십시오.

5. 쥐 모니터링 및 주사 후 회복 지원

  1. 각 마우스를 37°C로 유지된 사전 가열된 회수 챔버 내 개별 또는 충분한 간격의 구획에 배치합니다.
  2. 마취 회복 중에는 저체온증을 예방하기 위해 챔버 온도를 조절하세요.
  3. 호흡 속도와 패턴, 자세, 촉각 자극에 대한 반응성을 지속적으로 모니터링하세요.
  4. 마우스가 다시 정상 방향을 찾고 조화로운 움직임을 보일 때까지 관찰하세요.
  5. 과밀을 피하여 명확한 시야를 확보하고 간섭을 방지하세요.

6. 홈 케이지로 돌아갈 기준 결정

  1. 쥐가 안정적이고, 자발적으로 조율된 움직임이 있는지 확인하세요.
  2. 호흡이 힘들거나 불규칙하게 들리거나, 소리를 내거나, 장기간 반응하지 않는 등 고통의 징후가 없는지 확인하세요.
  3. 영양적으로 완전한 젤 다이어트 보충제와 같은 부드러운 영양 지원을 제공하여 최소한의 노력으로 수분과 칼로리 섭취를 유지할 수 있도록 돕습니다.

7. 생쥐 회복 후 관찰 수행

  1. 집단 사육 중인 쥐라면 탐색, 그루밍, 사회적 상호작용 등 정상적인 행동을 확인하세요.
  2. 비정상적인 자세, 쇠약함 또는 마비, 불규칙한 호흡, 반응 저하 등 비정상적인 회복 징후가 나타나는지 지속적으로 관찰하고, 이러한 증상이 나타나면 즉시 재평가하세요.
  3. 회복이 지연되거나 문제가 생기면 수의사의 개입을 받으세요.

8. 입체주격 수술 및 수술 후 관리를 이용한 측심실내 뇌실내 주사

참고: 공간적 분포와 상대적 효능을 평가하기 위해 뇌실내(ICV) 주사를 사용한 비교 군을 포함하며, ASO를 외심실에 전달하여 CSF 매개 전파 및 척수막내 전달과 비교합니다. ICV 주사는 마우스에 대해 잘 확립된 표준화된 프로토콜에 따라 시행됩니다37.

  1. 산소 농도는 2-2.5%의 이소플루란으로 마취하여 움직이지 못하게 하고, 온열 패드 위에 복측 누운 자세로 한 뒤, 부프레노르핀 서방형 주사액(1.3 mg/mL 부프레노르핀 하이드로클로라이드)을 피하에 투여합니다. 무균 1mL 주사기와 25G 바늘, 20g 체중당 0.05 mL를 사용함. 클리퍼로 마우스 두피를 면도하세요.
  2. 모든 수술 시술은 마취 하에 수행하세요. ICV 수술 내내 무균 상태를 유지하세요. 멸균된 기구만 사용하고, 비멸균 표면과의 접촉을 방지하기 위해 조심스럽게 다루세요.
  3. 마우스를 입체 프레임에 고정하고, 표준 엎드린 자세에 디지털 디스플레이 콘솔을 설치하세요. 앞니를 마우스 어댑터의 치아 막대에 끼워 머리를 고정한 후, 흡입 및 배기 호흡관으로 어댑터를 고정해 아이소플루란을 공급합니다. 이어바를 귀에 삽입하고 나사를 조여 헤드를 단단히 고정하세요.
  4. 이소프로필 알코올과 포비돈-요오드를 번갈아 세 번 면봉으로 소독한 후, 멸균 메스로 중앙선 절개를 하여 두개골을 노출시킵니다. 멸균된 면 팁을 사용해 연조직을 제거하고 브레그마가 명확히 보이도록 하세요.
  5. 두개골에 브레그마를 표시하세요. ASO가 포함된 주사기를 바늘(26-G, 26s/2"/2, 포인트 스타일)을 브레그마 바로 위에 위치시킵니다. 바늘을 목표 좌표에 맞춰 정렬하세요: AP -0.3 mm, ML ±1.0 mm, DV -3 mm 두개골 표면에서 위치. AP와 ML 좌표에 해골을 표시하세요.
  6. 표시된 좌표에 버 홀을 만들고, 입체 고정 프레임을 사용해 주사기 바늘을 두개골 표면에서 -3mm 깊이까지 내립니다. 10 μL/분의 속도로 주입하여 총 부피가 10 μL에 도달할 때까지 투여합니다. 주사를 마친 후에는 바늘을 4분간 고정한 후 천천히 빼서 역류를 최소화하세요.
  7. 두피 절개 부위를 봉합하고, 쥐를 완전히 깨울 때까지 미리 데워진 37°C 회복실에 넣은 뒤, 안정성을 확인한 후 다시 집 우리로 돌려보내세요. 영양적으로 완전한 젤 다이어트 보충제를 제공하고, 비정상적인 자세, 쇠약 또는 마비, 불규칙한 호흡, 반응 저하 등 비정상적인 회복 징후를 지속적으로 모니터링하세요; 이러한 증상이 나타나면 즉시 재평가하세요.

