Caenorhabditis Elegans L4 유충 전체에서의 염색질 접근성 프로파일링

요약

여기서는 30 μL 벌레 펠릿만을 사용하여 L4 단계 Caenorhabditis elegans 전체충에 구현할 수 있는 빠르고 간단한 ATAC-seq 프로토콜을 제시합니다.

초록

염색질 접근성은 전사, DNA 수리, 염색체 분리에 중요한 역할을 합니다. 과접근 영역은 보통 활성 프로모터 및 증강자와 상관관계를 맺어 전사 인자 결합과 조절 활동을 촉진합니다. 시퀀싱을 이용한 전이분해효소 접근 가능한 염색질 분석법(ATAC-seq)은 매우 적은 세포로 염색질 접근성을 전장적으로 프로파일링할 수 있게 합니다. 그러나 Caenorhabditis elegans 에서의 적용은 선충의 풍부한 콜라겐 큐티클 때문에 세포 해리가 복잡해집니다. 여기서는 L4 단계에서 전체 벌레에서 ATAC-seq를 수행하기 위한 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 시술은 동기화된 배양에서 시작하여 큐티클 파괴, 효소 해리, 세포 현탁 준비를 포함합니다. 투과화된 핵은 이후 Tn5 전치를 거쳐 중합효소 연쇄반응(PCR) 증폭 및 차세대 시퀀싱(NGS) 준비 라이브러리의 정제를 거칩니다. 이 프로토콜은 30 μL의 웜 펠릿을 필요로 하며, 하루 만에 완료할 수 있고, 브리스톨 N2 기준 균주에서 5,000–9,000개의 접근성 피크를 생성합니다. 이 간소화된 워크플로우는 다른 발달 단계나 FACS로 정제된 세포 집단에도 적용할 수 있습니다. C. elegans에서 ATAC-seq에 대한 기술적 장벽을 줄임으로써, 이 방법은 유전적 및 환경적 교란에 반응하는 전체 유전체 염색질 접근성을 전체 생물체 맥락에서 연구할 기회를 확장합니다.

서론

진핵생물 게놈은 세포 핵 안에 밀집되어 있습니다. 공간적 제약을 극복하기 위해 DNA는 뉴클레오좀을 단단히 감싸는데, 이는 8개의 히스톤으로 구성된 다단백질 복합체로, 서로 다른¹문에 걸쳐 매우 보존되어 있습니다. 염색질 접근성 패턴은 조직 내 세포 상태와 유전자 특이적 패턴에 따라 달라집니다 ^2,3,4. 뉴클레오좀 접근성은 특히 전^{사 인자}에 접근할 수 있는 프로모터 및 원위 조절 영역(예: 증강체)에서 활성 전사와 강한 상관관계를 보인다. 개방 염색질 영역은 DNA 수리, 복제, 염색체 분리에서도 중요한 역할을 합니다^. 반면, 접근성 감소는 보통 침묵된 이색질과 반복 서열과 상관관계가^{있습니다.}

크로마틴 접근성 지도화는 유전자 조절을 이해하는 데 강력한 접근법이었습니다. 염색질 접근성을 조사하기 위해 다양한 기법이 사용되어 왔습니다. 초기 방법 중 하나는 미세코칼 뉴클레아제(MNase)와 DNase I 소화를 사용하여 특정 유전자 ^8,9에서 뉴클레오좀 위치와 접근성을 지도화하는 데 사용되었습니다. 이 기법들은 이후 차세대 시퀀싱(NGS)^10,11과 결합되어 유전체 연구에 적용되었습니다. 그러나 이러한 기법들은 성공적인 구현을 위해 효소 농도와 반응 시간, 그리고 상당한 수의 세포를 신중하게 보정해야 합니다.

2013년 그린리프 연구실은 적은^{수의 세포를} 사용해 유전체 수준에서 염색질 접근성을 매끄럽게 매핑하는 ATAC-seq(ATAC-seq)를 이용한 전이체 접근 가능 염색질 분석 방법을 확립했습니다. ATAC-seq는 상업적으로 이용 가능한 Tn5 전위효소를 활용하여 짧은 DNA 서열(즉, 바코드)을 일반적으로 뉴클레오좀이 없는 개방 염색질 영역에 우선적으로 삽입하며, 활성 프로모터 및 증강자와 상관관계를 맺습니다. 프로토콜은 세포 투과와 핵 분리를 요구하며, 이후 Tn5를 이용한 제한적 소화를 통해 과접근 염색질 표지화를 진행합니다. 이후 PCR 과정에서 상보적 인덱스가 삽입되어 NGS¹³ 이전에 샘플 다중화를 용이하게 합니다. ATAC-seq는 실리코 전사 인자 발자도 가능하게 하는 견고한 프로토콜임이 입증되었으며, 단일 세포 해상도 14,15,16,17에 구현되었습니다. 쥐와 인간 샘플 외에도 ATAC-seq는 제브라피시와 초파리, 선충 Caenorhabditis elegans^{18, 19, 20}과 같은 무척추동물 등 다양한 시스템에 적용되었습니다.

