이 연구는 암 게놈 아틀라스(The Cancer Genome Atlas) 데이터를 활용하여 폐 편평세포암(LUSC)에서 10-lncRNA 산화 스트레스 관련 신호를 확인했습니다. 검증 결과 임상 예측 성능이 제한적이었으나, 이 특징은 면역 미세환경 패턴을 구분시켰으며, 시험관 내 분석은 LINC01615 이동-침투 관련 기전 연구의 후보로 지지했습니다.
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연구 논문
* These authors contributed equally
이 연구는 암 게놈 아틀라스(The Cancer Genome Atlas) 데이터를 활용하여 폐 편평세포암(LUSC)에서 10-lncRNA 산화 스트레스 관련 신호를 확인했습니다. 검증 결과 임상 예측 성능이 제한적이었으나, 이 특징은 면역 미세환경 패턴을 구분시켰으며, 시험관 내 분석은 LINC01615 이동-침투 관련 기전 연구의 후보로 지지했습니다.
장쇄 비암호화 RNA(lncRNA)는 폐편평세포암(LUSC)의 예후와 면역 침윤에 큰 영향을 미칩니다. 이 연구는 산화 스트레스 관련 lncRNA가 폐 편평세포암(SCC)에 미치는 영향을 입증하는 것을 목표로 했습니다. 암 게놈 아틀라스(TCGA) 데이터셋은 LUSC를 위한 전사체 정보와 관련 임상 데이터를 수집했습니다. 예후 모델을 구축하기 위해, 종양과 건강한 조직에서 OS 유전자의 비정상 발현 및 악성 종양과의 연관성을 비교한 일련의 생물정보학 분석을 통해 10개의 예후 관련 유전자가 확인되었습니다. 참가자들은 10유전자 서명에서 도출된 중앙값 위험 점수를 기준으로 고위험군과 저위험군으로 계층화되었습니다. 수학적 위험 모델은 검증 코호트에서 제한된 독립적 예측 성과를 보였으나(AUC ~ 0.5), 기능 및 면역학적 평가에서는 위험층 간 종양 미세환경(TME)에서 유의한 차이가 나타났습니다. 특히 고위험 환자들은 저위험 환자에 비해 뚜렷한 면역 침윤 프로필과 면역 점수 변화를 보였습니다. 따라서 이 산화 스트레스 관련 lncRNA 서명은 직접적인 임상 예측 도구로서의 역할을 하기보다는 LUSC 면역 지형에 대한 귀중한 생물학적 통찰을 제공하며, 추가 기전 연구를 위한 잠재적 치료 표적을 강조합니다.
폐암은 전 세계적으로 악성 종양 중 가장 높은 발생률과 사망률을 보입니다1. 비소세포폐암(NSCLC) 조직학적 변이체 중에서 폐편평세포암(LUSC)이 우세한 아형으로, 폐선암종2에 비해 부정적인 임상 결과 효과적인 표적 치료제의 부재와 상관관계가있습니다. 주요 치료법은 외과적 개입, 방사선 치료, 화학요법을 포함하지만, 진행된 LUSC 환자는 치료 저항성을 자주 보입니다. 따라서 예후 계층화를 개선하고 LUSC4의 탐색적 치료 전략을 안내하기 위해 견고한 분자 바이오마커를 식별하는 것이 시급합니다.