9. 복합근 활동전위(CMAP)의 전기생리학적 평가

  1. 데이터 수집 및 분석 시 편향을 제거하기 위해 실험자들이 각 마우스의 유전자형과 처리군 모두를 모두 눈가리게 해야 합니다.
  2. 이소플루란으로 마취하여 움직이지 않고 편안하게 하고, 체온을 37°C로 유지하세요.
  3. 발달 반사가 사라지도록 하여 적절한 마취를 확인하세요.
  4. 자극과 기록 모두에 일회용 28G 단극성 바늘 전극을 사용하세요. 기록 전극을 전경골근에 1mm 삽입하세요.
  5. 좌골신경 노치 근처에서 0.1ms 단상 정사각 파동 펄스를 2초마다 1.0 mA에서 시작해 0.5 mA 단위로 증가시켜 최대 반응(보통 1.5-3.5 mA)을 달성할 때까지 자극합니다.
  6. 최대 임계값이 결정되면, 그 수준보다 0.5 mA 높은 곳에서 CMAP 반응을 기록합니다. 자극 후 0.8ms 시점에 CMAP 진폭(피크 투 피크)을 측정하여 지연을 배제하고, 각 마우스의 왼쪽과 오른쪽 다리 진폭을 평균화합니다.

10. 혈청 pNFH 수치 측정

  1. 지정된 시점에 혈전 활성화제와 혈청 분리 젤이 포함된 모세혈관 혈액 채취관을 사용해 얼굴 정맥 천자로 100 μL의 전혈을 채취합니다.
  2. 2000g에서 4°C에서 10분간 원심분리 혈액 샘플을 추출해 혈청을 분리합니다.
  3. 검증된 면역분석약을 사용해 완전 자동화된 카트리지 기반 마이크로플루이딕 면역분석기에서 생물학적 샘플 내 pNFH 측정을 위한 검증된 면역분석제를 사용하여 혈청 인산화 신경섬유 중쇄(pNFH) 수준을 정량화합니다.

11. RNA 분리 및 RT-qPCR 수행

  1. 6mm 강철 비드를 이용해 극저온 프로그래밍 가능한 고에너지 진동 비드 밀에서 마우스의 경추/흉추 척수 조직을 분당 1,000-1,200 스트로크로 30-40초간 샘플 분쇄합니다.
  2. 분쇄된 조직(15 mg)은 700 μL 페놀-구아니디늄 티오시아네이트 기반 용해제에 2.8mm 세라믹 비드를 사용해 균질화하고, 프로그래밍 가능한 고속 비드 기반 기계적 균질제를 사용하여 RNA 추출 시약을 5.62 m/s 속도로 두 번의 30초 사이클 동안 진행합니다.
  3. 제조사의 지침에 따라 컬럼 내 DNase 처리를 포함한 전체 RNA를 추출합니다.
  4. cDNA 합성을 위해 고용량 역전사 시약 시스템을 사용하여 cDNA 합성을 수행합니다.
  5. qPCR 검출을 위해, 인간 SOD1 유전자의 엑손 4를 표적으로 하는 관심 유전자를 검출할 맞춤형 프라이머/프로브 세트를 설계하세요:
    전방향 프라이머(5′-TGGTGTGGCCGATGTGTCTA-3′),
    역입 프라이머 (5′-ATGATGCAATGGTCTCCTGAGA-3′)
    프로브 (5′-6FAM-TGAAGATTCTGTGATCTCA-MGB/NFQ-3′)
  6. 마우스 GAPDH(TaqMan 분석법 ID: Mm99999915_g1)를 하우스키핑 유전자로 사용하세요.
  7. 반응당 20 ng의 cDNA, 빠른 사이클링 프로브 기반 qPCR 마스터 믹스, 유전자 특이 프라이머, 형광 표지 가수분해 프로브를 사용하여 고처리량 실시간 정량 PCR(qPCR) 기기에서 qPCR을 수행하여 하우스키핑(VIC/MGB) 및 표적(FAM/MGB) 전사체를 검출합니다.

12. 데이터의 통계적 분석

  1. 생애 측정(CMAP), 혈청 pNFH, 유전자 발현 분석 데이터를 평균 표준편차(SD)± 제시합니다.
  2. 그룹 평균 간 통계적 유의성을 일방향 ANOVA로 평가한 후 Tukey의 다중 비교 검정을 적용하는데, p < 0.05를 통계적으로 유의하다고 간주합니다.
  3. 적절한 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 그래프를 생성하고 연구에서 수행한 모든 분석을 수행하세요.