수십 년간 C. elegans는 발달, 세포생물학, 신경과학 등 분야에서 강력한 모델 시스템으로 자리 잡았으며, 미세 RNA와 RNA 간섭(RNAi) 등 획기적인 발견을 이끌어냈다^21,22. 이 유전자는 100MB의 컴팩트한 유전체와 ~20,000개의 단백질 암호화 유전자를 가지고 있습니다²³. 유전자 조절은 프로모터 활동과 원위 증강자를 통해 이루어지며, 이는 ATAC-seq를 통해 다양한 조직, 발달 단계, 노화 시점에 걸쳐 지도화되었습니다^24,18. 따라서 염색질 접근성 프로파일링은 C. elegans에서 유전자 조절을 이해하는 데 귀중한 도구가 되었습니다. 따라서 ATAC-seq는 다양한 환경 조건이나 야생 분리주에서 후생유전학적 경관을 연구하여 다양한 전사 반응을 밝혀내는 데 특별한 가능성을 지니고 있습니다. 또한, 다른 병원성 및 비병원성 선충의 염색질 구조에 대한 통찰도 제공할 수 있습니다.

C. elegans의 주요 방법론적 도전 중 하나는 콜라겐이 풍부한 큐티클의 존재로, 전체 기생충에서 균질한 세포 현탁물을 얻기 위해 해리되어야 한다는 점입니다²⁵. 이 문제를 해결하기 위해 선충을 분해한 후 C. elegans^18,26에서 ATAC-seq를 수행하는 다양한 프로토콜을 편집하고 최적화했습니다. L4 유충 단계를 사용하는 것이 선호되는데, 이 발달 시점의 동물들은 전사 활성 생식계를 가지고 있어 개방 염색질로 변환되어 체세포에서 염색질의 접근성을 일관되고 유익하게 제공합니다. 여기서는 C. elegans에서 ATAC-seq를 가능하게 하는 기생충 해리 및 세포 현탁 생성을 위한 빠르고 효율적인 프로토콜을 제시합니다. 저희 방법은 L4 단계 벌충에 최적화되어 있으며, 최대 30 μL의 벌레 펠릿만 필요하고, 다른 발달 단계나 FACS 정제 세포와 같은 소규모 샘플에도 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 다양한 C. elegans 균주와 조건에서 수행할 수 있어, Bristol-N2 참조 균주에서 5,000–9,000개의 염색질 접근성 피크를 식별할 수 있게 하여 이후 염색질 접근성 분석의 기초를 마련합니다.

프로토콜

항상 장갑을 착용하는 것이 권장됩니다.

참고: 1일차: 동기화된 벌레 개체군 준비 중. 모든 벌레는 대 장균 OP50을 씨앗 채운 NGM 플레이트에서 배양되었습니다. 시작하기 전에 필요한 것들: (샘플 또는 균주별로 기준), 90mm 또는 60mm 성충 판 2개, 사료가 포함된 90mm 또는 60mm 판 2개, M9 멸균 완충제²⁷ (3g KH₂PO₄, 6g Na₂HPO₄, 5g NaCl, 1ml 1 M MgSO₄, H₂O 대 1L. 오토클레이빙으로 멸균)

1. 지렁이 수집

1. 90mm(또는 30mm) 판 두 개를 잡고 벌레 개체군을 모으세요.
2. 벌레를 M9 버퍼로 회수하여 15mL 원심분리관으로 옮깁니다.
3. 이전 단계를 반복하여 판에서 모든 웜을 회수하세요.
4. 벌레가 15mL 튜브 안에 잠시 가라앉게 한 후 조심스럽게 M9 버퍼를 제거하세요.
5. 반드시 ~1mL의 벌레를 준비하세요.

