RNA 분석을 위한 파라포름알데히드 고정 마우스 간 조직의 레이저 캡처 미세 해부

Summary

이 프로토콜은 레이저 캡처 미세해부를 사용하여 파라포름알데히드 고정 및 최적 절단 온도 화합물이 포함된 마우스 간 조직의 조직학적 영역에서 RNA를 분리하는 방법을 설명하며, 이를 통해 표적 하류 유전자 발현 분석을 가능하게 합니다.

Abstract

레이저 캡처 미세해부(LCM)는 현장 시각화와 격리를 통해 복잡한 조직 내 특정 세포 집단에 공간적으로 접근할 수 있도록 합니다. 고정 조직에서 조직학적으로 정의된 영역의 전사체 분석을 가능하게 하기 위해, 파라포름알데히드(PFA) 고정 최적 절단 온도(OCT) 화합물이 포함된 마우스 간 절편에서 RNA 추출을 위한 상세한 LCM 프로토콜을 제시합니다. 프로토콜은 조직 고정, 자당 탈수, OCT 임베딩, 냉동절부, 헤마톡실린 염색, 목표 조직학적 부위의 레이저 포획 등 워크플로우를 통해 미세한 세포(약 1,000개 세포)의 식별 및 수집을 상세히 다룹니다. 이 방법을 사용해 고순도 RNA(A₂₆₀/A₂₈₀: 1.9-2.1)를 얻었습니다. RNA 무결 수(RIN)는 6.7 ± 0.9로, PFA 고정과 관련된 예상되는 단편화를 반영하였습니다. 그러나 β-액틴 에 대한 정량적 PCR 검사에서 Ct가 17-19 수준을 얻었고, 분해 최적화 라이브러리 준비를 이용한 RNA 시퀀싱은 고품질 리드를 생성하여 >90%의 염기가 Q20 및 Q30 임계값을 충족하여 RNA가 민감한 후속 분석에 적합함을 확인했습니다. 따라서 이 프로토콜은 PFA 고정 간 조직의 특정 조직학적 영역에서 정의된 순도와 완전성을 가진 RNA를 제공함으로써 공간적으로 해상도 있는 표적 유전자 발현 분석을 가능하게 합니다.

Introduction

공간적으로 해상도된 유전자 발현 프로필의 정확한 획득은 건강과 질병에서 조직의 이질성을 이해하는 데 매우 중요합니다. 단세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq)은^{높은 세포 해상도}를 제공하지만^, 고유의 공간적 맥락을 잃고 조직 해리 과정에서 전사 프로필을 변경할 수 있습니다 ^3,4. 공개적으로 식별된 특정 마커가 없는 세포 유형에 대해, 면역형광 기반 분류나 면역자기 격리를 통해 순수 집단을 얻는 것은 여전히 어렵다 ^5,6. Visium과 GeoMx와 같은 공간 전사체학 기술은 고처리량 유전자 발현 데이터를 현장에서 포착할 수 있지만, 이들의 공간 해상도는 단일 세포 또는 아세포 수준 ^7,8에서 제한됩니다. 반대로 영상 기반 공간 전사체학은 나노미터 수준의 해상도를 달성할 수 있으나 유전자 검출 처리량이 제한^{적입니다.} 이는 특정 형태학적 영역에 대한 가설 기반 분석에 대한 지속적인 공백을 부각시킵니다.

레이저 캡처 미세 해부(LCM)는 관찰 가능한 표현형을 기반으로 조직 절편이나 생세포 배양에서 현미경 유도 아래 특정 세포를 선택하고 분리할 수 있게 합니다. 이 접근법은 세포 구조와^{공간 정보를 보존}합니다. 이 기술은 간 질환 연구에서 하위 분석을 위해 광범위하게 적용되어 왔습니다. 예를 들어, LCM은 간 생검에서 담도 상피 세포를 채취하여 원발성 담관염¹¹에서 이들의 면역조절 역할을 밝히는 데 사용되어 왔습니다. 또한, 실험 모델에서 γ-글루타밀 트랜스퍼라제(GGT) 양성 조직을 분리하여 부위 특이적 Ggt1 유전자 발현을 확인하는 데 사용되었습니다¹². 하지만 이 연구들은 주로 신선한 냉동 조직에 초점을 맞추고 있으며, 임상 주석이나 장기^{추적 관찰이} 없는 경우가 많습니다. 반면, 화학적으로 고정된 조직은 조직병리학적 진단에 이점을 제공합니다. LCM 기반 RNA 시퀀싱(RNA-Seq)은 대규모 포르말린 고정 및 파라핀 내장(FFPE) 간 표본에 성공적으로 적용된 바^{있습니다.} 그러나 파라포름알데히드(PFA) 고정 및 최적 절단 온도(OCT) 화합물이 포함된 간 조직의 미세한 샘플을 위한 견고한 LCM 기반 유전자 발현 프로파일링 프로토콜은 부족합니다.