결과

성체 마우스에서 척수액 내 투여의 정밀도와 효율성을 엄격히 특성화하기 위해, 우리는 먼저 뇌척수액 흐름과 조직 투과의 시각적 추적자로 에반스 블루 염료(0.5%)를 활용한 기초 검증 실험을 수행하였습니다. 성체 야생형 C57BL/6J 마우스(품종 #000664; 무게 25-30g)는 운동 인조를 제거하기 위해 산소 내 이소플루란(2-2.5%)으로 마취했으며, 요추 부위는 무균 조건에서 준비되었습니다. IT 주사는 20 μL, 30 μL, 50 μL의 단일 상승 용량으로 지주막하 공간에 요추 천자를 사용하여 용량/부피와 염색 강도 관계를 평가하였다. 주사 중 꼬리 움직임이나 음의 저항을 관찰하여 바늘 위치가 올바르게 확인되었습니다.

염색 투여 5분 이내에 쥐는 혈관에서 남은 염료를 제거하기 위해 차가운 인산염 완충 식염수(PBS)로 경관을 투여했습니다. 그 후 척수를 부드럽게 추출하여 표준 조명 아래 중립적인 배경 아래 촬영했습니다. 육안 검사 결과 염료를 받은 모든 쥐에서 에반스 블루가 등쪽에서 복측까지 일관되고 균일하게 분포되어 있음을 확인하였습니다. 주입량이 많을수록 전륜 꼬리 축을 따라 염료 포화도가 강해졌음과 상관관계가 있었으나, 20 μL 용량을 주입한 마우스도 강한 염색을 보였다. 반면, 에반스 블루 염료를 투여하지 않은 쥐(멸균 생리식염수 주입 대조군)는 척수 조직에서 눈에 띄는 색이나 배경 착색이 전혀 보이지 않았습니다(그림 1). 이 연구 결과는 쥐에 대한 IT 주입이 척수를 따라 빠르고 재현 가능한 용질 전달을 가능하게 함을 보여줍니다. 이 실험들의 한계는 염료 분포의 정량적 평가가 부족하고, ASO 투여에 사용되는 10 μL 주입 부피에서 염료 분포 분석이 없다는 점입니다. 그러나 인간 SOD1-G93A 마우스의 유전자 발현 수준에서 인간 SOD1 특이 유전자 발현 분석을 통해 후속 표적 참여 측정이 수행되었습니다. 이후 ASO 투여 실험에서 사용된 10 μL 주입량은 마우스에서 안전하고 잘 내약되는 용량을 보장하기 위해 선택되었으며, 이전 연구에 따르면 적절한 중추신경계 노출을 제공할 것으로 기대된다38.

이 해부학적 검증을 바탕으로, 우리는 SOD1-ALS 모델에서 검증된 치료 전략인 돌연변이 SOD1을 표적으로 하는 ASO를 이용한 IT 전달의 기능적 관련성을 평가하였습니다. 인간 돌연변이 SOD1 유전자를 보유한 헤미지지거 SOD1-G93A 형질전환 마우스는 예측 가능한 운동 신경 퇴행과 신경근 감소를 보여 확립된 전임상 모델입니다. 생후 5주 때, 증상 발현 전에 쥐들은 SOD1 특이적 ASO를 100 μg 농도의 10 μL에 단일 IT 볼루스를 투여받았습니다. 이 용량은 McCampbell 등(2018)이 보고한 ICV 투여를 이용한 이전 최적화 연구를 바탕으로 선정되었습니다. IT와 ICV 투여의 효능을 비교하기 위해, 별도의 그룹이 동일한 ASO 용량의 ICV 주사를 입체 유도 방식으로 받았습니다. 관제팀은 IT 경로를 통해 비활성 ASO(비표적 통제)를 받았습니다.

치료 5주(생후 10주)에 쥐들은 가벼운 이소플루란 마취 하에서 복합 근활동전위(CMAP) 검사를 받았습니다. 표준화된 좌골신경 자극 프로토콜로 유도된 뒷다리 근육의 CMAP 기록은 IT 및 ICV 치료 그룹 모두에서 비활성 ASO 처리 대조군에 비해 진폭이 유의미하게 보존되었음을 보여주었다(Tukey's 사후 검사를 통한 일방향 ANOVA < 0.0001). 중요한 점은, 진폭 보존이 IT와 ICV 전달 방식 간에 유의미하게 차이가 없었다는 점(p > 0.05)으로, 이는 유사한 신경근 보호 효과를 시사합니다(그림 2A).

