쥐의 후肢 운동 운동학을 객관적으로 정량화하기 위한 딥러닝 기반 다중 관절 동기 추적

Summary

이 프로토콜은 딥러닝 기반 다중 관절 궤적 자동 라벨링과 함께 마커리스 러닝머신 테스트를 사용하여 쥐 하지의 운동학 평가 파이프라인을 구축하여 재현 가능한 동작 정량화를 가능하게 합니다.

Abstract

쥐의 보행에 대한 정확하고 객관적인 평가는 신경과학 및 운동학 연구 분야에서 필수적입니다. 기존 시스템은 간접 보행 추론을 위해 발자국 영상에 자주 의존하는데, 이는 뒷다리 다관절 운동학을 완전히 포착하지 못합니다. 본 연구는 설치류를 위한 마커리스 러닝머신 기반 보행 분석 시스템을 구축하여, 맞춤형 딥러닝 알고리즘과 프로그래밍 가능한 체중 지지 러닝머신을 통합하여 여러 하체 관절의 실시간 추적과 다차원 운동학적 정량화를 가능하게 합니다. 이 시스템은 보행 주기 매개변수, 관절 궤적, 힘 분포 패턴, 조절된 속도(0-300 mm/s), 경사(±30° 경사), 그리고 등급별 무게 지지(0-500 g) 조건에서 보행 주기 매개변수, 관절 궤적, 힘 분포 패턴, 움직임의 부드러움을 자동으로 추출하여 신경근 행동 연구를 위한 객관적인 평가 도구를 제공합니다. 척수 손상(SCI) 모델을 사용하여 건강한 설치류와 부상당한 설치류 간 관절 가동 범위, 궤적 연속성, 추진력 출력, 움직임의 부드러움 등 다차원적 차이를 감지하는 데 있어 이 시스템이 얼마나 민감한지 입증하여, 질병 구별 및 등급 판단 능력을 입증했습니다. 전통적인 주관적 점수나 발자국 방식과 비교할 때, 이 플랫폼은 개인적 편견과 저차원 데이터 한계를 제거하고 딥러닝 기반 아키텍처와 고처리량 데이터 수집 장점을 결합합니다. 중추 또는 말초 신경 손상, 신경퇴행성 질환, 근골격계 질환, 노화 과정 연구에 적용 가능합니다. 신경전기생리학 모듈의 동기식 통합을 통해 이 시스템은 보행과 신경 신호의 시간적 결합을 더욱 가능하게 하여, 중추-말초 제어 메커니즘을 해석하고 신경조절 전략을 개발하는 방법론적 틀을 확립합니다.

Introduction

현대 신경과학 및 이동 운동 연구에서는 객관적인 보행 정량화가 신경근 기능을 해부하고, 질병 기전을 밝히며, 재활 전략을 평가하는 데 필수적입니다. 높은 시공간적 해상도는 신경 명령, 근육 활성화 프로필, 골격 역학 간의 미묘한 시너지 변화를 포착할 수 있게 하여, 척추 위 경로, 말초 피드백, 기계적 맥락의 조정을 연구하는 경험적 토대를 마련합니다. 재현 가능한 운동학적 지표는 병변, 퇴행성 변화 및 치료 효과에 대한 탐지 민감도를 높여 약물 및 기기 개발 과정을 가속화합니다².

CatWalk, DigiGait, 또는 단순화된 풋프린트 분석과 같은 기존 평가 플랫폼은 족저 접촉 패턴을 바탕으로 관절 운동학을 간접적으로 추론합니다. 이러한 접근법은 하지의 다관절 운동학적 복잡성을 포착하지 못하는 저해상도 및 일관성 없는 지표를 제공합니다 ^3,4. 우리 방법의 전반적인 목표는 설치류 모델을 위해 특별히 설계된 고정밀도, 마커 없는, 무게 지지 보행 분석 시스템을 구축하는 것입니다. 따라서 우리는 다음과 같은 새로운 프레임워크를 구축합니다: (i) 연속 다관절 영상 중 통제된 축 하중(0-100% 체중) 하에 설치류를 직립 자세로 유지하고, (ii) 딥러닝을 통해 측면 시야 분석을 통해 시상면의 해부학적 랜드마크를 직접 위치화하여 2D 공간 궤적을 생성하며, (iii) 시간 해상도 관절 각도와 분절 운동학을 통계 모델링을 위해 내보내는 것⁵. 근본적으로 이 프레임워크는 딥러닝을 컴퓨터 비전 작업에 적용하는 데 기반을 두고 있으며, 이를 통해 비디오 데이터에서 견고한 공동 특징 추출이 가능합니다.

