신장 이식에서 급성 항체 매개 거부반응의 쥐 모델 확립

요약

이 글은 신장 이식에서 급성 항체 매개 거부반응(AAMR) 모델을 구축한 사례를 설명합니다. 이 모델은 신장 이식 14일 전 기증자 브라운 노르웨이 쥐의 피부 이식으로 수혜자 루이스 쥐를 감각화하여 유도하여 AAMR 병태생리를 연구할 수 있는 견고한 기반을 제공합니다.

초록

급성 항체 매개 거부반응(AAMR)은 신장 이식에서 장기 이식편 생존에 큰 장애물로 남아 있습니다. AAMR의 병태생리는 주로 보체 활성화를 유발하는 기증자 특이항체(DSA)에 의해 주도되며, 이로 인해 내피세포 손상, 혈관염, 이식편 기능 장애가 발생합니다. 면역억제 치료의 발전에도 불구하고 AAMR 치료는 여전히 최적이 아닙니다. 따라서 AAMR의 신뢰할 수 있는 동물 모델 개발은 그 메커니즘을 이해하고 잠재적 치료 개입을 평가하는 데 매우 중요합니다. 본 연구에서는 신장 이식 14일 전 기증자 브라운 노르웨이 쥐 피부 이식으로 수혜자 루이스 쥐를 감작시켜 AAMR 쥐 모델을 구축하였습니다. 연구 기간 동안 면역억제제는 투여되지 않았습니다. 생존 분석 결과, 전감각화된 동종 그룹은 비전감기군에 비해 이식편 생존율이 유의하게 감소한 것으로 나타났습니다(6.2 ± 1.1 d 대 10.0 ± 0.7일, P < 0.001). 혈청 DSA-IgG 수치는 피부 이식 후 7일째부터 유의하게 증가하여 신장 이식 후 5일째까지 계속 상승했으며, 혈청 DSA-IgM 수치는 피부 이식 후 7일째와 14일째에 유의미하게 증가했습니다. 신장 이식 6시간부터 동종 이식편들은 사구체염, 세수관 주위 모세혈관염, 모세혈관 내 C4d 침착 징후를 보이기 시작했습니다. 신장 이식 3일째부터 상당한 동종 이식 손상과 난관 괴사가 관찰되었습니다. 이러한 변화는 시간이 지남에 따라 점차 악화되었으며, 모두 AAMR의 특성과 일치합니다. 이 모델은 AAMR의 주요 특징을 효과적으로 요약하여 향후 기저 기전과 잠재적 치료법에 대한 연구를 위한 견고한 기반을 제공합니다.

서론

신장 이식(KT)은 말기 신장 질환에 대한 중요한 치료 접근법이 되었습니다 ^1,2. 그러나 이식 거부 반응은 신장 동종 이식편의 장기 생존에 영향을 미치는 주요 요인으로 남아 있습니다 ^3,4. 임상적으로 관찰되는 주요 거부 반응 유형은 급성 거부(AR)와 만성 거부(CR)입니다. 급성 거부 반응은 급성 T 세포 매개 거부 반응(TCMR)과 급성 항체 매개 거부반응(AAMR^)으로 추가로 분류됩니다^5,6,7. 최근 몇 년간 면역억제제의 개발 및 적용으로 TCMR 발생률이 효과적으로 통제되고 있습니다. 그러나 AAMR은 여전히 동종 이식 기능 장애의 주요 원인 중 하나입니다 ^8,9.

AAMR의 병태생리는 이식 전후로 생성되는 기증자 특이적 항체(DSA)에 의해 유발되는 것으로 널리 알려져 있습니다¹⁰. DSA가 동종이식편의 혈관 내피세포에 항원에 결합하면, 고전적인 보체 연쇄반응이 활성화되어 막 공격 복합체가 형성되고 이에 따른 동종 이식 손상이 발생한다¹¹. 보체 활성화 과정에서 절단 조각 C4d는 동종 모세혈관 내피 세포 표면에 공유 결합합니다. 또한, 보체 절단 산물인 C3a와 C5a와 같은 화학유인제는 염증 세포(예: 대식세포)를 동종 모세혈관으로 침투시켜 모세혈관염과 추가 이식편 손상을 유발합니다^12,13. 따라서 AAMR의 임상 진단은 주로 혈청 DSA 수치 상승, 모세혈관염, 세뇨관 괴사, 그리고 이식 모세혈관 14,15,16의 C4d 침착 증착에 의존합니다. 현재 AAMR의 치료 전략은 주로 B세포 또는 형질세포 활성 억제, 순환 DSA 제거, 보체 활성화 억제에 중점을 두고 있습니다. 여기에는 혈장분리술, 면역흡착, CD20 단클론 항체(리툭시맙), 프로테아좀 억제제(보르테조몹), 보체 억제제(에큘리주맙), 그리고 IgG 분해 효소(IdeS)17,18,19,20,21,22,23,24,25 등이 포함됩니다. 그러나 무작위 대조 시험에서 표준화된 치료법이 강력히 효과가 입증된 바 없어 전체 치료 효능은 여전히 최적이 아닙니다. 더불어, 현재의 면역억제 전략은 특히 심각한 감염 합병증과 악성 종양에 대한 감수성 증가와 관련하여 상당한 부작용 부담과 연관되어 있습니다 21,25,26,27. 따라서 AAMR의 병태생리를 밝히고 보다 효과적인 치료법을 개발하기 위한 추가 연구가 필요합니다.