산화 스트레스는 활성산소종(ROS)의 병리적 축적을 특징으로 하며, 종양의 시작, 성장, 전이에 중요한 역할을 합니다. 효율적인 ROS 제거 메커니즘이 없을 때, 높은 ROS 수치는 DNA 손상과 유전자 독성을 유발하여 궁극적으로 암 발달에 기여하는 다양한 유전체 변형을 초래합니다. 특히, 연구들은폐암의 발병기전에서 ROS 수치와 산화 스트레스가 지속적으로 상승한다는 것을 지속적으로 입증해 왔습니다 5,6. 최근 연구는 산화 스트레스와 관련된 유전자 군집이 폐악성 종양에서 전향적 예후 바이오마커로 기능할 수 있음을 강조했습니다7. 긴 비암호화 RNA(lncRNA)는 유전자 발현의 중요한 조절자로 부상했으며, 다양한 악성 종양에서 유망한 예후 바이오마커로 나타났습니다. 이전 주목할 만한 연구7은 폐선암(LUAD)에 대한 산화 스트레스 관련 lncRNA 예후 모델을 성공적으로 확립했으나, LUSC 내 이러한 lncRNA의 구체적인 예후 지형과 면역 관련 함의는 아직 대부분 탐구되지 않았습니다.
본 연구에서 저자들은 TCGA 데이터셋을 체계적으로 분석하여 LUSC에 특화된 새로운 산화 스트레스 관련 lncRNA 서명을 구축하였습니다. 더불어, 순수 생물정보학적 분석과 달리, 본 연구는 주요 확인된 lncRNA(예: Linc01615)의 생물학적 기능적 역할을 확인하기 위해 시험관 내 실험 검증을 포함하고 있습니다. 진단 및 치료 결정에 즉각적인 임상적 적용성을 주장하기보다는, 본 연구는 주로 LUSC에서 산화 스트레스의 잠재적 기전과 종양 면역 미세환경과의 상관관계를 탐구하는 데 목적이 있습니다. 이 발견들은 귀중한 생물학적 통찰을 제공하고 향후 기전 연구를 위한 잠재적 치료 표적을 강조하는 것을 목적으로 합니다.
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데이터 수집 및 전처리
이 연구에서 분석된 모든 데이터는 자료표에 공개된 TCGA 데이터베이스에서 얻었습니다. 이 연구는 미국 국립보건원(NIH)의 유전체 데이터 공유 정책과 TCGA가 제공한 출판 지침을 엄격히 준수하였습니다. 데이터셋이 비식별화된 공개된 임상 및 다중 오믹스 데이터로 구성되어 있기 때문에, 이 연구는 추가 기관심사위원회(IRB) 승인에서 면제되었습니다. LUSC의 전사체 데이터와 해당 임상 정보는 암 게놈 아틀라스(TCGA) 데이터베이스에서 다운로드되었습니다. 초기에는 551개의 샘플(종양 502개, 정상 49개)이 포함되었습니다. 이 예후 모델의 견고성을 보장하기 위해, 완전한 전체 생존(OS) 데이터, 생존 상태, 필수 임상 특성이 결여된 환자는 후속 생존 분석에서 제외하였습니다. 이 엄격한 필터링 과정을 거쳐 최종 분석 코호트인 470명의 LUSC 환자가 구성되었습니다. 이 470명의 환자들은 이후 위험 모델 구축 및 검증을 위해 훈련 세트(n = 235)와 테스트 세트(n = 235)로 무작위로 나누어졌습니다. 총 792개의 산화 스트레스 관련 유전자가 자료표에 나열된 GeneCards 데이터베이스를 통해 수집되었으며, 관련성 점수 ≥ 7이라는 포함 기준을 사용했습니다. limma 패키지(버전 3.66.0)는 산화 스트레스 유전자의 차등 발현을 선별하는 데 사용되었습니다. 화산 플롯은 ggplot2 패키지(버전 4.0.2)를 사용해 생성되었습니다. 훈련군과 시험군 간에는 임상 특성에 뚜렷한 변동이 없었다(p > 0.05). 훈련 세트는 모델 구축에 사용되었고, 테스트 세트는 내부 검증에 사용되었습니다.