이 충족되지 않은 필요를 해결하기 위해 PFA 고정 OCT 내장형 냉동절부 장치를 활용한 포괄적인 프로토콜이 최적화되었습니다. 이 프로토콜은 민감한 LCM-RNA^응용을 위한 FFPE 워크플로우의 한계(예: 장시간 처리 및 강한 화학물질)를 해결합니다. 반면, PFA 고정 및 OCT 임베디드 샘플의 고정 및 임베딩 과정은 상대적으로 간단하고 유연하여 RNA의 무결성과 조직 형태를 모두 보존하는 고품질 절편을 신속히 준비할 수 있습니다. 또한, 이 프로토콜은 자외선(UV) 레이저 기반 LCM 시스템을 사용하여 수행됩니다. 적외선 시스템과 비교할 때, UV-LCM은 더 미세한 절단 해상도를 제공하고 직접 비접촉 샘플 채취를 가능하게 하여 오염을 최소화하고 복잡한 조직 구조로부터 미세한 영역을 정밀하게 분리하는 데 적합합니다^17,18. 따라서 이 프로토콜의 운용 가치는 PFA 고정된 간 절편에서 미세한 영역(~1,000 세포)을 형태 보존 포획할 수 있다는 데 있습니다. 이 과정은 표적 유전자 발현 분석에 적합한 RNA를 생성하여 조직병리학적 특징과 국소 전사체 프로필 간의 직접적인 상관관계를 가능하게 합니다.

여기서는 PFA 고정 OCT 내장된 마우스 간 절편에서 미세한 조직(~1,000 세포)을 레이저 캡처 미세해부하는 프로토콜을 설명하고, 이후 RNA 추출과 정량적 역전사 PCR 및 RNA 시퀀싱을 통한 후속 분석이 진행됩니다. 이 절차들은 5일 이내에 완료할 수 있습니다.

독자들이 이 프로토콜의 적용 가능성을 평가하는 데 도움이 되도록, 주요 범위와 한계를 아래에 요약합니다. 이 프로토콜은 PFA가 고정된 OCT 내재 조직에서 특정 조직학적 영역을 가설 기반으로 형태학 유도 샘플링을 위해 특별히 최적화되었으며, 주로 마우스 간에 적용됩니다. 공간적으로 해상도된 전사체 데이터를 고정된 표본에 보존된 정확한 조직병리학적 특징과 연관시키려는 연구자에게 적합합니다. 이 워크플로우는 신선한 냉동 샘플이 없을 때 보관되거나 임상적으로 주석이 달린 고정 조직을 다룰 때 특히 유용합니다. 그러나 이 프로토콜은 고무결성, 비분편화된 RNA(예: RNA 무결 번호(RIN) > 8)가 필요한 연구에는 이상적이지 않으며, 화학적 고정으로 인한 본질적인 분절 현상이 전장 전사체에 의존하는 응용 분야에서의 사용이 제한되기 때문입니다.

Protocol

동물 취급 및 돌봄에 관한 모든 절차는 윤리 지침에 따라 수행되었으며, 서던 의과대학 동물 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. 기술된 방법은 성체 수컷 C57BL/6J 마우스를 사용하여 고지방, 고당, 콜린 결핍 식단에서 유지하여 대사 관련 고관절염(MASH)을 모델링하였습니다. 간 조직을 채취하기 전에 동물들은 참수로 안락사되었다.