기존 시스템과 비교했을 때, 이 플랫폼은 네 가지 주요 장점을 제공합니다. 마커리스 동작은 반사되거나 삽입된 태그를 제거하고, 절차적 복잡성과 동작 아^티팩트를 크게 줄여줍니다. 통합 포스 피드백 서스펜션 시스템은 0-100%까지 정밀한 단계별 체중 지지를 가능하게 하여, 상업용 러닝머신⁷에는 없는 전체 부하 하역 연속체에 걸친 포괄적인 보행 평가를 가능하게 합니다. 딥러닝 아키텍처는 새로운 변종, 연령 또는 병리학적 상태에 대한 빠른 재학습을 가능하게 하며, 확장 가능성⁸에서 수동 추적보다 더 뛰어난 성능을 보입니다. 또한 고정밀 다중 관절 공간 좌표 덕분에 관절 간 운동학을 세밀하게 분석하고 이상한 보행 패턴의 정량적 프로파일링을 수행할 수 있습니다.

이 프로토콜은 널리 적용 가능합니다. 이 기술은 조절된 기계적 요구에 따른 척추 위 조절, 고유수용감각 피드백 루프, 근육 시너지 연구를 가능하게^합니다. 병태생리학적으로는 척수 손상(SCI), 뇌졸중, 신경퇴행, 말초 신경병증, 신경근 질환에 대한 민감한 운동 바이오마커를 제공합니다 ^8,10. 치료적으로는 고해상도 운동학에서 통계적 파워가 향상된 약리학적 또는 기기 기반 중재의 종단적 평가를 지원합니다¹¹. 모듈식 아키텍처는 근전도(EMG)나 뇌 신호와 같은 보완적 플랫폼과의 원활한 통합을 가능하게 하여, 하체 운동에서 신경 상관관계의 기전적 디코딩을 용이하게 합니다.

Protocol

모든 동물 시술은 베이징 뇌연구소 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았으며, 실험동물 관리 및 사용 지침을 준수하였습니다. 시술 관련 이상반응은 관찰되지 않았습니다.

1. 장비 준비

1. 러닝머신 시스템의 전원 공급 장치를 켜고 터치스크린의 속도 조절 버튼을 선택하세요.
2. 벨트를 30초 동안 저속으로 돌려 두어 러닝머신 벨트가 벗어나는지 관찰합니다.
3. 경사 제어 버튼을 선택한 후 경사를 0°로 설정한 후 0을 클릭한 후 표시된 값이 수평 버블과 일치하는지 확인하세요.
4. 서스펜션 인터페이스에 들어가 10g 추를 걸고 장력 측정값이 0.10N에 가까운지 확인하세요.
5. 산업용 개인용 컴퓨터(IPC)를 켜고 비디오 수집 및 분석 소프트웨어를 입력하세요.
6. 그날의 실험 디렉터리를 만들고, 실험 이름, 동물 ID, 실험 그룹, 속도, 경사, 체중 감량 비율 등의 정보를 포함하세요.
7. 고속 산업용 카메라(UC70, 해상도: 1280X1024, 프레임 속도: 60 fps)를 수동 초점 렌즈(f = 12 mm)를 알루미늄 프로파일 브래킷에 고정하세요. 러닝머신의 종축에 수직으로 카메라 렌즈를 위치시켜, 러닝머신 벨트 평면에서 15cm 수평 작업 거리를 유지하면서 엄격한 측면 시점을 포착하세요.
8. 렌즈를 버블 레벨을 사용해 수평으로 놓고, 쥐의 몸통이 프레임 중앙 2/3을 차지하도록 하세요. 초점과 조리개를 조정하여 뒷면의 자(1cm 격자)에 있는 눈금선이 선명하게 보일 때까지 조절하세요.
9. 미 리보기 를 클릭하면 트레일링이 없고 배경 밝기가 균일한지 확인할 수 있습니다. 이미지가 너무 어두우면 밝기를 높이기 위해 발광 다이오드(LED) 백라이트를 사용하세요; 과노출 시에는 게인을 줄이고 조리개를 적절히 좁히세요.
10. 기록 시작 버튼을 클릭하여 데이터 기록 품질을 테스트하세요. 녹화 중지 를 클릭하고 데이터 저장 경로를 설정하세요. 위 장비 테스트를 완료한 후 동물 실험을 시작하세요.

