방법 논문

히르슈스프룽병 환자의 신경절 및 강절 대장 구간 프로파일링을 위한 단세포 RNA 시퀀싱

114 조회수

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DOI:

10.3791/69825

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2026년 5월 22일

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1Department of Gastrointestinal Surgery, The Second Affiliated Hospital of Zunyi Medical University

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 Hirschsprung 질환에서 신경절 및 고강 세포 대장 구간 간 면역세포 침윤 및 세포 유형 특이적 전사 차이를 분석하기 위한 단일 세포 RNA 시퀀싱 워크플로우를 설명합니다.

초록

히르슈스프룽병(HSCR)은 장부 말위부에 장신경세포가 없는 것이 특징인 선천성 장 운동성 장애입니다. 대량 RNA 시퀀싱과 비교할 때, 단세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq)은 단일 세포 수준에서 유전자 발현 프로파일링을 가능하게 하여, 집단 평균 분석에서 가려진 세포 이질성을 해결합니다. HSCR 환자의 신경절 및 신경절 구간의 전사 지형을 특성화하기 위한 표준화된 scRNA-seq 워크플로우가 구축되었습니다. 대장 조직을 채취하고, 헤마톡실린과 에오신 염색을 통해 신경절 및 신경절 부위를 확인하였다. 조직은 효소 및 기계적으로 단세포 현탁액으로 해리된 후, 여과, 생존 가능성 평가, 단세포 전사체 라이브러리 구축이 이루어졌다. 품질 관리를 통과한 라이브러리는 시퀀싱되었고, 원시 데이터는 셀 정량화 및 품질 필터링을 위해 처리되어 저품질 셀과 기술적 인공물을 제거했습니다. 정규화와 차원 감소 후, 세포는 확립된 마커 유전자를 기반으로 클러스터링되고 주석을 달았습니다. 후속 분석에서는 신경절 조직과 아골글리온성 조직 간의 세포형 구성을 비교하고, 주요 면역 세포 하위 집합 내에서 차별적으로 발현된 유전자를 확인하였습니다. 결과는 HSCR에서 신경절 구간과 강절 간 면역 미세환경에서 상당한 차이를 보여줍니다.

서론

히르슈스프룽병(HSCR)은 전 세계적으로 약 5,000명 중 1명의 생존 출생아 중 발생률을 보이는 가장 흔한 선천성 장 운동 장애 중 하나입니다. 이 질환은 배아 5주에서 12주 사이에 장신경능선세포(ENCC)가 원위 장으로 이동하지 못해 영향을 받은 구간에 장신경절이 결여됨에서 발생합니다2. 따라서 아골글리온(aganglionic section)은 지속적인 경련성 수축과 연동운동 저하를 보여 근위 장 확장을 초래합니다. 임상적으로는 기능적 폐색으로 나타나 변비, 복부 팽창, 구토를 유발하며, 심한 경우 생명을 위협할 수 있습니다. 신경절 절제는 HSCR의 주요 치료법으로 남아 있습니다. 그러나 상당수의 환자들은 변비, 장염, 대변 오염 등 수술 후 합병증을 경험하여 삶의 질을 크게 저하시킵니다3. 또한, 광범위한 장 절제 수술 후 단장 증후군(SBS)이 발생할 수 있어 영양 흡수 저하와 임상적 관리 도전 증가가 발생할 수 있습니다. 따라서 HSCR의 기전 규명과 새로운 치료 표적 식별은 여전히 중요한 임상적 과제로 남아 있습니다.

최근 몇 년간 단세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq)은 질병 관련 분자 기전을 연구하는 데 널리 적용되고 있습니다. 기존의 대량 RNA 시퀀싱과 달리, scRNA-seq는 단일 세포 해상도로 유전자 발현 분석을 가능하게 하여, 대량 분석에서 가려진 세포 이질성과 희귀 하위 집단을 식별할 수있습니다. 결과적으로 scRNA-seq는 세포 이질성과 세포 간 소통을 해부하는 강력한 도구로 부상하여 생물학과 의학 연구를 진전시키고 있습니다. 이 접근법은 알츠하이머병6, 류마티스 관절염7, 폐암8, 제2형 당뇨병9 등 복잡한 질환에서 새로운 병원성 기전과 치료 표적을 밝혀냈습니다.