2. 표백

1. M9 완충제 5mL + NaOH 650 μL 5M + 가정용 표백제 1,300 μL (NaClO 5% 용액)을 추가합니다.
2. 최대 속도로 1–2분(최대 2.5분 이하) 소용돌이.
3. 1,000 x g 에서 실온(RT)에서 1분간 원심분리기를 사용하세요.
4. 상원액을 제거하고 9mL의 M9 완충액을 추가하세요.
5. 2.3과 2.4 부분을 다섯 번 더 반복하세요.
6. 배아를 7mL의 M9 완충제에 재현탁하세요.
   참고: 표백 프로토콜은 온도, 상업용 표백제 종류에 따라 효율이 다를 수^{있습니다.}

3. M9(액체) 밤사이에 알이 부화하는 모습

1. 표백된 알이 담긴 채집관이 제대로 닫혀 있는지 꼭 확인하세요.
2. 튜브를 20°C의 느린 움직임으로 넣으세요(예: 20°C의 방 안에서 셰이커에 넣는 식으로).
3. 벌레는 밤새 부화해서 L1에서 멈춥 니다.
   참고: 튜브를 12시간 이상 두지 마세요.

4. 2일차: 구충 성장: 회복 중인 L1 구충.

1. 셰이커에서 튜브를 꺼내 현미경으로 L1 벌레가 있다는 것을 확인해 보세요.
2. 튜브를 약 1시간 동안 RT로 수직으로 가라앉히게 하세요.
3. 상청액을 제거하고 ~300마리의 L1 벌레를 90mm 플레이트 1개 또는 30mm 플레이트 2개에 음식과 함께 옮깁니다.
4. 20°C 인큐베이터에 넣어 26시간 동안 성장시켜 L4 단계에 도달하게 하세요.

5. 3일차: 재고 용액 준비: 다음 용액은 4일차에 신선한 용액을 만들기 위해 준비되어야 합니다

참고: 이 검사는 2일차 또는 3일차에 할 수 있습니다.

1. 10% SDS 1mL.
2. 1M HEPES pH 8 50mL(오토클레이브).
3. 20% 자당 250mL(오토클레이브).
4. 2M NaCl 100mL: 준비(오토클레이브).
5. 2M KCl(오토클레이브) 50mL.
6. 10mL 1M_CaCl2 (오토클레이브).
7. 10mL 1M MgCl2_(오 토클레이브).
8. 1M 트리스 100mL, pH 7.4.
9. 5mL 5M NaCl(오토클레이브).
10. 10% 트윈-20 500 μL
11. 10% Nonidet P40/IGEPAL 500 μL 투여.
12. 5% 디지토닌 100 μL (용해하려면 65 °C까지 가열해야 함).
13. 4 °C에서 보관한 10% BSA(필터 0.22 μm 사용) 500 μL
    4일차: ATAC를 위한 L4 단계 웜
    참고: 시작 전에 25 °C의 인큐베이터, 4 °C 원심분리기 준비, 디지토닌을 65 °C로 가열(신선한 완충 준비용), 멸균 M9 완충제, 멸균 H2O, 20 μm 필터를 준비하세요.

6. 용액 준비

1. 신선한 용액을 준비하세요( 표 1 참조). 항상 L-15, 10% FBS, 알의 버퍼를 멸균 환경에서 다루고 차갑게 보관하세요.

표 1: 신선 용액 준비용 재고. 선충 해리 및 세포 현탁 프로토콜을 위한 스톡 준비 레시피(6, 7절). 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

7. 선충 해리 및 세포 현탁 프로토콜

참고: L4 동기화된 벌레 개체군이 있는 90mm 플레이트 1개 또는 30mm 플레이트 2개가 필요합니다.