2. 동물 준비 및 운행 시험

1. 쥐와 원래 우리를 함께 실험실로 옮겨 10분간 쉬게 하세요. 이 기간 동안 음식과 물을 자유롭게 이용할 수 있도록 하세요.
2. 전자 체중계(0.1g까지 정확함)를 사용해 체중을 기록하세요. 체중이 맞는 쥐(±10 g)를 포함시켜 체형의 혼란 효과를 최소화하세요.
3. 뒷다리 털 색깔이 배경과 충분히 대비되지 않으면, 전기 면도기를 사용해 허벅지 바깥쪽과 하퇴 뒤쪽의 1cm 폭 털 띠를 부드럽게 제거하여 관절 인식의 정확도를 높이세요.
4. 그 다음 부드러운 줄자를 사용해 엉덩이에서 발목까지 직선 거리(mm)를 측정하는데, 이것이 이후 보폭 정규화의 기준이 됩니다.
5. 장갑을 끼고 쥐를 잡은 뒤, 탄력 있는 가슴 스트랩을 앞 겨드랑이에 감아 조절 가능한 슬라이드 레일에 고정하세요. 동물의 호흡에 영향을 주지 않으면서도 손가락 하나를 넣을 수 있을 만큼 끈이 느슨한지 확인하세요.
6. 서스펜션 암 손잡이를 천천히 돌리면서 화면에 표시된 장력 값을 관찰하며, 점차 목표 중량 감소비로 증가시킵니다. 쥐의 뒷다리가 여전히 땅에 완전히 닿아 있는지 확인하세요.
7. 그립 바 높이를 조정하세요. 윗부분 손잡이를 느슨하게 풀고, 서 있을 때 앞쪽 그립 바를 쥐의 코끝 바로 아래에 약간 위치시키면, 동물이 머리를 지나치게 뒤로 젖히거나 허리를 굽히지 않고도 쉽게 잡을 수 있도록 하세요.
8. 터치 컨트롤 스크린에서 속도를 150 mm/s, 경사 를 0°로 설정하세요. 동물이 특정 체중 지지 수준에 적응하도록 10분간 적응 세션을 진행하세요. 쥐의 스트레스 징후(예: 얼음, 배변)를 관찰하세요.
   1. 보행이 불규칙하면(>[분당 3회 중단]으로 정의됨), 지속 시간을 2분 단위로 늘리고, 최대 20분까지 연장하세요.
9. 적응은 쥐가 발을 끌지 않고 최소 60초 이상 연속적이고 균일한 보폭을 유지하고, 꼬리가 자연스럽게 뻣뻣함 없이 늘어져 있을 때 성공한 것으로 간주됩니다. 최대 적응 기간을 지나고 이 기준을 충족하지 못하는 동물은 제외합니다.
10. 형식적인 실험에 필요한 매개변수를 입력하세요. 터치스크린에 원하는 속도(0-300 mm/s 사이의 값)와 경사(−30°에서 +30°)를 순차적으로 입력하고, 러닝머신 벨트의 방향을 선택합니다.
11. 러닝머신을 시작한 후에는 쥐의 걷는 자세를 관찰하세요. 만약 중앙 1/3 부분에서 벗어나면, 너클로 오른쪽 벽을 살짝 한 번 두드리세요. 대부분의 동물은 스스로 자세를 교정합니다. 두 번의 연속 교정이 효과가 없으면 쥐를 재배치하고 재기록하세요.
12. 안정화 후에는 녹화 시작 을 클릭하고 최소 다섯 번의 완전한 보행 주기를 연속적으로 촬영하세요.
13. 각 시도가 끝나면 즉시 속도를 0으로 줄이고 가슴 끈을 풀어 쥐를 해당 우리로 돌려놓습니다.
14. 휴식 시간에는 물을 주고, 시도 사이에 최소 3분을 두세요.
15. 동일한 조건에서 최소 세 번의 재판을 기록하세요. 동물이 6회 이상 연속 달리기를 할 경우, 누적 피로를 방지하기 위해 추가로 2분의 휴식을 추가하세요.
16. 공식 실험 전 5일 연속 사전 훈련을 실시하세요: 매일 10분씩 150 mm/s, 0° 경사, 체중 감량 0으로 걷고, 보행 상태를 관찰합니다.