본 연구에서는 scRNA-seq를 HSCR 환자의 신경절 및 강절 대장 조직에서 면역세포 전사 지형과 침윤 패턴을 특성화하는 데 적용되었습니다. 작업 흐름은 세 가지 주요 단계로 구성되었습니다: 단일 세포 현탁액의 준비 및 품질 평가, 3′ 단일 세포 RNA-seq 라이브러리 구축, 그리고 하위 생물정보학 분석. 조직 샘플은 절제 직후 전용 단세포 보존액에 보존되었고, 48시간 이내에 효소적으로 단세포 현탁액으로 해리되었습니다. 세포 생존율은 80%를 초과했으며, 최종 세포 농도는 라이브러리 준비 전에 700–1,500 세포/μL로 조정되었습니다. 신경절과 강절 간 면역 세포 침윤을 비교하였고, 뚜렷한 전사 차이를 보이는 면역 세포 하위 집단이 확인되었습니다. 이 분석들은 HSCR에서 대장 병리와 관련된 면역세포 변이를 구명합니다.

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프로토콜

이 연구는 준이 의과대학 산하 병원 기관 윤리 위원회(승인 번호: KYLL-2024-030)의 승인을 받았습니다. 이 연구는 헬싱키 선언을 준수합니다. 모든 참가자와 그 보호자로부터 구두 및 서면 동의를 받았습니다. 표 1은 HSCR 환자에 대한 정보를 제시합니다.

준이의과대학 소아외과에서 진단받고 수술을 받는 HSCR 환자들로부터 결절 및 강절 구간을 포함한 대장 조직을 채취합니다. 두 명의 남성 HSCR 환자에서 신경절 및 신경절 분절을 포함합니다. 자세한 임상 정보는 표 1에 제공되어 있습니다. 모든 시약, 화학물질, 장비 및 소프트웨어는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 헤마톡실린 및 에오신 염색

  1. 조직 채취 및 고정
    1. 장 조직 샘플을 4% 파라포름알데히드 고정액에 최소 24시간 고정하세요.
      주의: 파라포름알데히드는 독성이 있으며 포름알데히드 증기를 방출합니다. 모든 절차를 화학 훈공 후드에서 수행하고 적절한 개인 보호 장비를 착용하세요.
    2. 조직을 약 5 × 5 × 2 mm3 로 메스로 다듬습니다. 휴지를 삽입 카세트에 넣고 흐르는 수돗물에 24시간 헹구세요.
      참고: 조직 가장자리를 제거하고 최소 한 개의 평평한 면을 가진 블록을 준비하세요. 고르지 않으면 헹군 후 필터 용지 사이에 휴지를 끼워 넣으세요.
  2. 점진적 에탄올 탈수
    1. 조직을 순차적으로 에탄올 용액에 담가: 70% 에탄올을 하룻밤, 80% 에탄올 3시간, 90% 에탄올 2시간, 95% 에탄올 I 2시간, 95% 에탄올 II 1시간, 1시간 100% 에탄올 I, 100% 에탄올 II 30분.
      참고: 에탄올(≥99.7%)을 초순수수와 희석하여 표시된 농도로 만듭니다.
      주의: 화학 연기 후드에서 에탄올 취급을 수행합니다.
    2. 탈수 바구니를 제거하고 단계 사이에 충분히 물을 빼세요.
  3. 정리
    1. 투명도를 위해 조직을 자일렌에 30초간 옮깁니다.
  4. 파라핀 침투 및 박출
    1. 파라핀 왁스는 하루 전에 60°C에서 녹입니다. 신선한 왁스를 세 번의 냉동-해동 사이클에 거품을 제거하세요. 세 번째 사이클 후에는 녹은 파라핀을 필터 페이퍼로 걸러내세요.
    2. 순수 파라핀 왁스(파라핀 왁스 I)에 조직을 1시간 침투하세요.
    3. 파라핀 혼합물(파라핀 왁스 II; 순수 파라핀 왁스: 밀랍 = 8:1)에 2시간 침투.
      참고: 사용 전에 반드시 밀랍을 완전히 녹이고 필터를 걸러보세요.
    4. 파라핀 왁스 II를 임베딩 몰드에 부어. 조직 블록을 세워서 평평하게 놓고 라벨을 붙인 후 굳어지도록 하세요.
  5. 단면 분할
    1. 파라핀 블록을 다듬어 조직을 자르지 않고 매끄러운 표면을 얻으세요.
    2. 블록을 미세토메에 장착하세요. 방향을 조정하고 과도한 파라핀을 제거하세요. 4 μm 두께로 직렬 단면을 절단합니다. 50°C 수조에 단면을 띄우고 유리 슬라이드에 옮깁니다.
    3. 60 °C 오븐에 건조 슬라이드를 넣어 잔여 수분을 제거하세요.
      참고: 12시간에서 48시간 동안 건조 구간.
  6. 탈파라핀화
    1. 순차적으로 배양 시행: 자일렌 I(15분), 자일렌 II(15분), 100% 에탄올 I(5분), 100% 에탄올 II(5분), 90% 에탄올(5분), 80% 에탄올(5분), 70% 에탄올(5분), 증류수(5분).
  7. 헤마톡실린 염색
    1. 헤마톡실린으로 50초 동안 염색 부위를 합니다.
    2. 흐르는 수돗물에 10분간 헹구세요.
  8. 이오신 염색
    1. 에오신으로 스테인 섹션을 40초 동안 염색하세요.
  9. 탈수
    1. 절간을 95% 에탄올 I(30초), 95% 에탄올 II(30초), 100% 에탄올 I(30초), 100% 에탄올 II(30초)에 순차적으로 담가.
  10. 정리
    1. 절반을 자일렌 I에 10분, 자일렌 II에 10분간 옮깁니다.
  11. 장착 및 관찰
    1. 마운팅 매체를 추가하세요. 유리 커버 슬립으로 덮고 기포를 제거하세요.
    2. 장착 매체가 굳어지도록 두세요. 절면을 광학 현미경으로 살펴보세요.