신경 완전성을 나타내는 전신 바이오마커를 평가하기 위해, 고감도 전기화학발광 분석법을 사용하여 인산화된 신경섬유 중쇄(pNFH) 혈청 농도를 측정하였습니다. 주사 후 5주 시점에 채취된 혈액 샘플은 ASO 처리 마우스에서 차량 처리 대조군에 비해 pNFH 농도가 >40% 감소한 것으로 나타났으며(p < 0.0001), IT와 ICV 방식 간 유의한 차이는 관찰되지 않았습니다(그림 2B). 균일한 분자 바이오마커 반응은 전기생리학적 데이터를 뒷받침하며, IT 전달이 이 ALS 모델에서 신경퇴행성 과정을 효과적으로 완화함을 시사합니다.

분자 수준에서 SOD1-ASO의 표적 참여를 평가하기 위해, 해리된 경추 및 흉추 척수 조직에 대해 역전사 정량 PCR(RT-qPCR)을 수행하였습니다. 총 RNA는 컬럼 기반 프로토콜을 사용하여 높은 순도(A260/A280>1.8)를 추출한 후, 무작위 헥사머 프라이밍을 이용한 cDNA 합성이 이루어졌습니다. GAPDH로 정규화된 인간 SOD1 전사체를 표적으로 한 정량적 PCR 증폭은 IT 전달 후 평균 60%, ICV 전달 후 35%의 다운 효과를 보였으며, 이는 비활성 ASO 대조군에 비해 유의미한 수치였다(양쪽 모두 p < 0.0001). 전달 경로 간 직접 비교 결과, IT 전달 시 유의하게 더 큰 낙추 효과가 나타났으며(p < 0.0001), 척수 직접적 접근을 통한 척수 내 표적 참여가 더 효과적임을 시사한다(그림 3). 다른 중추신경계 영역에서의 표적 참여를 평가하기 위한 추가 연구가 필요합니다.

이 종합적인 데이터는 IT 주사가 마우스 모델에서 중추신경계(CNS)에 ASO를 전달하는 정밀하고 재현 가능하며 최소 침습적인 기술임을 설득력 있게 입증합니다. IT 투여는 신경 기능 지속적 보존(CMAP), 질병 관련 바이오마커(pNFH)의 정규화, 표적 중추신경계 영역 내 인간 SOD1 전사체의 강력한 분자 녹다운 등 광범위한 결과 측정에서 ICV 전달과 동등한 치료 효능을 입증했습니다. 이러한 발견은 IT 전달이 CNS 표적 ASO 치료제의 임상적으로 번역 가능한 경로로서 ICV와 동등한 효능을 제공하면서도 절차적 단순성과 침습성이 감소함을 강조합니다. 따라서 IT와 ICV 전달은 CNS 표적 중재에 있어 동등하게 실현 가능한 접근법으로, 해부학적 접근성, 시술적 실현 가능성, 치료 맥락에 따라 전임상 환경에서 유연성을 제공합니다. 이로 인해 IT 딜리버리지는 미래 CNS 표적 치료에 유망한 번역 플랫폼으로 자리매김하고 있습니다. 번역 연구를 지원하기 위해, 우리는 뇌척수액 내 약동학적 분포, 다양한 중추신경계 영역, 표적 세포 흡수를 평가하기 위한 추가 전임상 연구를 형광 제자리 하이브리다이제이션이나 면역형광 기법과 같은 기법으로 수행할 것을 제안합니다.