3. 보행 데이터 추출

1. 먼저, 보통 약 10초 정도의 목표 보행을 포함하는 구간을 추출하며, 여기에는 최소 10개의 분석 가능한 안정적인 보행 주기가 포함되어야 합니다.
2. .mov 파일을 분석 소프트웨어에 가져오고, 쥐의 개별 정보(ID 번호, 그룹, 실험 조건 등)를 등록하세요.
   참고: 이 시스템은 고성능 포즈 추정에 최적화된 최첨단 신경망인 YOLO-NAS 포즈 아키텍처를 사용합니다.
   데이터셋 구성: 모델은 6,000개의 비디오 프레임으로 구성된 견고한 데이터셋에서 학습되었습니다. 이 프레임들은 DeepLabCut 그래픽 사용자 인터페이스를 통해 다섯 개의 주요 뒷다리 관절(장골능, 엉덩이, 무릎, 발목, 발가락)의 좌표를 수동으로 주석으로 표시하여 실제 정확성을 보장했습니다.
   훈련: 네트워크는 NVIDIA RTX 3080 GPU에서 YOLO-NAS 포즈 가중치를 쥐 뒷다리의 특정 특징에 맞게 조정하기 위해 전이 학습을 진행했습니다.
   초기화: 소프트웨어에서 사전 학습된 'Rat_Hindlimb_YOLO_v1' 모델을 선택하고 신뢰 임계치를 0.8로 설정하여 저확실성 키포인트를 제외합니다.
   분석 단계에서 YOLO-NAS 포즈 모델은 비디오 스트림을 프레임별로 처리합니다. 전통적인 컴퓨터 비전 방식이 배경 뺄셈에 의존하는 것과 달리, 이 딥러닝 아키텍처는 쥐를 직접 위치시키고 경계 상자 내 공동 좌표를 예측합니다.
   후처리: 알고리즘은 확률 맵에서 x와 y 좌표를 추출합니다. 고주파 지터를 완화하기 위해 원시 궤적에 중앙값 필터(윈도우 크기: 3프레임)가 적용됩니다.
   출력: 시스템은 비디오 프레임 내 다섯 개의 목표 관절을 성공적으로 고정하여 전체 보행 시퀀스에 대해 시간 해상도 공간 좌표를 생성합니다. 이 데이터는 운동학적 계산을 위해 자동으로 .csv 파일로 내보내집니다. 동시에 캡처한 백보드 자(1cm 격자)를 사용해 변환 관계를 설정하고, 자동으로 스케일링 팩터를 계산하며, 픽셀 좌표를 밀리미터 단위로 일괄 변환합니다.
3. 각 조인트의 공간 위치 좌표를 시간에 따른 .csv 파일로 내보내 이후 인덱스 계산에 활용합니다.
   참고: 소프트웨어는 보폭 길이, 걸음 빈도, 발 높이를 자동으로 계산하고, 시간이 지남에 따라 다섯 개의 하부 관절의 공간 위치와 각도 변화를 내보냅니다. 발가락 높이를 기반으로 소프트웨어는 각 스텝을 스윙 단계와 스탠스 단계로 자동으로 나누고, 각 보행 주기 내에서 스윙 단계와 스탠스 단계의 비율을 계산합니다.

4. 집단 간 운동학 비교

1. 그룹 내 각 보행 주기를 0%(발 접촉)에서 100%(다시 같은 발 접촉)로 정규화하여 주기 길이를 통합하여 그룹 평균과 비교를 용이하게 합니다. 보행 역학을 설명하기 위해 생성할 수 있는 이미지 유형은 보충 파일 1에 제공되어 있습니다.

5. 통계 분석

1. 모든 통계 분석은 GraphPad 프리sm 소프트웨어를 사용하여 수행하세요.
2. 샤피로-윌크 검정을 사용하여 데이터 분포의 정규성을 검증합니다.
3. 운동학적 검증 및 체질량지수(BMI) 시연 비교를 위해 평균 ± SEM으로 데이터를 제시합니다.
4. 두 실험 조건 간의 차이를 비쌍 학생 t-검정을 사용해 평가합니다.
5. 통계적 유의성 임계값을 *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.005로 정의합니다. 이 파일럿 검증 연구에는 총 n = 3마리의 쥐가 포함되었다는 점에 유의하라.