1. 20 °C 인큐베이터에서 26시간 후, 현미경으로 대부분의 벌레가 L4 단계에 있음을 확인해 보세요.
2. M9 버퍼로 판에서 모든 벌레를 회수하여 1.5mL 원심분리관에 넣으세요.
3. 중력에 의해 지렁이가 가라앉도록 1mL 멸균 H₂O로 5번 세척하세요.
4. 기생충이 든 튜브를 25°C 인큐베이터에 30분간 옮겨 장 음식물 찌꺼기를 제거하세요.
5. 50 μL 벌레 펠릿을 새 튜브에 넣으세요.
6. SDS-DTT 신선한 버퍼 200 μL을 추가하고 튜브 로테이터에 정확히 5분(그 이상 지속되지 않음)을 혼합합니다.
7. 차가운 계란 버퍼 1mL를 넣고 피코퓨 지에 돌 려 상원액을 제거하세요. 6번 반복하세요.
8. 신선하게 준비한 프로나제 80 μL(15 mg/mL)을 추가합니다.
9. 200 μL 피펫(필터 팁 포함)을 사용해 웜-프로나제 혼합액의 70배를 섞고 RT에서 15분간 배양합니다.
10. L-15 10% FBS 매체 800 μL 추가한 후 500 x g 높이에서 4 °C에서 5분간 원심분리합니다.
11. L-15 10% FBS 배지 1mL를 추가하고 원심분리를 반복합니다.
12. 이전 단계를 두 번 더 반복하세요.
13. 상청액을 제거하고 900 μL L-15 10% FBS 매체에 재현탁합니다.
14. 20 μm 필터로 필터를 사용하세요.

8. 핵 분리 및 염색질 표지화

참고: 피펫 필터 팁을 사용하세요. 시작 전에: Tn5 버퍼를 분리하고 해동시키고, 37°C로 열차단을 설정하고, PCR 제품 정제 키트(재료표)를 꺼내고, EB 버퍼를 37°C에 넣고, 컬럼의 원심분리는 RT에서 수행해야 합니다.

1. 여과된 셀 현탁액을 500 x g , 4 °C에서 5분간 원심분리합니다.
2. 상정액을 제거하고 ~50 μL만 남깁니다.
3. 45 μL Lysis Buffer(신선하게 준비)를 추가하고 조심스럽게 재현탁합니다.
4. 조심스럽게 50μL 세척 버퍼를 추가하세요(혼합하지 마세요).
5. 5분 동안 500 x g , 4 °C에서 원심분리기. 상정액을 제거하세요. 얼음 속에 넣어두세요.
6. 방적하는 동안 각 반응(Rx)을 위해 샘플당 다음 Tn5 혼합물을 준비합니다: 25 μL Tn5 버퍼²⁹, 24.8 μL 무뉴클레아제 H₂O, 0.2 μL Tn5 효소. 여러 샘플을 위한 마스터 믹스를 준비하세요.
7. 원심분리 후 상원액을 제거하세요. 핵은 냉동 보관해. 핵 펠릿에 50 μL Tn5 혼합물을 추가하고 천천히 7회 피펫을 사용하세요. 37°C에서 30분간 열차단기에서 부양하세요. 각 튜브에 10분마다 가볍게 두드리세요.
   참고: PCR 정제 키트를 제거하고 EB 버퍼를 37 °C 인큐베이터에 넣으세요. 다음 5단계는 이 키트의 버퍼를 사용할 것입니다.
8. Tn5 인큐베이션 후, 키트에서 300 μL PB 버퍼(노란색)를 추가하고 최대 속도로 25초 동안 소용돌이를 혼합합니다.
9. 튜브에서 모든 부피를 빼서 스핀 컬럼(보라색, 4 °C에 저장)으로 옮기고, RT 최대 속도로 1분간 원심분리합니다.
   참고: 컬럼에는 DNA가 담겨 있으므로, 상청액은 신뢰할 수 있게 버릴 수 있습니다.
10. 스핀 컬럼에 750 μL PE 버퍼를 추가하고 RT 최대 속도로 1분간 원심분리기를 사용하세요.
11. 상청액은 채취관과 함께 버리세요. 컬럼을 새로운 1.5 mL 튜브에 넣고 원심분리를 반복합니다; 1.5 mL 튜브를 버리세요.
12. 컬럼을 새로 표시한 1.5 mL 튜브에 넣고, 컬럼 중앙에 37 °C의 EB 버퍼 10 μL을 추가합니다. 기둥을 만지지 않도록 주의하세요. RT에 1분간 두세요.
13. RT에서 최대 속도로 1분간 원심분리기; 4°C에서는 절대 안 됩니다.
14. 마지막 두 단계를 반복하여 EB 버퍼에서 총 20 μL 용출을 합니다.
    참고: 선택적 일시정지: 중단 시 샘플은 -20 °C에서 저장할 수 있습니다. 여기서 태그가 부착된 크로마틴은 20 μL 부피에 있습니다.