1. PFA 고정 시료의 준비

1. 신선한 간 조직 샘플(개별 엽, 두께 5mm 이하)을 4°C에서 4°C에서 30mL의 차가운 4% PFA(신선 준비)에 24시간 고정합니다.
   참고: 인산 완충 생리식염수(PBS, 1×, 일반적으로 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1.8 mM KH₂PO₄, pH 7.4) 용액을 1× 농도로 5분간 관류한 후 5분간 관류하는 것이 권장됩니다. 또는 조직을 10% 포르말린 용액에 고정할 수도 있습니다.
   주의: PFA 고정제는 독성이 있습니다. 모든 PFA 폐기물은 기관 및 지역 규정을 준수하여 지정되고 적절히 라벨링된 화학 폐기물 용기에 수집되어야 합니다.
2. 고정 조직 샘플을 RNase 프리 1× PBS 용액으로 5분간 3×회 세척하세요.
3. 고정된 간 조직을 50mL 튜브에 넣고, 50mL 30% 자당(멸균 1× PBS에서 신선하게 조제한 것)을 채웁니다. 샘플을 4°C에서 10-12시간 동안 유지하세요.
4. 자당 용액에서 조직 샘플을 제거하세요. 샘플을 다루기 쉬운 블록(약 5mm × 3mm × 5mm)으로 다듬은 후, OCT 성분이 포함된 크라이오몰드(7mm × 7mm × 5mm)에 삽입합니다.
   참고: 필요하다면 겸자로 조직 방향을 조절하세요.
5. OCT 화합물을 위에 올려 조직 샘플을 완전히 덮은 후, OCT가 포함된 조직 블록을 액체 질소나 드라이아이스 위에 즉시 올려 빠르게 동결시켜 고체 블록을 만듭니다. 이 빠른 냉동은 고품질 냉동절부를 얻는 데 필수적입니다.
   주의: 극저온 물질을 다룰 때는 손을 보호하기 위해 극저온 저항 장갑을 착용하세요.
6. OCT가 포함된 블록을 -80°C에 두고, 냉동 절개를 진행합니다.

2. 레이저 포획 미세해부를 위한 냉동 절개

1. 폴리에틸렌 나프탈레이트(PEN) 막을 30분간 자외선에 노출시킨 후, 0.1 mg/mL의 폴리-L-라이신으로 코팅한 후 자연 건조합니다. 그 다음, PEN 멤브레인 슬라이드의 가장자리를 중성 마운팅 매체로 밀봉하세요.
   참고: PEN 막 슬라이드에 대한 자외선 조사와 폴리-L-라이신 처리는 조직 샘플의 PEN 막 슬라이드에 대한 부착력을 향상시킬 수 있습니다. 중성 마운팅 매체로 외곽을 밀봉하면 막 아래에 물이 침투하거나 기포가 형성되는 것을 방지할 수 있어, LCM 효율 유지에 매우 중요합니다.
   주의: 피부와 눈을 자외선으로부터 보호하세요. 자외선 차단 안전 고글이나 자외선 차단 등급의 얼굴 보호대, 실험실 가운, 니트릴 장갑, 노출된 피부를 가릴 긴 소매를 착용하세요.
2. 크라이오스탯과 모든 도구의 접근 가능한 표면을 RNase 제염제로 닦고, 브러시는 75% 에탄올로 청소하세요.
   주의: 사용 후 에탄올 물티슈와 용액은 지역 기관의 환경 보건 및 안전 프로토콜에 따라 폐기하세요.
3. 기기가 −20°C에 도달해 안정화되도록 하세요.
4. 간 샘플을 -80°C에서 채취하여 최소 15분간 냉동보존기에 넣으세요.
5. 시료 단계 표면에 얇은 두께(2-3mm) 두께의 OCT 화합물을 바릅니다. 시료 스테이지를 빠른 냉동 선반(또는 냉동조절기 챔버)에 올려 OCT 층을 미리 고체화하세요.
6. 시료 단계의 미리 굳어진 OCT 층에 소량의 OCT를 도포합니다. 2.4단계에서 평형화된 조직 블록을 회수하여 즉시 이 OCT 위에 수평으로 올려놓고, 부분적으로 동결하고 유착할 수 있도록 10-15초간 고정하세요. 고정 후에는 시료 스테이지(부착된 조직 블록과 함께)를 냉동 보존 시료 헤드에 장착합니다.
7. 클램핑 플레이트와 크라이오스탯 한쪽 뒷판 사이에 블레이드를 조심스럽게 끼우고, 클램핑 레버를 클램프로 고정하세요.
8. 크라이오스탯의 두께 설정을 10 μm로 조정하세요.
   참고: 조직에 맞게 슬라이스 두께를 조절하되, 두께는 5-15 μm¹⁹ 사이로 유지하세요.
9. 절편을 절단하여 -20°C 상태로 유지된 냉동조절기 챔버 안의 사전 처리된 PEN 멤브레인 슬라이드에 직접 부착합니다.
   참고: 각 PEN 막 슬라이드는 6-8개의 조직 절편을 수용할 수 있습니다. 전체 구획 과정은 1시간 이내에 완료하는 것이 권장됩니다. 절절 시간을 제한하면 조직의 주변 환경에 노출되는 것을 최소화하여 RNA 분해, 조직 탈수, 형태학적 인공물 등의 위험을 줄여, 이는 LCM 및 후속 분석에서 RNA의 품질과 조직학적 무결성 보존에 매우 중요합니다.