6. 전기생리학 모듈의 삽입

1. 동물 모델링을 완료한 후에는 전기생리학적 기록 장치를 이식합니다.
2. 신경 기록을 위해서는 두개골 표면, 경막외 공간, 또는 대뇌 피질에 전극을 놓아 뇌 신호를 기록합니다.
3. 척수 기록을 위해서는 추간공의 경막외 공간에 기록 전극을 삽입합니다.
4. 근전도 기록을 위해서는 근육 전원을 근육에 박아 근육 전기 활동을 기록하세요.
5. 이식 후에는 동물이 5-7일간 회복할 시간을 두고, 상처와 보행 상태를 매일 점검하여 감염이나 통증의 징후가 없는지 확인한 후 러닝머신 실험에 들어갑니다.
6. 위에서 설명한 장비와 동물 준비를 완료하세요.
7. 전기생리학적 매개변수와 움직임 영상 수집을 동기화하여 전기생리학과 영상 데이터가 동일한 타임스탬프를 공유하도록 보장합니다.
8. 데이터 수집 후에는 분석 중 신경 신호를 비디오 프레임과 정렬하여 보행 주기의 다양한 단계에서 전기생리학적 패턴을 직관적으로 관찰하여 중심-말초 결합 메커니즘을 탐구할 수 있는 직접적인 증거를 제공합니다.

Results

러닝머신 시스템 구조의 회로도와 실제 사진은 각각 그림 1A, B에 나와 있습니다. 이 장치는 마커 없이 고대비 측면 이미지를 얻을 수 있습니다. 러닝머신은 속도, 경사, 방향, 무게 감량 조절을 지원하며, 수치 제어 패널을 갖추고 있습니다. 동반된 소프트웨어 인터페이스에는 실시간 모니터링 및 획득 인터페이스뿐만 아니라 비디오 업로드 및 보행 추출 분석 인터페이스도 포함되어 있습니다. 자동 보행 주석을 위한 딥러닝 모듈이 내장되어 있어, 수동 주석 없이도 뒷다리의 장골능, 엉덩이, 무릎, 발목, 발가락 관절의 연속적인 움직임 데이터를 높은 프레임 속도와 높은 정밀도로 획득할 수 있습니다(그림 1C).

건강한 쥐와 SCI 쥐 비교에서, 동일한 시야 내 주요 신체 지점에 대한 비디오 추출...

Discussion

이 프로토콜은 쥐를 위한 러닝머신 기반 보행 분석 시스템과 그 운영 절차를 설명하여, 신경근 행동 연구를 위한 다차원적이고 객관적인 평가 도구를 제공합니다. 예시 연구 내 SCI와 건강한 쥐 간 보행 매개변수 비교에서 입증된 것처럼, 시스템은 연속적이고 고프레임 속도의 보행 영상촬영과 AI 기반 자동 다중 관절 주석 알고리즘을 통해 피험자 하체의 원시 공간 이동 좌표를 획득합니다. 이를 통해 보행 궤적, 단계 분할, 힘 지수 분포 패턴 등 포괄적인 정량적 분석과 그래픽 표현이 가능합니다. SCI 응용 외에도, 이 시스템은 중추신경계 손상(예: 뇌졸중, 뇌출혈), 신경퇴행성 질환(예: 알츠하이머병, 파킨슨병), 말초 신경근 병리(예: 좌골신경 손상, 근이영양증), 그리고 노^{화 연구 중} 보행 변화 연구를 지원합니다.

이 프로토콜의 성공적인 구현은 여러 중요한 단계에 달려 있습니다....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
보행 AI 주석 및 획득 소프트웨어	상하이 클린AI 트리알 테크놀로지 유한회사.	마우스AI	MouseAI는 MOVEMETRICS 러닝머신을 위한 통합 분석 소프트웨어로, 비디오 녹화, 메타데이터 로깅, 자동화된 보행 분석을 하나의 워크플로우로 통합합니다.
기계적 충격	RWD 라이프 사이언스, 선전, 중국
다중 채널 전기물리 논리 기록 시스템	커도(쑤저우) 두뇌컴퓨터기술회사, 그리고 nbsp;	케두BC RHD128A	KedouBC RHD128A는 소형 128채널 생체 내 전기생리학 획득 시스템으로, 소형부터 대형 실험실 동물의 고해상도 신경 기록을 위해 설계되었습니다. 경량의 플러그 앤 플레이 헤드스테이지(& 1.3 g), 16비트 A/D 변환 및 프로그래머블 앰프를 통합하여 0.1 Hz에서 30 kHz까지 EEG, ECoG, LFP, 스파이크, EMG 및 ECG 신호를 &le로 포착합니다; 2.4 & 마이크로; V 시스템 소음과 > 10 GΩ 입력 임피던스. RHD128A 뇌-기계 인터페이스, 신경퇴행 및 재활 연구를 가속화하기 위해 강력하고 사용자 확장 가능한 신경 데이터를 제공합니다.
러닝머신	상하이 클린AI 트리알 테크놀로지 유한회사.	무브메트릭스	MOVEMETRICS는 고급 설치류 보행 분석을 위한 고정밀도 계측 러닝머신입니다.