9. 라이브러리 증폭

1. ATAC 라이브러리 증폭을 위해서는 적절한 사이클 증폭 수를 추정하기 위해 실시간 PCR이 수행되어야 합니다( 표 2 참조). 이 검사는 PCR 플레이트에 시행하세요.
2. 최종 증폭의 사이클 번호를 추정하려면, 증폭 곡선의 첫 3분의 1에 해당하는 사이클 번호를 취해야 합니다. 사이클 수가 15를 넘지 않는 것이 이상적입니다. 각 샘플에 대해 사이클 번호를 추정해야 합니다.
   참고: qPCR 후 태그가 부착된 DNA는 18 μL 용량에 보관됩니다. 선택적 일시정지: 중단을 원할 경우 샘플을 -20 °C에 저장할 수 있습니다.
3. ATAC 도서관 최종 증폭:
   1. 각 샘플마다 다른 Rv 프라이머가 있어야 합니다(메모하세요).
   2. 각 샘플은 추정된 사이클 번호(N)에 대해 증폭되어야 합니다.
   3. 이 PCR은 200 μL 튜브에서 수행합니다( 표 3 참조).
   4. 여기에는 8 μL의 태그가 부착된 DNA와 50 μL의 증폭된 ATAC 라이브러리가 있습니다
   5. 선택적 일시정지: 중단을 원할 경우 샘플을 -20 °C에 보관할 수 있습니다.

표 2: 첫 라이브러리 증폭 지침. 첫 라이브러리 증폭을 위한 레시피 및 PCR 프로그램(섹션 9). 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

표 3: ATAC 라이브러리 최종 증폭 지침. 최종 라이브러리 증폭을 위한 레시피 및 PCR 프로그램(섹션 9). 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

10. 도서관 정화

참고: 시작하기 전에 크기 선택 비즈(AMPure, SPRIselect, 또는 수제 보정 비즈)를 냉장고에서 꺼내 상온에 적응시키세요. 사용 전에 매번 보텍스를 이용해 비즈를 격렬하게 섞으세요.

1. 80% 에탄올(분자급) 1mL를 준비하세요.
2. 샘플 튜브(50 μL가 있는 곳)에 25 μL(0.5 vol)의 구슬을 추가하고 피펫과 혼합합니다.
3. RT에서 10분간 부양하세요.
4. 튜브를 자석 선반에 5분간 넣으세요.
5. 상원액(70 μL)을 새 깨끗한 200 μL 튜브로 옮깁니다.
   참고: 이 단계에서는 <200 bp DNA 조각을 폐기합니다.
6. 65 μL (1.3볼륨) 구슬을 넣고 10번 섞습니다.
7. RT에서 10분간 부양하세요.
8. 튜브를 자석 선반에 5분간 넣으세요.
9. 상청액은 (자기 랙에서 튜브를 빼지 않고) 버리세요.
   참고: 현재 구슬들은 >200 bp와 <1000 bp DNA 조각을 담고 있습니다.
10. 튜브가 자기 랙에 있는 상태에서 비즈 위에 새로 준비된 80% 에탄올 200μL을 직접 넣고 여러 번 위아래로 피핑해 세척합니다.
11. 에탄올을 제거하고 200 μL 에탄올로 반복 세척합니다.
12. 에탄올은 버리고 뚜껑을 열고 구슬을 2~5분 정도 말리세요(너무 많이 말리지 마세요).
13. 샘플을 자기 랙에서 꺼내세요. 멸균_H2O 50 μL 액체에 다시 현탁하세요. 튜브 벽에 있는 모든 구슬을 씻어내세요.
14. 마지막으로, 튜브를 자기 선반에 5분간 인큐베이팅하세요.
15. 상정액을 새 깨끗한 튜브로 옮기세요. 여기에는 증폭되고 정제된 ATAC 라이브러리가 보관되어 있습니다.
    참고: 도서관은 -20°C에서 단기간(최대 4주까지) 또는 -80°C에서 장기간 보관할 수 있습니다.

11. 조각 크기 분포

1. 최종 증폭이 완료되면 샘플 일부를 모세관 전기영동에 통과시켜 조각 크기 분포 패턴을 확인하는 것이 좋습니다.