그림 1
그림 1: 성체 쥐에서 테스칼 내 주사 후 에반스 블루 염료 분포의 시각화. 성체 마우스에 Evans Blue 염료(0.5%)를 직접 수막 내 주사(IT)로 투여하여 척수 분포를 질적으로 평가하였습니다. 각각 20 μL, 30 μL, 50 μL 세 가지 염료 부피가 별도의 실험군(n = 부피당 1마리)으로 투여되었습니다. 주사 후에는 척수를 채취하여 조직 전체의 염색 강도를 기준으로 염료 침투 여부를 평가했습니다. 척수 조직 이미지는 각 주입량마다 염료 확산 정도를 보여주며, 용량에 따라 척수 전반에 걸쳐 덮개와 염색 강도가 증가함을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 2
그림 2: SOD1 표적 안티센스 올리고뉴클레오타이드 치료는 쥐에서 운동 기능을 회복하고 병리적 신경섬유 수치를 감소시킵니다. 성체 SOD1-G93A 형질전환 마우스는 5주 주에 뇌간부(IT) 또는 뇌실내(ICV) 주사를 통해 활성 SOD1 표적 안티센스 올리고뉴클레오타이드(SOD1-ASO)를 단일 접종하거나, IT 주사를 통한 비활성 대조군 ASO를 투여받았습니다. 치료 효과는 치료 후 5주에 해당하는 생후 10주에 평가되었습니다. (A) 복합 근활동전위(CMAP) 기록을 통해 치료된 동물의 신경근 기능을 평가하였다. SOD1-ASO 처리 그룹(n=5 - 6개)은 대조군에 비해 CMAP 감소가 역전되어 기능 회복을 나타냈다. (B) 신경퇴행의 바이오마커인 인산화 신경섬유 중사슬(pNFH)의 말초 수준을 10주차에 채취한 혈청에서 정량화하였다(그룹당 n = 5 - 8개). SOD1-ASO 치료는 대조군에 비해 순환 pNFH 수치가 유의미하게 감소하여 질병 관련 신경 손상의 완화를 시사하였다. 모든 데이터는 평균 ± SD로 제시됩니다. 통계적 유의성은 일방향 분산분석(ANOVA)과 이어서 Tukey의 다중 비교 검정을 사용하여 산출되었으며, p값 ≤ 0.0001은 치료 그룹 간 강인한 차이를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 3
그림 3: SOD1-ASO 투여는 형질전환 중인 SOD1-G93A 마우스 척수에서 인간 SOD1 mRNA 발현을 유의미하게 억제합니다. 소모 1-G93A 형질 전환 마우스의 척수 조직 자궁경부/흉부 절편을 역전사 정량 중합효소 연쇄반응(RT-qPCR)을 이용한 소드1-G93A 형질전환 마우스의 척수 조직 자궁경부/흉부 절편을 역전사 정량 중합효소 연쇄반응(RT-qPCR)을 이용해 뇌 척수 조직의 표적 효율을 평가하기 위해, IT(IT) 또는 뇌실내(ICV) 주사를 통해 전달하였습니다. 비활성 ASO 처리군에서 인간 SOD1 전사체 수준은 발현과 비교해 정량화되고 정규화되었습니다. 그림은 각 처리군(n=5-7마리)에서 인간 SOD1 mRNA(GAPDH로 정규화됨)의 접힘 변화를 보여주며, SOD1-ASO 투여에 대한 반응에서 상당한 하향 조절을 보여줍니다. 데이터는 SD± 평균으로 제시됩니다. 그룹 간 통계적 차이는 일방향 분산분석(ANOVA)을 사용해 산출한 후 Tukey의 다중 비교 검정을 사용했으며, p값 ≤ 0.0001은 치료 그룹 간 강력한 차이를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

구성 요소FW추가량 (L 또는 kg당 기준)부대
인산나트륨 단염성 이수화물0.034g
무수인산이염기나트륨1420.111g
염화나트륨58.448.766g
염화칼륨74.560.224g
염화칼슘 이하이드레이트147.020.206g
염화마그네슘 육수화물0.163g
물 (밀리-Q)993g
폴록사머 1880.01g

표 1: aCSF 구성.

보조 그림 1: 요추 추막내 주사를 위한 마우스 위치. 복부 아래에 놓인 곡선 주걱 또는 스쿠풀라가 척추를 굽히고 추간극을 넓혀줍니다. 주사는 척추의 내측 축을 따라 올바른 정렬을 유지하며 L4-L5 또는 L5-L6 부위를 목표로 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 파일 1: ASO 서열 및 화학. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

토론

여기서 제시된 직접 테스칼 내 주입 기법은 특히 쥐와 같은 소형 설치류 모델에서 중추신경계(CNS)에 치료제를 전달하는 데 매우 효과적인 최소 침습 방법을 나타냅니다. 이 블라인드 스틱 시술은 기술적으로 도전적이지만, 훈련된 주사자가 시행할 경우 재현 가능하고 임상적으로도 적합함이 입증되었습니다. 이 방법은 정밀한 해부학과 효율적인 기법을 활용하여 카테터삽입 없이도 신속한 중추신경계 접근을 제공하며, 이는 전임상 연구 확장에 중요한 단순화와 상당한 이점을 제공합니다; 그러나 그 번역적 관련성은 추가적인 정량적 평가와 표준화된 방법론적 검증을 통해 향상될 것입니다 5,8,10.