3. 레이저 캡처 미세해부를 위한 헤마톡실린 염색

1. 사용 전에 실온(RT)에서 20분간 해동하세요.
2. 슬라이드를 RNase 프리 1× PBS로 3번, 각 10초씩 세척하세요.
3. 조직 슬라이드를 여과된 마이어 헤마톡실린 용액(1.0 g/L 헤마톡실린, 0.2 g/L 아이오디움 나트륨, 50 g/L 알루미늄 암모늄 황산염 도십수화물, 50 g/L 클로랄 하이드레이트, 1.0 g/L 구연산 구성)에 5-10초간 담가.
   참고: 염색 전에 헤마톡실린 작업 용액을 0.22 μm 주사기 필터 멤브레인을 통과시키세요.
4. 슬라이드를 RNase 무첨가 물로 3번, 각 10초씩 세척하여 잔류 헤마톡실린 용액을 제거하세요.
5. 현미경으로 염색 품질을 평가하세요.
   참고: 최적으로 염색된 핵은 맑은 배경 위에 선명한 청보라색으로 보여야 합니다. 염색이 부족하면 희미한 핵이 나오고, 과도하게 염색하면 세포 세부 사항이 가려집니다. 이 최적 염색 기준을 충족하는 슬라이드만 다음 단계로 진행해야 합니다.
6. 흡수지로 슬라이드를 닦고 완전히 자연 건조(10-15분)합니다.
   참고: LCM을 진행하기 전에 슬라이드가 완전히 건조되었는지 확인하세요. 그 후 슬라이드를 50mL 원심분리관에 넣고 LCM이 완료될 때까지 임시 얼음 위에 보관합니다.

4. 레이저 캡처 미세 해부

참고: 각 슬라이드의 LCM 실험 시간은 30분에서 1시간 사이로 유지해야 합니다. 전체 LCM 실험은 4시간 이내에 완료하는 것이 권장됩니다. 이 한계는 RT에서 RNA 분해를 최소화하고, 튜브 캡 내 수집 버퍼의 증발을 방지하기 위해 설정되어 있어 효율적인 샘플 회수에 필수적입니다. 실제로는 형태학적으로 정의된 영역에서 약 1,000개의 세포를 목표로 수확할 수 있으며, 4시간 이내에 신뢰성 있게 채취할 수 있습니다.