질병 기전 조사와 새로운 예방 전략 탐색은 소동물 모델에 의존하므로, KT에서 신뢰할 수 있는 AAMR 모델 구축이 필수적입니다. 우리 연구팀은 쥐 KT AAMR 모델²⁸ 제작에 풍부한 경험을 가지고 있습니다. 이 연구는 브라운 노르웨이(BN) 쥐를 루이스 쥐에게 KT를 수행했습니다. BN(RT1ⁿ)과 루이스(RT1^l) 쥐는 완전히 MHC 불일치 쌍을 이루며, 동종 거부 반응에 강력한 유전적 근거를 제공합니다²⁹. 대체 모델링 기법과 비교할 때, 여기서 사용되는 피부 이식 전감화 전략은 견고성과 생리학적 관련성 면에서 뚜렷한 장점을 제공합니다. 일시적 주입에 의존하고 숙주 면역 관여가 없는 수동 항체 전달 모델과 달리, 이 능동적 감작 접근법은 고감작 환자의 임상 상황을 매우 잘 모방하여 장기 면역학적 기억을 확립합니다³⁰. 또한, 기증자 특이적 수혈과 같은 다른 감작 설계가 프로토콜에 따라 항체 역가가 변동되거나 내성을 유도할 수 있는 것과 달리, 피부 이식은 단일하고 강력하며 매우 면역원성 자극을 제공합니다²⁹. 이로 인해 고역가 DSA의 재현 가능성을 보장하고, 5일에서 7일간의 정해진 기간 내에 AAMR 표현형(예: 모세혈관염, C4d 침착)이 일관되게 나타나며, 치료 효과 평가에 매우 실현 가능한 플랫폼이 됩니다. 우리는 2주간의 피부 이식 전감작 후 이들 동종 쥐에서 KT를 수행하여 AAMR 모델을 확립하고, 혈청학적, 조직병리학적, 면역학적 분석을 통해 모델을 평가하였습니다.

모델의 적용 가능성과 관련해, 이 프로토콜 사용자는 이식 후 5일째에서 7일째 사이에 AAMR 표현형이 재현 가능하게 나타나는 것을 기대할 수 있습니다. 이 모델을 검증하는 데 필수적인 주요 수치는 혈청 DSA(IgG 및 IgM) 생성의 동역학, 미세혈관 염증의 조직학적 증거(사구체 및 세뇨관 주위 모세혈관염), 그리고 세뇨관 주위 모세혈관의 확산성 C4d 침착입니다. 하지만 독자들은 근본적인 한계를 인지해야 합니다: 피부 감작법은 체액과 세포 팔 모두를 포함하는 광범위한 동종면역 반응을 유발합니다. 따라서 이 모델은 일반적으로 혼합 거부 병리로 나타나며, 이는 우성 AAMR 특징과 함께 TCMR이 동반되는 특징이며, 고립된 항체 매개 과정이 아닙니다.

프로토콜

모든 동물 시술은 기관 지침을 엄격히 준수하였으며, 산둥 제1의과대학과 산둥성 천포산병원의 제도동물윤리위원회의 승인을 받았습니다. 모든 절차는 3R 원칙과 헬싱키 선언(승인 번호 JENNIO-IACUC-2024-A066). 이 연구에 사용된 시약과 장비는 재료표에 자세히 나와 있습니다.