위험 모델의 구축 및 검증
산화 스트레스와 관련된 lncRNA를 규명하기 위해 피어슨 공동 발현 분석이 수행되었습니다. 저자들은 TCGA-LUSC 데이터셋 내 모든 주석이 달린 lncRNA와 확인된 차별 발현 산화 스트레스 관련 유전자의 발현 프로필 간의 상관관계를 평가하였습니다. 공동 발현 lncRNA 선정에 대한 상관 기준은 상관계수 |R| > 0.4이고 p-value는 0.001<. 이 임계값을 바탕으로 총 6,088개의 후보 산화 스트레스 관련 lncRNA가 추출 및 추출되었습니다. 이후 이 6,088개의 후보 lncRNA를 LASSO 회귀 및 보완적 분석 접근법을 통해 예후 위험 모델을 구축하기 위해 평가되었습니다. 처리된 데이터를 활용하여 환자 참가자들은 고위험층과 저위험층으로 분류되었습니다.
독립 요인과 ROC 곡선
독립 예후 변수를 식별하기 위해 단변량 및 다변량 콕스 회귀 모델을 활용하였다. 구체적으로, 다중 단변량 Cox 회귀분석(n = 236 검정) 중 가족별 오류율을 제어하기 위해 Bonferroni 보정이 적용되어 엄격히 조정된 유의성 임계치를 p < 0.00021(0.05 / 236으로 계산)로 설정했습니다.
생존 분석 및 주성분 분석
생존 패키지(버전 3.8-6)는 전체 생존율(OS) 산출에 사용되었고, 주성분 분석(PCA)은 위험 모델의 견고성을 평가하는 데 사용되었습니다.
노모그램
적합 지수는 R의 rms 패키지를 사용하여 노모그램의 신뢰성을 평가하였습니다. 종양 돌연변이 부담(TMB)은 maftools 패키지(버전 2.22.0)를 사용하여 평가 및 시각화하였습니다. ssGSEA를 포함한 알고리즘이 면역 침윤을 탐지하는 데 사용되었습니다. 또한, ggpubr 패키지(버전 0.6.3)를 사용해 위험군 간 면역 검사점을 비교하였습니다. ESTIMATE 알고리즘을 사용하여 종양 미세환경(TME)을 특성화하였습니다.
함수해석학
R의 clusterProfiler 패키지(버전 4.14.6)는 농도 분석에 사용되었습니다. 기능 경로를 더 깊이 탐구하기 위해 GSEA 분석이 수행되었습니다. Cytoscape를 사용하여 관찰을 위한 공발현 네트워크가 구축되었습니다.
실험 방법
세포 배양 조건과 그룹화
NCI-H520 인간 폐 편평세포암세포주(RRID: CVCL_1566; 재료표에 등재됨)는 RPMI-1640 배양지에 10%(v/v) 태아 소 혈청과 1% 페니실린-스트렙토마이신을 보충하여 배양하였다. 로그 상 세포는 6웰 배양 플레이트에 시딩되었습니다. 순응이 성공하면 세포들은 무작위로 세 개의 뚜렷한 실험군으로 배분되었습니다: 표준 배양 조건에서 유지된 빈 대조군, 비표적 siRNA로 형질전환한 음성 대조군(si-NC), 그리고 LINC01615 특이적 siRNA로 형질전환된 실험적 노크다운군(si-LINC01615).
세포 형질전환
si-LINC01615와 si-NC 시약은 얼음 위에서 해동되었습니다. 형질전환 복합체 준비를 위해 혈청 없는 RPMI-1640 배지 95 μL을 무균 원심분리관에 피펫팅한 후, 해당 siRNA 3 μg와 Lipo3000 형질전환 시약 5 μL을 순차적으로 첨가했습니다. 동일한 절차가 siLINC01615와 siNC 그룹 모두에 적용되었다. 용액은 부드럽게 혼합되어 5분간 실온에서 배양하여 복합체 형성을 촉진했으며, 총 부피는 튜브당 약 200 μL로 나왔습니다. 이후 이 혼합물은 800 μL RPMI-1640 기저 배지를 포함한 지정된 배양 웰에 균일하게 분포되었습니다. 37°C에서 6시간의 배양 후, 형질전환 배지를 신중히 흡인하고 신선한 완전 배양 배지로 교체했습니다.