1. RNase 오염 제거제로 실험실 표면을 닦아내세요.
2. 컨트롤러를 켜고 현미경이 초기화 과정을 완료할 수 있도록 하세요.
3. 키를 꺼 짐 위치에서 켜 는 위치로 시계 방향으로 돌려 레이저 시스템을 작동시킵니다.
   참고: 레이저 시스템은 예열에 약 10분이 필요합니다.
4. 컴퓨터를 켜고 LCM 소프트웨어를 열고, 초기화 과정이 완료될 때까지 기다리세요.
5. 멸균된 0.2 mL PCR 튜브(채집관)를 채집 장치에 삽입합니다.
6. PCR 튜브 캡에 단백질분해효소 K 소화 완충제 10 μL( 재료표 참조)을 추가합니다.
   참고: 단백질분해효소 K 소화 완충제의 총 부피는 완전한 용해 절차의 일부로 후속 단계(5.4.1 단계 참조)에서 150 μL로 변환됩니다.
7. 채집 장치를 현미경 표본 홀더에 넣으세요.
8. Change Collector Device 창 내에서 먼저 참조점으로 이동 버튼을 선택하세요. 다음으로, 기준점을 명확히 볼 수 있도록 카메라 초점을 조정하세요. 필요하다면 창의 화살표를 사용해 시야에서 기준점을 중앙에 맞추세요.
9. 조직 단편을 샘플 홀더에 넣고, 조직 단편이 뒤집힌 방향이고 라벨이 오른쪽에 있는지 확인하세요.
10. 10× 대물렌즈를 선택하고, 미세소포성 지방증(다수의 작고 투명한 세포질 공포와 중심에 위치한 핵을 가진 간세포로 특징지어짐)과 같은 특정 병리학적 특징을 보이는 관심 영역을 식별하고 윤곽을 표시합니다. 그 다음 레이저 메뉴로 이동해 보정 버튼을 클릭하세요. 화면 메시지를 확인하려면 '예 '를 선택하고 보정을 진행하세요.
    참고: 10× 대물렌즈는 미세해리에만 국한된 것이 아닙니다; 샘플 선도와 원하는 해상도에 따라 20× 등 다른 확대 렌즈를 선택할 수 있습니다.
11. 레이저 제어 패널에서 절단 매개변수를 다음과 같이 설정하세요: 레이저 파워 = 50, 조리개(레이저 빔 직경) = 5, 속도 = 9.
    참고: 위에 나열된 매개변수 값은 이 프로토콜에서 사용된 조직 샘플과 함께 UV-LCM 시스템의 기준으로 사용됩니다. 다른 UV-LCM 시스템 사용자들은 이것을 출발점으로 고려해야 하며, 경험적으로 설정을 조정해야 할 가능성이 큽니다. 최적의 설정은 조직 유형, 절편 두께 및 기타 LCM 시스템에 따라 다를 수 있습니다.
12. 그래픽 툴바를 사용해 대상 영역 주위에 원을 그리세요. 단일 도형을 선택하고 시작 절단 버튼을 클릭하여 LCM을 수행한 후, 채취 장치를 위치시켜 해부된 조직을 채취합니다.
    참고: 성공적인 분리는 선택된 영역이 분리되는 것으로 표시되며, 종종 눈에 띄는 틈이나 파편 이동이 나타납니다. 일관성을 위해, 샘플당 비슷한 크기의 사전 정의된 영역 수에서 채취하세요. 목표 영역이 자동으로 분리되지 않는다면, 마우스를 사용해 Move and Cut 버튼을 클릭해 시료를 수동으로 절단하세요. 셀 수를 더 정밀하게 추정하기 위해 LCM 소프트웨어는 전체 절개 면적을 자동으로 기록할 수 있습니다. 이 값은 목표 셀의 평균 단면적으로 나누어 캡처된 셀 총 수를 근사할 수 있습니다.
    주의: LCM 과정 중에는 레이저 방사선 노출을 피하기 위해 레이저 빔을 직접 응시하지 마십시오.
13. 선택적으로 파일 메뉴에서 '이미지 저장 명령'을 선택하여 해부 부위의 전후 이미지를 캡처할 수 있습니다. 대화상자에서 위치, 파일명을 선택하고 선호하는 형식(예: .tif)으로 저장하세요.
14. 원하는 셀 수를 모으면, 언로드 버튼을 눌러 콜렉터를 스테이지에서 제거하세요. PCR 튜브를 밀봉하기 전에 캡 내 단백질효소 K 소화 완충액이 10 μL로 유지되는지 확인하고; LCM 중 증발이 발생하면 완충 부위를 보충합니다(4.6단계 참조).
    참고: 버퍼 10 μL을 추가하면 캡 표면이 완전히 적셔지게 되어 4.16단계 원심분리 중 미세 해부 조직 펠릿의 효율적인 이동이 용이합니다.
15. 수집관을 철저히 소용돌이로 돌려.
16. 채집관을 잠시 돌려 RNA 추출 때까지 -80°C에 보관하세요.
    참고: 다음 샘플을 위해 4.5단계부터 4.16단계까지 반복하세요. 프로토콜은 RNA 추출 전까지 일시정지할 수 있습니다.