성공적인 IT 인젝션은 여러 핵심 단계에 달려 있습니다. 꼼꼼한 동물 준비가 필수적입니다: 마취는 먼저 챔버를 이용해 유도되고 코 콘으로 유지되며, 이후 요추 부위를 면도하고 진통제를 투여하여 동물의 편안함을 보장합니다. 마우스의 적절한 위치는 복부 아래에 곡선 주걱을 놓고 척추를 굽혀 추간공간을 넓혀 이루어집니다(보완 그림 1). 여기서 설명한 척수막 내 주사의 목표는 바늘의 경사면을 적절한 척추 수준에서 후궁 사이로 밀어 요추 저장소 내에 위치시키는 것입니다. L4와 L5 층 사이의 추간공, 또는 바람직하다면 L5와 L6 층 사이의 정확한 표적을 정확히 표적으로 삼는 것이 지주막하 공간에 접근하는 데 매우 중요합니다 5,10. 지주막하 공간, 또는 척막 내 공간이라고도 하며, 거미막과 39번 피아(pia mater39) 사이에 위치합니다. 척수가 척추관보다 짧기 때문에, 후미 척수 분절은 해당 척추 수위에 비해 앞쪽에 더 위치해 있습니다. 모호함을 피하기 위해 주사 부위는 척수 수준이 아닌 추추간 공간으로 지정됩니다. 특히, 쥐의 요추 분절에는 균주 내외에서 상당한 변이가 존재한다40. 주사는 척추의 중앙선을 따라 시행되어야 하며, 측면 편곡은 후肢 마비나 심한 경우 척수 손상으로 인한 마비로 이어질 수 있습니다. 적절한 해부학적 위치에서 시행될 경우 직접 척수 손상 위험은 최소화됩니다. 그러나 신경근 자극이나 손상의 작은 위험이 남아 있어, 부작용을 최소화하기 위해 적절한 운영자 교육과 절차적 숙련도가 중요함을 강조합니다. 꼬리 튕기는 반사는 바늘 삽입 성공을 나타내는 유용한 지표로, 주사기가 깊이를 가늠하고 피상적이거나 지나치게 깊은 침투를 피할 수 있게 해줍니다. 이 기술은 연습이 필요하며, 역류와 주변 조직으로의 누출을 방지하기 위해 깊이, 각도, 주입량을 꾸준히 조절해야 합니다. 주입량은 ≤10 μL로 유지할 것을 권장하지만, 최대 20 μL까지 부작용 없이 평가한 바 있습니다. 이전 연구들은 약물 전달에 최적의 10 μL 뇌척수내 주사 용량을 확인했습니다38. 이는마우스에서 총 뇌척수액 부피의 25-30%를 차지하지만, 성체 마우스에서 최대 허용 가능한 척막내 주입량은 30 μL10으로 보고되었습니다. 권장 한도를 초과하는 주사 양은 뇌척수액(CSF) 역학을 방해하여 뇌척수액 압력 변화와 부작용 위험 증가를 초래할 수 있습니다. 쥐의 총 뇌척수액 부피는 35-40 μL로 추정되며, 하루 12-13회 회전하여 대략 1.8시간마다 완전한 갱신에 해당합니다. 빠른 뇌척수액 교체와 경험적 관찰, 그리고 20-30 μL까지 뇌막내 주사 용량을 합병증 없이 안전하게 사용할 수 있음을 입증한 이전 연구들을 고려할 때, 10 μL 주사량은 부작용을 일으킬 것으로 예상되지 않습니다10,44.

이 기술의 확장성은 매우 큰 장점입니다. 숙련된 주사기는 시간당 10-12마리의 동물을 치료할 수 있어, 카테터 삽입이나 더 침습적인 수술 절차의 부담 없이 더 큰 전임상 연구를 가능하게 합니다. 이 절차는 복잡한 기구 사용을 피하고, 동물의 스트레스를 줄이며, 만성 카테터 삽입에 비해 회복 시간을 단축하여 반복 투여가 필요한 종단 연구에 적합합니다. 임상 투여 방식을 시뮬레이션하기 위해, 우리는 쥐를 대상으로 최대 4회 8주 간격으로 투여하는 연속 IT 투여를 검증했습니다. 이 주사들은 고통, 행동 변화, 질병 징후 없이 잘 내약했으며, 이전 연구에서 다중 IT 치료 후 뇌척수액 역학이나 척수 구조에 유의미한 변화가 없다고 보고한 것과 일치하였다 34,45. 따라서 우리 연구는 적절한 간격으로 반복 IT 투여가 가능하며, 지속적인 표적 참여가 치료적 이익을 위해 필요한 인간 치료 패러다임과 일치함을 확인했습니다. 저희 경험에 따르면, 이러한 반복 IT 주사는 5주에서 29주까지의 광범위한 연령대에서 성공적으로 시행되었습니다. 나이와 체중이 증가하면 피하 조직이 많아 척수 접근성이 약간 달라질 수 있지만, 기술에 능숙하고 바늘 삽입 감각에 익숙한 숙련된 시술자가 있다면 성공적인 투여는 여전히 가능합니다. 그러나 주입 부위와 볼루스 부피 외에도 주입 속도와 주입 용액의 물리적 특성(예를 들어 CSF에 대한 밀도 등)이 중추신경계 내 용질 분포에 상당한 영향을 미칠 수 있음을 주목합니다. 이 매개변수들은 본 연구에서 직접 측정되거나 조작되지는 않았으나, Linninger 등(2023)의 최근 연구는 기전적 약물동학 모델을 통해 이러한 요인들이 뇌막내 안티센스 올리고뉴클레오타이드(ASO) 생체 분포와 조직 표적에 유의미하게 영향을 미친다는 것을 입증했다46. 따라서 우리는 이 점을 연구의 한계로 인정하며, 주입 속도와 용액 특성을 CNS 전달과 번역적 관련성을 최적화하기 위한 향후 연구의 중요한 변수로 강조합니다. 이 결과들은 다중 도약 전임상 패러다임에서 반복 IT 투여의 신뢰성과 실현 가능성을 강조하며, 지속적인 표적 참여 및 인간 치료 요법의 번역 모델링에 활용될 가능성을 뒷담화합니다.