1. 동물 준비

1. 성체 수컷 BN(RT1ⁿ)과 루이스(RT1^l) 쥐(200-250g)를 특정 병원체 없는 시설에 보관하세요. 근친교배 계통으로서 같은 계통 내의 개체들은 유전적으로 동일하여 기증자의 균일성을 보장합니다.
2. 쥐들을 그림 1에 설명된 네 가지 실험군으로 나누세요: (1) 동생 KT, (2) 피부 이식(ST) 후 동종 KT, (3) 동종 KT, (4) ST 후 동종 KT.
   참고: 모든 수술 절차는 SPF 수술실에서 입체현미경 하에 시행하십시오. 모든 시술 동안 온도 조절 수술대를 사용해 동물 체온을 37°C로 유지하세요.
3. 기관에서 승인한 프로토콜에 따라 유도 챔버에서 100% 산소로 1.0 L/min 유량으로 운반하는 4%-5% 이소플루란으로 마취를 유도합니다. 유도 후에는 코 콘 을 통해 1.5%-2% 이소플루란으로 마취를 유지하세요. 마취 깊이는 시술 중 페달 철수 반사의 상실을 확인하여 모니터링하였습니다.

2. ST 를 통한 사전 감작 (그룹 2 및 4에 대해)

1. 기증 쥐의 꼬리에서 2cm x 2cm 크기의 전층 피부 이식을 채취합니다(그룹 2는 루이스; 그룹 4의 BN입니다.
   참고: 피부 이식에 사용된 기증 쥐는 이후 신장 기증자와는 다른 개체이지만, 같은 근친교배 균주에 속합니다.
2. 수혜자 쥐 등에 같은 크기의 이식 베드를 준비하세요.
3. 기증자 피부 이식을 준비된 침대 위에 놓고^{앞서 설명}한 대로 중단된 봉합사로 고정합니다.
4. 신장 이식을 진행하기 전에 감작 효과를 14일간 두세요.

3. KT를 위한 기증자 운영

1. 기증자 쥐에게 마취(그룹 1 및 2는 루이스; 그룹 3과 4를 위한 중대).
2. 쥐를 등을 대고 눕히고, 상골 돌기에서 치골 결합까지 약 3-4cm 길이의 중간 복부 절개술을 시행하여 복부 장기를 완전히 노출^{시킵니다.}
3. 장을 부드럽게 당겨 왼쪽 신장과 관련된 혈관을 시각화하세요.
4. 왼쪽 신장동맥을 복부 대동맥과 접합부에서 분리하고, 왼쪽 신정맥은 하대정맥과 만나는 지점에서 분리합니다.
   참고: 우리는 대동맥 또는 정맥 동강 패치(Carrel patch)를 채취하지 않고 혈관을 개골 바로 분리하여 절단하기로 선택합니다. 이 기술은 문합을 위해 정밀한 미세수술 기술이 필요하지만, 수혜자 대동맥에 대한 동맥 절개술의 범위를 최소화하고 패치 재건과 관련된 난류 유발 혈전증 위험을 줄이기 위해 선호합니다.
5. 복부 대동맥 을 통해 약 2mL의 차가운 (4 °C) 헤파린화된 생리식염수(125 U/mL)를 왼쪽 신장에 관류하여 신장이 창^{백해지도록} 합니다.
6. 왼쪽 신장정맥을 절단한 뒤 왼쪽 신장 동맥을 절단하세요.
7. 요관을 절단하여 방광의 작은 부분이 붙어 있도록 하세요.
8. 신장을 채취하여 즉시 0.5-1.0 mL의 차가운 고장성 시트레이트 아데닌(HCA) 신장 보존액에 얼음 위에 넣으세요.