5. 미세 해부 샘플의 총 RNA 추출

1. RNase 오염 제거제로 실험실 표면을 닦아내세요.
2. LCM 샘플을 -80 °C 냉동고에서 얼음 목욕으로 옮깁니다. 원한다면 동일한 샘플을 서로 다른 배치로 모아 합산할 수 있습니다.
3. 미세 해부한 샘플 튜브를 42°C에서 거꾸로 30분간 배양합니다.
   참고: 이 역전은 짧은 원심분리(4.16단계) 후 캡에 붙은 조직이 소화 완충제로 방출되도록 보장합니다. 이로 인해 5.4.1단계의 부피 조절 및 고속 원심분리 전에 최대 샘플이 버퍼로 이동할 수 있습니다.
4. 고정 조직에 최적화된 표준 RNA 추출 키트를 사용하여 LCM 샘플에서 총 RNA를 분리합니다(재료 표 참조).
   1. 각 샘플 튜브의 부피를 단백질효소 K 소화 버퍼를 사용해 최종 150 μL로 조정합니다( 재료표 참조). 튜브를 11,000 × g (1분)에서 돌린 후 샘플을 멸균된 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
   2. 튜브당 10 μL 단백질효소 K(20 mg/mL)를 첨가한 후, 반복적으로 피펫팅하여 샘플을 부드럽게 혼합합니다. 이로 인해 최종 부피는 160 μL이고, 샘플당 소화 반응 내 최종 단백질효소 K 농도는 약 1.25 mg/mL가 됩니다.
   3. 두 단계로 샘플 배양을 수행합니다: 먼저 56°C에서 15분간 보관하고, 이어서 80°C에서 15분간 배양합니다. 각 부화 기간 동안 5분마다 튜브를 잠시 소용돌이로 돌리세요.
      참고: 최적의 작업 흐름을 위해서는 예열된 물 욕조 두 개를 사용하세요. 단일 욕조를 사용할 경우, 56 °C 배양 후 잠시 멈추고, 욕조가 80 °C로 가열되는 동안 샘플을 RT 상태로 유지한 후 진행합니다.
   4. 샘플을 얼음 위에 3분간 보관한 후 20,000 × g (15분)에서 원심분리합니다.
   5. 정화된 상정액을 새로운 1.5mL 튜브로 흡인하되, 펠릿은 피하도록 주의하세요.
   6. 각 샘플에 16 μL DNase 배큐 버퍼와 10 μL DNase I 효소(2.73 단위/μL, 재료표 참조)를 첨가합니다. 그 다음, 튜브를 부드럽게 뒤집어 내용물을 충분히 섞으세요. 이로 인해 최종 부피는 186 μL이고, 샘플당 소화 반응에서 최종 DNase I 농도는 약 0.15 단위/μL입니다.
   7. 튜브 벽에 남은 액체를 빠르게 돌려 모으세요.
   8. 샘플 튜브를 RT에서 15분간 인큐베이팅하세요.
   9. 각 샘플에 320 μL 고염 세척 완충제(재료표 참조)를 전달하고 샘플을 완전히 혼합합니다. 이로 인해 샘플당 최종 부피는 506 μL가 됩니다.
   10. 각 튜브에 720 μL의 절대 에탄올을 전달하고, 피펫팅(원심분리 필요)으로 샘플을 혼합한 후 즉시 진행합니다. 이로 인해 샘플당 최종 부피는 1,226 μL가 됩니다.
       주의: 절대 에탄올은 매우 인화성이 강합니다. 폐기물 에탄올은 지정된 비할로겐 유기 용매 폐기물 용기에 수집하여 적절히 처리하세요.
   11. 샘플 혼합물 700 μL를 정제 컬럼(2 mL 수집관에 배치, 재료표 참조)으로 옮깁니다. 뚜껑을 부드럽게 닫고 8,000 × g (15초)에서 원심분리합니다.
   12. 수집관의 흐름을 버리세요. 정화 기둥을 유지하세요.
   13. 5.4.11부터 5.4.12까지 반복합니다.
   14. 각 샘플 튜브에 500μL 에탄올 기반 세척 버퍼(재료 표 참조)를 추가하세요. 뚜껑을 부드럽게 닫고 8,000 × g (15초)에서 원심분리합니다. 그 다음, 수집관의 흐름을 버립니다.
   15. 5.4.14 단계를 전부 반복하며, 단지 원심분리 시간을 8,000 × g에서 2분으로 늘리는 것만 다릅니다.
   16. 각 정제 컬럼을 새로운 2.0 mL 튜브로 옮깁니다. 캡을 열고 14,000 × g (5분) 원심분리기로 사용한 후 튜브와 잔류 액체를 버립니다.
   17. 각 정제 컬럼을 새로운 1.5 mL 튜브로 옮깁니다. RNase 무첨가 물 16 μL 피펫을 막에 부은 뒤 캡을 닫은 뒤, 14,000 × g (5분)에서 원심분리하여 전체 RNA의 용출을 촉진합니다.
       참고: 5.5단계와 5.6단계에서는 모든 용출된 RNA 샘플을 얼음 위에 보관하여 분해를 방지하세요.
5. RNA 샘플을 정량화하고 분광광도계로 순도(A₂₆₀/_{A 280} 비율)를 확인합니다.
   참고: 이 단계의 농도와 순도(A₂₆₀/_{A 280} 비율) 측정과 5.6단계의 무결성 평가는 RNA 회수 성공을 위한 결정적인 정량적 검사 기준이 됩니다. 투명한 RNA 용출액이 예상됩니다.
6. 1% 겔 농도로 아가로스 겔 전기영동을 수행하고, 바이오분석기 시스템을 사용하여 RNA 무결 수(RIN)를 측정하여 RNA 품질을 평가합니다.
7. RNA 샘플은 qRT-PCR 또는 RNA-Seq를 수행할 때까지 -80 °C에 보관합니다.