IT 접근법은 치료 검사에 유연성도 제공합니다. ASOs, 소분자, 펩타이드, 바이러스 매개체 등 다양한 기법을 수용하여 CNS 표적 중재의 직접적인 평가를 가능하게 합니다. 정밀하고 통제된 양의 치료제를 요추 저장고에 전달할 수 있는 능력은 효과적인 척수와 더 넓은 중추신경계 노출을 보장하면서 전신 누출을 제한합니다. 꼬리 튕기는 반사와 기타 절차적 신호는 성공적인 테스칼 내 전달을 실시간으로 검증할 수 있게 하여 재현성을 더욱 높이고 실험실패율을 감소시킵니다. 5, 6, 8, 47.

이전 SOD1-G93A 마우스 연구에서는 이 질환 병리가 특히 요추 부위에 피질보다 두드러지게 영향을 미친다는 것을 보여주었다29,48. 따라서 이 기술은 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 1(SOD1) 유전자의 돌연변이로 인해 발생하는 유전적 형태인 SOD1-ALS 맥락에서 특히 중요합니다. 이 돌연변이는 잘못 접힌 SOD1 단백질 집합체를 생성하여 운동 신경세포 내 기능 증가를 유발하여 신경근 감소를 점진적으로 초래합니다49,50. 본 연구에서는 SOD1 표적 ASO를 사용하여 표적 mRNA와 기능적 회복에 성공적으로 관여함을 입증하였습니다. RT-qPCR 분석은 IT 투여 후 척수에서 인간 SOD1 전사체가 유의미하게 억제되었음을 보여주었으며, CMAP 기록에서는 운동 신경 기능 장애가 역전되는 것으로 나타났습니다. 더 나아가 혈청 분석 결과 신경퇴행의 바이오마커인 인산화 신경섬유 중쇄(pNFH) 수치가 감소하여 치료 전략의 효능을 뒷받침하였습니다.

이 모델의 임상적 관련성은 SOD1-ALS35 치료를 위해 SOD1 mRNA를 표적으로 하는 ASO인 tofersen(QALSODY)® 의 최근 FDA 승인으로 강조됩니다. 토퍼슨은 SOD1-ALS 환자에게 간수내 투여되며, 총 CSF SOD1 단백질 수치(표적 참여의 간접 표지자)와 혈장 NfL(축삭 손상 및 신경퇴행 지표) 감소 등 명확한 약리역학적 활성을 보였습니다. 3상 VALOR 연구와 그 OLE 통합 분석에서, 토퍼센 치료를 조기 시작한 것이 임상 기능, 근력, 삶의 질 지표 감소와 사망 등가 사건 위험 감소와 관련이 있었습니다35. 이 데이터는 뇌골 내 경로가 중추신경계 표적 ASO 치료의 강력한 경로임을 입증하며, 유사한 전달 전략을 사용하는 전임상 연구에 강력한 중개 효과를 제공합니다.

ALS에서의 유용성 외에도, IT 경로는 척수근위축증(SMA)에서 성공을 입증했으며, IT 투여 ASO Nusinersen(Spinraza®)이 최초로 승인된 치료제였습니다. IT 주사는 혈액-뇌 장벽을 우회하여 광범위한 중추신경계생체 분포를 가능하게 하며, 이는 확산성 신경 병리를 특징짓는 질환에 매우 중요합니다. 반복 투여는 물류와 내약성에 어려움을 주지만, 제형과 전달 기술의 발전으로 IT 투여가 장기 치료에 더 적합해지고 있습니다.