상처 치유(긁음) 분석
상처 치유 분석에서는 로그 성장 중인 NCI-H520 세포(RRID: CVCL_1566)를 6웰 배양판에 5.6 × 105 셀/웰 밀도로 시딩했습니다. 95–100% 합류에 도달하면, 멸균된 200 μL 피펫 팁을 사용해 셀 단층을 웰 중앙을 수직으로 긁어 인위적으로 선형 상처를 만들었습니다. 이후 웰은 PBS로 세 차례 세척되어 분리된 세포와 세포 잔해를 제거한 후, 혈청 없는 RPMI-1640 배양지에서 배양했습니다. 동일한 부상 부위의 이미지는 0, 24, 48시간에 역현미경을 사용해 촬영되었습니다. 상처 치유 면적은 ImageJ(RRID: SCR_003070; 재료표에 표에 등재됨)를 이용해 간격 거리를 측정하여 정량화하였고, 0시에서 초기 상처 면적을 기준으로 이동 속도를 계산하였습니다.
트랜스웰 이동 및 침입 분석
세포 이동 및 침입 능력은 재료표에 나열된 8.0 μm 기공 크기의 폴리카보네이트 막 삽입물이 장착된 24 웰 트랜스웰 챔버를 사용하여 평가되었습니다. 침입 분석에서는 첨단 심리실에 50 μL 마트리젤(혈청 무첨가 배지에서 1:8 희석; 재료표에 등재됨)으로 미리 코팅되어 37 °C에서 2시간 배양하여 중합시켰으며, 이동 분석은 코팅되지 않은 삽입물을 사용했습니다. 세포 형질인화와 24시간의 혈청 기아 기간 후, NCI-H520 세포를 채취하여 혈청 없는 RPMI-1640 배지에 재현탁한 후, 200 μL에 1.8 ×10 5 세포/웰 밀도로 최첨단 챔버에 시딩하였습니다. 기저 챔버에는 600 μL RPMI-1640 배지와 10% FBS가 화학유인제로 보충되어 채워졌습니다. 37°C에서 5% CO₂로 48시간 배양한 후, 삽입물을 제거하고 PBS로 세 번 세척했습니다. 막 꼭대기 표면에 남아 있던 세포들은 젖은 면봉으로 부드럽게 면봉으로 제거했습니다. 기저외측 표면을 이동하거나 침입한 세포들은 4% 파라포름알데히드로 20분간 고정하고, 재료 표에 기재된 기엠사 용액으로 실온에서 30분간 염색하였습니다. 이동 및 침입된 세포는 40배 배율의 역현미경을 사용해 인서트당 무작위로 선택된 세 개의 광야에 걸쳐 시각화하고 열거했습니다.
통계 분석
모든 통계 분석 및 데이터 시각화는 R 소프트웨어(버전 4.1.2; RRID: SCR_001905; 재료표에 등재되어 있습니다. 이 연구에서 사용된 모든 R 패키지의 구체적인 버전 번호는 해당 방법론적 하위 섹션에서 명확히 상세히 설명되어 있습니다. 유의미한 가치는 별도 보고가 없는 한 p< 0.05로 전통적으로 정의되었습니다. 여러 비교(예: 다중 단변량 콕스 회귀)가 수행된 경우, 본페로니 방법을 엄격히 적용하여 가족별 오류율(FWER)을 유지했으며, 정확한 조정 임계값(예: p < 0.00021)은 해당 방법론 소절에 상세히 명시되어 있습니다. 정량적 시험관 데이터는 평균 ± 표준편차로 표현되었으며, 학생 t-검정 또는 일원 ANOVA를 사용해 분석하였습니다.