6. RNA 분석

참고: qRT-PCR은 6.1단계와 6.2단계에서, RNA-Seq는 6.3단계에 기술되어 있습니다.

1. 역전사 반응 혼합물을 준비하고 얼음 위에 반응당 총 RNA 50ng를 추가합니다. 제공된 지침에 따라 열 사이클러를 이용한 역전사 반응을 진행하세요(재료 표 참조).
2. 얼음 위에서는 제조사의 지침에 따라 β-액틴 용 정량적 PCR 마스터 믹스를 준비하세요(프라이머 서 열은 재료 표 참조). 제조사가 권장하는 사이클링 프로토콜을 사용하여 반응당 10 ng의 cDNA를 사용하여 정량적 PCR 시스템에 실시간 PCR 증폭을 수행합니다.
3. 저입력 가닥 키트(재료 표 참조)를 사용하여 총 RNA 50 ng로 RNA-Seq 라이브러리를 구성합니다. 생물분석기 시스템으로 라이브러리 크기와 농도를 결정한 후(재료 표 참조), 고처리량 플랫폼에서 쌍말 시퀀싱을 수행합니다( 재료표 참조).

Results

실험 워크플로우는 PFA 고정, 30% 자당 탈수, OCT 임베딩 및 냉동절부, 헤마톡실린 염색, LCM을 이용한 표적 영역(~1,000 세포)의 식별 및 정밀한 수집, 세포 용해, RNA 분리, RNA 품질 관리 지표 및 두 가지 주요 분석 응용 분야를 포함하여 그림 1에 개요되어 있습니다. PEN 슬라이드의 헤마톡실린 염색된 간 절편은 미세한 간 조직의 레이저 캡처 전(그림 2A)과 (그림 2B) 전후로 현미경으로 보입니다. 미세소포성 지방증을 보이는 관심 영역은 PCR 튜브의 캡에 정밀히 수집되어 세포 형태를 온전히 보존하였습니다(그림 2C).

복제당 약 1,000개와 2,000개의 LCM 포획 세포에서...