4. KT의 수신자 운영

1. 수혜자 루이스 쥐에게 마취를 해.
2. 정중 복강절개술을 시행하여 복부 대동맥과 하대정맥을 원래 신장 혈관 수준 아래에 노출시킵니다.
3. 복부 대동맥과 하대정맥 한 구간을 분리하세요.
4. 혈관 불독 클램프를 사용해 분리된 혈관 구간을 클램프로 고정하세요.
5. 복부 대동맥에 약 1.0-1.5mm 길이의 작은 종방향 절개(기증 신장 동맥 직경과 일치)를 하고, 10-0 나일론 봉합사를 사용해 기증 신장 동맥과 양쪽 끝에서 좌우로 문합을 시행합니다.
6. 하부 대정맥에 해당하는 절개를 하고, 8-0 기증 신장정맥과 끝 대 좌우 문합을 수행합니다 나일론 봉합사.
   참고: 과도한 출혈을 방지하기 위해 수혜자에게 전신 간파린화는 시행되지 않습니다.
7. 먼저, 하대정맥의 혈관 클램프를 제거하여 정맥 유출을 확립합니다. 그 후 복부 대동맥에 있는 동맥 클램프를 천천히 제거하여 이식편으로 가는 혈류를 회복합니다.
8. 지혈 여부를 확인하고 이식편 관류를 평가하세요. 면봉으로 미세한 출혈 부위를 압박하세요.
   참고: 성공적으로 관류된 신장은 즉시 분홍빛과 단단함으로 변해야 합니다.
9. 기증자 방광 패치를 10-0 나일론 봉합사로 수혜자의 방광 돔에 문합하여 요로 재건을 시행합니다.
10. 이식편의 생존이 오로지 이식편의 기능에만 의존하도록 하기 위해 수혜자 쥐의 두 개의 천연 신장을 모두 절제하세요.
    참고: 시술 전반에 걸쳐 기증자 수확부터 재수혈까지의 총 냉 허혈 기간은 60분 미만으로 유지되었고, 부합 시의 따뜻한 허혈 시간은 허혈 손상을 최소화하기 위해 30분 이하로 유지되었습니다.
11. 복부 절개는 5-0 실크 봉합사를 여러 겹으로 봉합합니다.
12. 상처 봉합 직후에는 부프레노르핀(0.05 mg/kg)을 피하 투여하여 진통을 위해 투여하고, 페니실린(40,000 U/kg)을 근주사로 투여하여 감염 예방을 도하에 투여합니다. 탈수를 방지하기 위해 1-2 mL의 따뜻한 멸균 생리식염수를 피하에 투여하세요.

5. 수술 후 관리 및 모니터링

1. 수혜자 쥐의 생존, 행동(경계성, 이동성), 생리적 상태(음식 섭취, 배설)를 매일 모니터링합니다.
2. 수술 절개 부위를 매일 검사하여 감염이나 열어짐의 징후가 있는지 확인하세요.
3. 수술 후 첫 24시간 동안은 매시간 쥐를 관찰하며, 2-3일차는 하루 최소 세 번, 그 이후에는 하루에 한두 번 모니터링하세요.
4. 혈관 혈전증, 소변 누출, 출혈과 같은 기술적 합병증으로 이식 후 24시간 이내에 사망한 수혜자는 최종 분석에서 제외합니다. 이 연구에서 전체 수술 성공률은 약 90%에 달했습니다.

6. 이식 후 평가

1. DSA 수준 검출
   1. ST 후 0일, 3일, 7일, 14일차와 KT 후 1일, 3일, 5일차에 꼬리 정맥에서 혈액 샘플을 채취하세요.
   2. ~1500 x g 온도에서 10분간 원심분리하여 혈청을 분리하고 -20 °C에서 보관하여 분석할 때까지 보관합니다.
   3. 기증자 쥐의 비장을 채취하여 70μm 세포 체를 통해 기계적으로 해리하여 차가운 인산염 완충식염수(PBS)로 만듭니다. ACK 용해 완충제를 사용해 적혈구를 5분간 용해한 후, 300 × g 원심분리기에서 5분간 PBS로 세포를 두 번 세척합니다. 세포 수를 세고 최종 농도를 1 ×^{10 7} cells/mL로 조정합니다.
   4. 수혜자 혈청을 PBS로 1:25 희석하세요.
   5. 희석된 혈청 50 μL을 37 °C에서 30분 동안 5× 10 5^{개의 기증} 쥐 비장혈구와 함께 배양합니다.
   6. 400 × g 에서 4°C에서 5분간 원심분리하여 2mL PBS로 세포를 두 번 세척하세요
   7. FITC가 결합한 항쥐 IgG 및 PE 결합 항쥐 IgM 항체(특정 클론은 재료 표 참조)를 4 °C에서 1시간 동안 배양합니다.
   8. 세포를 세척한 후 PBS에 5 ×^{10 6} cells/mL 농도로 재현탁합니다.
   9. 유세포계를 사용해 샘플을 분석하여 DSA-IgG와 IgM의 평균 형광강도(MFI)를 정량화합니다.
2. 신장 이식편의 병리학적 검사
   1. 지정된 시점에 신장 이식편을 채취합니다(ST 그룹 후 동생 KT는 KT 후 5일차에, ST 그룹 후 동종 KT는 6시간, 12시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일 후 채취).
   2. 조직 샘플을 4% 파라포름알데히드에 상온에서 24시간 고정하세요. 탈수 후 정리 후 조직을 파라핀 블록에 박고 4 μm 조각으로 잘라낸다.
   3. 절편에 헤마톡실린-에오신(HE)과 주기산-쉬프(PAS) 염색을 시행하세요.
   4. 면역조직화학에서는 절편을 EDTA 버퍼(pH 9.0)에 담근 후 압력솥에 가열하여 항원 회수를 수행합니다. 압력이 가득 차면 5분간 유지한 후 자연 냉각을 실온으로 옮깁니다.
   5. 절편에는 3% 과산화수소를 10분간 처리하세요.
   6. CD31과 C4d에 대한 1차 항체와 함께 4°C에서 하룻밤 절편을 인큐베이팅합니다.
   7. 시각화를 위해 상온에서 30초간 DAB+ 기판 염색원을 적용하세요.
   8. 디지털 슬라이드 스캐너로 얼룩진 부분을 스캔하세요.