IT 투여는 ICV 주사보다 인간 임상 실무에 더 큰 번역적 관련성을 제공합니다. 성체 마우스에서의 ICV 및 IT 주사는 주로 중추신경계 내 목표 위치와 투여 물질의 분포 및 효과에서 차이가 있습니다. ICV 주사는 주로 척추상부를 목표로 뇌측심실 내 뇌척수액(CSF)에 물질을 직접 전달합니다. 반면, IT 주사는 척수 지주막하 공간 내 뇌척수액에 물질을 전달하며, 주로 척수를 표적으로 합니다. 두 방법 모두 혈뇌장벽을 우회하여 직접 중추신경계 전달을 가능하게 하지만, 일부 화합물에서는 IT 투여가 작용 지속 시간을 더 길게 만들 수 있으며(54) 일반적으로 척수 내 전도가 더 강해지는 반면, ICV는 측심실 인접 뇌 영역에서 국소 농도를 높일 수 있습니다54. 하지만 척수액에 투여된 화합물은 뇌에 도달할 수 있으나, 수송 속도는 매우 느립니다. 이러한 차이는 절차적 위험에도 반영됩니다. ICV 주사는 무균성이 훼손될 경우 오염 가능성이 더 높으며, IT 주사는 위험이 완전히 없는 것은 아니지만 기기 관련 취약성은 적습니다. 수술 후 IT 주사는 일시적인 불편함이나 하지에 대한 반응을 유발할 수 있지만, ICV 주사는 즉각적인 불편함이 적으나 국소적인 두개골 자극은 여전히 가능합니다.

이 기술의 향후 적용은 현재의 전임상 연구를 넘어 확장됩니다. IT 전달은 차세대 CNS 표적 치료제, 예를 들어 유전자 편집 도구(예: CRISPR/Cas 시스템), RNA 간섭 방식, 바이러스 벡터 기반 유전자 치료 등을 평가하는 데 활용될 수 있습니다. 이 접근법은 여러 중추신경계 경로를 표적으로 하는 복합 요법에 적응할 수 있어 약리학적 상호작용의 실시간 평가를 가능하게 합니다55,56. 더 나아가, IT 관리는 영상 기법과 통합되어 분포 추적과 생체 내 표적 참여를 추적할 수 있어 번역 파이프라인을 가속화할 수 있습니다. 이 기법은 또한 신경 질환의 유전적으로 정의된 마우스 모델 전반에 걸쳐 정밀 의학 전략을 연구할 수 있는 플랫폼을 제공하여, 바이오마커 발견, 종단적 기능 평가, 임상 번역 전 안전성 평가를 용이하게 합니다.

결론적으로, 이소플루란 마취를 이용한 직접 요추 IT 주사 기법은 최소 침습적이고 신속하며 임상적으로 번역 가능한 치료제를 쥐 중추신경계에 전달하는 방법입니다. SOD1-ALS 모델에서의 성공적인 적용과 직렬 투여와의 호환성은 중개 신경과학 연구에서의 광범위한 활용을 위한 강력한 토대를 제공합니다. CNS 유전자 조절, RNA 표적 치료, 정밀 의학에 대한 강조가 커지면서 IT 경로는 전임상 모델과 임상 성공을 연결하는 핵심 약물 전달 전략으로 남을 것입니다.

공개 사항

SM과 S-C L은 현재 Biogen, Inc.의 직원이며, TC, DF, YL, JD, MZ는 전 직원입니다. 이 글에서 논의한 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 Ionis Pharmaceuticals에서 저자들에게 제공되었습니다. 토퍼센(QALSODY)은 바이오젠과 아이오니스 제약이 공동 개발한 제품입니다.

감사의 글

기사에서 설명한 ASO를 공급해 주신 Ionis Pharmaceuticals에 감사드립니다. Biogen의 라이언 갬블, 스티브 가라팔로, 아드리아 마르티그, 이사벨 이사자, 타라스 투츠케비츠, 데이비드 코스케 씨의 전문적인 기여에 감사드립니다. 이들은 실질적인 수정을 통해 원고를 크게 향상시켰습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.3 mL 29 G 1/2인치 인슐린 주사기 IT 주사용스미스 메디컬4429-3
직경 0.5 mm 멸균 드릴 버파인 사이언스 툴스(FST) 또는 이에 상응하는 기관1900705
5-0 프로린 모노필라멘트 봉합사에티콘 8870H 
알코올 면봉 검사다이나렉스1203
알코올 면봉 검사다이나렉스1203
진통제 - 부프레노르핀 서방형처방전 필요
동물 클리퍼발08787-450A
응용 바이오시스템 대용량 cDNA 역전사 키트피셔 사이언티브43-688-14
비드 러프터 24 호모제나이저옴니 인터내셔널, 주식회사19-070
혈액 채취 및 혈청 분리관벡턴 디킨슨 (BD)365967
염화칼슘 이하이드레이트JT 베이커1335
디지털 주사기 펌프하버드 장치70-4507
엘라 자동 면역분석 시스템R& D 시스템즈600-100
눈 연고-푸라루브데크라17033-211-38
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야생형 C57BL/6J 마우스잭슨 연구소스톡 # 000664

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