Discussion

LCM의 강점은 선택된 세포나 조직 영역을 정밀하게 현장에서 포획하여 이질적인 조직 내 특정 부위를 연구할 수 있게 하는 데 있습니다. 하지만 낮은 샘플 수율, 시간이 많이 소요되는 공정, 높은 비용, 그리고 특수 장비의 필요성으로 인해 이 기술의 광범위한 적용은 실험실²³에서 제한되었다. 본 연구에서는 LCM-RNA 프로토콜이 주요 역사적 한계를 극복하기 위해 확립되었습니다. 이 프로토콜은 빠른 헤마톡실린 염색 단계(~10초)를 구현했으며, FFPE 대신 PFA/OCT 임베딩을 사용하여 많은 고정 조직 프로토콜에서 요구되는 시간 소모적인 자일렌 탈파라핀화 단계를 없애었습니다. 단일 튜브 수집 전략은 중간 이동을 피하여 샘플 손실과 피펫팅 단계를 줄입니다. 막 둘레를 마운팅 매체로 밀봉하면 일반적인 수분 문제를 방지하여 첫 시도 성공률과^{절단 효율을} 높입니다. PFA 적...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<강>물질
0.2ml 얇은 벽 튜브	악시겐	PCR-02-C	LCM 수집용 진공관
1.5 mL 원심분리기 튜브	악시겐	339653
4% 파라포름알데히드	리아젠	DF0135
50 mL 원심분리기 튜브	서모피셔 사이언티픽	339653
DEPC(디에틸 피로카보네이트)	시그마	D-5758
DNase I 소화 세트	치아겐	73504	RNeasy FFPE 키트의 구성 요소로, DNase I 정액과 DNase 부스터 버퍼를 포함합니다.
에탄올 (100%)	써모피셔 사이언티브	BP2818	분자생물학을 위한 정제
에탄올 기반 워시 버퍼	치아겐	73504	버퍼 RPE (RNeasy FFPE 키트의 구성 요소)
고염 워시 완충제	치아겐	73504	버퍼 RBC(RNeasy FFPE 키트의 구성 요소)
저프로파일 미크톰 블레이드	라이카 바이오시스템	819
마이어' S 헤마톡실린	리아젠	DH0001
OCT 복합물	사쿠라	4583
PEN 막 코팅 슬라이드	라이카	11505188
인산염 완충 식염수	리아젠	CC0010	DNase/RNase 프리
폴리-L-라이신	맥클린	P875131S
단백질분해효소 K 소화 완충제	치아겐	73504	버퍼 PKD (RNeasy FFPE 키트의 구성 요소)
정제 기둥	치아겐	73504	RNeasy MinElute 스핀 컬럼 (RNeasy FFPE 키트의 구성 요소)
정량적 PCR 마스터 믹스	타카라 소개	RR820A	TB 그린 프리믹스 Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)
역전사 키트	치아겐	205411	QuantiNova 역전사 키트
RNA 추출 키트	치아겐	73504	RNeasy FFPE 키트
RNA 시퀀싱 키트 (저입력, 스트랜드)	타카라 소개	634412	SMARTer 가닥 총 RNA-seq 키트 - 피코 입력 포유류 v2
RNase 오염 제거제	솔라비오	SR0040	청소
자당	맥클린	S818049
<스트롱>동물과 식단
마우스: C57BL/6J	광둥성 실험동물센터	03
<강한> 특별 식단 및 물을 마시
고지방, 콜린 결핍 식단(기본 식단)	트로픽 동물 사료 하이테크 주식회사	TP36310M	다량영양소: 단백질, 14 kcal%; 탄수화물 26 kcal%; 지방, 60 kcal)
설탕 보충 식수	맥클린	해당 없음 (사내 준비)	D-포도당(Macklin, Cat# F87500)과 D-과당(Macklin, Cat# S818049)의 혼합물을 42 g/L의 최종 농도로 오토클레이브된 식수에 첨가했으며, 포도당과 과당 비율은 55:45(w/w)였습니다
<강>마우스 프라이머
β-actin (앞문: AGAGGGAAATCGTGGTGGTGAC)	BGI 시퀀싱	커스텀	HPLC 정제
β-actin (역방향: CAATAGTGATGACCTGGCCGT)	BGI 시퀀싱	커스텀	HPLC 정제
<스트롱>장비
크라이오스탯 미크토름	라이카 바이오시스템	CM3050 S
바이오분석기 시스템	애질런트	G2939BA
고처리량 시퀀싱 플랫폼	일루미나; 주식회사.	노바Seq 6000 시스템
레이저 캡처 미세해부 시스템	라이카 마이크로시스템즈	라이카 LMD6500
정량적 PCR 시스템	응용 생명 시스템	QuantStudio 5 실시간 PCR 시스템
분광광도계	서모피셔 사이언티픽	NP80	나노드롭
열 사이클러	바이오래드	T100
Software
어도비 일러스트레이터 CC 2019 (버전 23.0.2)	어도비	https://www.adobe.com/products/illustrator.html
그래프패드 프리즈 (버전 8.3.0)	그래프패드 소프트웨어	https://www.graphpad.com