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산화 스트레스에 대한 차별발현 유전자의 규명
워크플로우는 그림 1에 나와 있습니다. 최종 분석 코호트의 임상 특성은 470명의 LUSC 환자로 구성되어 있으며, 표 1에 자세히 나와 있습니다. 관련성 ≥점수 7의 정의된 임계값을 기준으로 저자들은 GeneCards 데이터베이스에서 총 792개의 산화 스트레스 관련 유전자를 검색했습니다(보완 파일 1). 정상 샘플과 LUSC 샘플 사이에서 178개의 산화 스트레스 유전자가 유의미하게 변화한 발현 수준을 보였습니다(보완 문서 2). 발현 패턴은 화산 플롯(그림 2A)과 열지도(그림 2B)에서 시각...
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폐 편평세포암(LUSC)은 비소세포폐암의 우세하고 매우 공격적인 조직학적 아형으로, 생존율이 매우 낮고 기존의 치료법에 대한 저항성이 특징입니다 8,9. 새로운 증거들은 산화 스트레스가 다양한 악성 종양의 발병 기전과 진행에 있어 중추적 요인임을 강조하고 있습니다. 활성 산소종(ROS)의 병리학적 축적과 KEAP1/NRF2 신호 전달 축과 같은 세포 항산화 방어 시스템의 조절 장애는 폐암에서 종양 발생, 세포 세포자멸사, 치료 저항성에 깊은 영향을 미친다 10,11,12. 따라서 강력하고 산화 스트레스 관련 예후 바이오마커를 규명하는 것은 위험 계층화를 정교하게 하고 ...
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저자들은 상충하는 이해관계가 없다고 선언한다. 원고 준비 과정에서 인공지능(AI) 도구나 AI 보조 기술은 사용되지 않았으며; 모든 과학적 내용, 분석, 원시 데이터 및 결론은 저자들이 독립적으로 생성, 검토 및 승인하였습니다.
이 연구는 중국 국가자연과학기금(보조금번호 8200430)의 지원을 받았습니다. 후난 중의학대학교와 후난 중의학 부합병원 등 기여자와 기관 여러분께 진심으로 감사드립니다. 또한 이 연구에 기여해 주신 모든 연구자와 참가자들께도 감사의 뜻을 전합니다.
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| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 4% Paraformaldehyde | Beyotime | P0099 | 세포 고정에 사용 |
| Cytoscape | Cytoscape Consortium | https://cytoscape.org/ | 공동 발현 네트워크 생성에 사용 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10099-141 | 최종 농도 10% (v/v) |
| GeneCards database | GeneCards Human Gene Database | https://www.genecards.org/ | 산화 스트레스 관련 유전자 스크리닝 |
| Giemsa Stain | Sigma-Aldrich | GS500 | 이동/침입된 세포 염색에 사용 |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | 상처 틈 정량화에 사용 |
| Lipo3000 Transfection Reagent | GLPBIO | GK20006 | siRNA 전파에 사용 |
| Matrigel | Corning | 356234 | 무혈청 배지에 1:8 희석 |
| NCI-H520 인간 폐 편평세포 암종 | ATCC | HTB-182 | 체외 검증 분석에 사용 |
| PBS (Phosphate-Buffered Saline) | Gibco | 10010-023 | 세포 세척에 사용 |
| Penicillin-Streptomycin (1%) | Gibco | 15140-122 | 세포 배양 항생제 보충 |
| R software (v4.1.2) | R Foundation | https://www.r-project.org/ | 통계 분석 및 시각화 |
| RPMI-1640 Medium | Gibco | 11875-093 | 세포 배양 배지 |
| The Cancer Genome Atlas (TCGA) | Genomic Data Commons | https://portal.gdc.cancer.gov/ | 전사체 및 임상 데이터 소스 |
| Transwell Chambers (8.0 μm) | Corning | 3422 | 이동 및 침입 분석에 사용 |