결과

표지 부착 후 품질 관리를 통해 정확한 라이브러리 준비가 보장됩니다
프로토콜 중에는 염색질 표지 부착 후 수행되는 qPCR(9절)에 특별한 주의를 기울여야 하며, 이는 DNA 품질과 실험 수행 능력을 평가하는 데 매우 중요한 단계입니다. 그림 1A 는 두 개의 증폭 곡선을 보여줍니다; 왼쪽 영상(15사이클 미만)은 지금까지 모든 것이 성공적이었음을 보여주는 좋은 품질의 자료이므로 계속해도 괜찮습니다. 오른쪽 곡선(그림 1A)은 품질이 낮은 재료를 보여주므로, 이 샘플은 계속해서는 안 됩니다. 다음으로 주목할 점은 라이브러리의 증폭 및 정제 후에 분편 길이 분포를 평가하기 위해 모세관 전기영동을 수행하는 것이 권장된다는 것입니다. 전위된 DNA를 정확히 검증하기 위해서는 핵체체 패턴에 해당하는 조각들을 보여줘야 합니다: ~150 bp(단핵체), ~300 bp(이중염기체) 등(...

토론

여기서는 전체 L4 단계 Caenorhabditis elegans 벌레에서 ATAC-seq를 이용한 유전체 전체 염색질 접근성 프로파일링을 위한 최적화된 프로토콜을 설명합니다. 염색질 접근성은 유전자 발현, DNA 수리, 복제 및 재조합에 직접적인 영향을 미치며, ATAC-seq는 세포 및 조직 샘플의 표준 접근법이 되었지만, 특히 불투과성 콜라겐이 풍부한 큐티클을 가진 선충에서 온전한 생물체에 적용할 때는 독특한 기술적 도전 과제가 있습니다. 동시에, 전체 생물체 분석은 전 세계적인 후생유전학적 반응을 포착할 수 있는 독특한 기회를 제공합니다. 저희 방법은 소수의 동기화된 L4 단계 벌레에서 벌레 해리, 투과화, 핵 준비, 염색질 표지화 및 라이브러리 준비를 정교하게 처리함으로써 이러한 도전 과제를 해결합니다. 이 프로토콜은 하루 또는 이틀 만에 완전히 수행할 수 있으며 여러 샘플을 병렬로 처리할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
250 mL, 0.22 µm PES	Ultra Curz	sc-200253
Agar	BD	214010
Agencourt AMPURE XP	Nalgene	A63886
Bovine Serum Albumin	Maplica	200100
Calcium Chloride	Sigma	C5670-100G
CellTrics 20 µm	Sysmex	04-0042-2315
Cholesterol	Sigma	C8503-25G
Digitonin	Sigma	D141-500 mg
Disposable gloves	Microflex	94-243
DL-Dithiothreitol	sigma	D0632-10G	유해
Ethyl alcohol, pure	Sigma	1003661421
Fetal Bovine Serum	biowest	S181S-500
HEPES	Sigma	H3375-250 G
Illumina Tagment DNA Enzyme and Buffer (large Kit)	Illumina	20034211
Kapa Syber 50 mL	Sigma	KK4618
L-15 Medium (Leivobitz)	sigma	L4386-10L
Magnesium Chloride anhydrous	Sigma	M8266-100G
Magnesium Sulfate Heptahydrate	Sigma	M1880-500G
Magnesium Sulfate Heptahydrate	Sigma	M1880-500G
MinElute PCR Purification Kit (50 preps)	Qiagen	28004
NEBNext® High-Fidelity 2X PCR Master Mix	NEB	M0541S
Nonidet P40 Substitute	Sigma	74835-1L
Pen Strep	Gibco	15140-122
Peptone	BD	211677
Petri dish 60 mm	Tritech	T3308
Petri dish 90 mm	Interlux	C9015-2C
Pipet tips 10 µL, filter	Cellpro	800108
Pipet tips 20 µL, filter	Cellpro	800708
Pipet tips 200 µL, filter	Cellpro	800608
Potassium Chloride	Sigma	P9541 -500G
Potassium Phosphate Dibasic Powder	J.T. Baker	3252-01
Potassium Phosphate Monobasic, Crystal	J.T. Baker	3246-01 500G
Sodium Chloride	JT Baker	3624-01
Sodium dodecyl sulfate	sigma	L4509-100G
Sodium Hydroxide	Macron	7708-10
Sodium Hypochlorite	Cloralex	544394479
Sodium Phosphate Dibasic 7-Hydrated Crystal	J.T. Baker	3824-01
SPRIselect	Beckman	B23318
Sucrose	Sigma	S0389-500G
Syringe Filter PVDF 0.22 µm	Ultra Curz	Sc-358812
Trizma base	Sigma	T1503 1KG
Tween 20	Sigma	P9416-50ML