7. 통계 분석

1. 정량적 데이터는 평균 ± 표준편차(SD)로 제시됩니다. 통계 분석은 적절한 통계 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다.
2. Kaplan-Meier 분석을 사용하여 수혜자 생존율을 평가합니다.
3. 학생 t-검정을 사용하여 그룹 간 정량적 데이터를 비교하세요.
   참고: P-값 0.05< 통계적으로 유의한 것으로 간주됩니다.

결과

신장 동종 이식 생존 시간
ST 이후 공동 유전자 KT군과 공동 KT 그룹 모두에서 1개월간의 관찰 기간 동안 거부 없이 장기간 생존하였습니다. 반대로, 동종 KT 그룹과 ST 이후 동종 KT군의 생존 기간은 각각 (10.0 ± 0.7일)과 (6.2 ± 1.1일)였으며, 두 그룹 간 통계적으로 유의미한 차이가 있었습니다(그림 2A).

DSA 수치(IgG 및 IgM)
ST 그룹 수혜자 후 동종 KT의 혈청 DSA-IgG 수치는 ST 후 7일째부터 KT 후 5일째까지 ST 그룹 수혜자에 비해 유의한 상승을 보였다. ST 후 0일과 3일째 그룹 간 DSA-IgG 수치에서 통계적으로 유의한 차이는 나타나지 않았습니다. 구체적으로, ST 후 7일째에 ST 이후 동종 KT군의 DSA-IgG 수치가 대조군보다...

토론

AAMR은 빠른 진행과 33,34,35,36의 불리한 임상 결과 때문에 KT에서 여전히 큰 도전 과제로 남아 있습니다. 현재 효과적인 항거부 치료가 급성 에피소드를 되돌리고 있음에도 불구하고, 40% 이상의 환자가 만성 AMR로 진행됩니다. 만성 AMR 진단 후 5년 생존율은 종종 50% 이하로 떨어집니다. C4d 양성 환자의 4년 이식 생존율은 50%에 불과한 반면, C4d 음성 환자에서는 8년³⁷세에도 약 50%를 유지합니다. AAMR의 발생은 주로 수혜자의 면역억제가 불충분함에 기인하며, 이는 B세포 활성화와 DSA 24,29,38,39,40,41,42의 생성으로 이어집니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
항-CD31 단일클론 항체	앱캠 (영국)	AB64543	면역조직화학(혈관 내피세포 표지) 클론 번호: TLD-3A12
반-C4d  항체	하이컬트 바이오텍 (네덜란드)	HP8034	면역조직화학(보체 침착 검출)의 희석은 1:50 클론 수: NA(다클론)
FITC 결합 항쥐 IgG 항체	앱캠 (영국)	AB6840	DSA-IgG 수치의 유동 세포계 정량에 사용 클론 수: 다클론
가스 마취 시스템	난징 칼빈 바이오테크놀로지 유한회사.	KW-MZJ-4	전신마취용 이소플루란 장착 클론 번호: NA (폴리클론)
PE 결합 항쥐 IgM 항체	바이오 레전드	408918	DSA-IgM 수치의 유동세포 정량에 사용 클론 번호: MRM-47
입체 성형 수술용 현미경	베이징 중톈 광정 기술 유한회사.	TS-39NK	쥐 신장 이식 수술에 사용 클론 번호: NA
혈관 불독 클램프	로보즈 외과 기기 회사	RS-5481T	신장 이식 중 혈류를 차단하는 데 사용 클론 번호: NA