2. 단세포 RNA 시퀀싱

  1. 단셀 현탁액 준비
    1. 장 조직을 가위로 ~1 mm 3 조각으로 갈아내세요.
    2. 1 mg/mL 콜라겐제 II와 0.1 mg/mL DNase I가 포함된 조직 조각을 37°C에서 30분간 부드럽게 흔들리는 플랫폼(60 rpm)에서 부드럽게 교반하여 30분간 배양합니다.
    3. 소화를 종료하려면 태아 소 혈청(FBS)이 포함된 10%를 포함한 같은 양의 냉 DMEM을 추가합니다.
    4. 현탁액을 70μm 셀 스트레이너로 걸러냅니다. 300 × g 에서 4 °C에서 5분간 원심분리기.
    5. 상청액은 버리고 세포 펠릿은 남겨두세요. 0.04% 소 혈청 알부민(BSA)을 함유한 인산 완충 식염수(PBS)로 한 번 세척합니다.
    6. 부드러운 피펫팅으로 세포 덩어리를 해리하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다.
    7. 40 μm 셀 체를 통해 현탁물을 걸러냅니다.
    8. 300 × g 에서 4 °C에서 5분간 원심분리기. 상정액을 버리고 펠릿을 수집하세요.
    9. DMEM에 10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신(P/S)을 포함한 세포를 재현탁합니다.
    10. 트리판 블루 배제법을 사용하여 세포 생존성과 밀도를 결정합니다. 생존 가능성이 >80%인 샘플을 사용하고 농도를 700–1,500 cells/μL로 조절합니다.
      참고: 세포 현탁액과 트리판 블루(1:1)를 혼합하고 혈구계를 사용해 생존 가능한 세포를 세세요.
  2. 도서관 준비
    1. 라이브러리 준비를 위해 한 번에 약 15,000개의 셀을 적재하세요.
      참고: 젤 비드 인-에멀젼(GEM) 마이크로드롭에서 mRNA는 젤 비드 위의 폴리(dT) 올리고뉴클레오타이드로 하이브리드화됩니다.
    2. PCR을 이용한 역전사 및 cDNA를 증폭합니다(95 °C 10분; 95 °C 40 사이클 15초, 60 °C 35초, 72 °C 25초; 최종 연장은 72 °C 25초). 증폭된 cDNA를 사용해 3′ scRNA-seq 라이브러리를 구축하세요.
      참고: CCC 오버행은 cDNA 합성 과정에서 추가되며, 템플릿 전환 올리고뉴클레오타이드(TSO) 서열과 짝을 이룹니다.
    3. 유제를 깨뜨리고 GEM에서 cDNA를 회수하세요.
  3. 라이브러리 품질 관리 및 시퀀싱
    1. 유전자 발현을 정량화하고 조각 크기 분포를 평가합니다.
    2. 형광 qPCR 기기를 사용하여 정확한 정량을 수행합니다.
      참고: 도서관 농도≥10 nM을 확보하세요.
    3. 시퀀싱 기기를 사용하는 시퀀스 라이브러리.
      참고: 리드 구조: 리드 1 (26 bp), 리드 2 (91 bp), i7 지수 (8 bp); 목표 깊이 ~셀당 50,000 리드.
  4. 데이터 품질 관리
    1. 원시 읽기를 참조 데이터베이스에 정렬하세요. UMI 카운팅을 수행하고 유전자별 세포별 행렬을 생성합니다.
    2. 결과를 AnnData(주석 데이터) 형식으로 가져오면 하위 분석이 가능합니다.
    3. UMI, 유전자 수, 미토콘드리아 리드를 기반으로 QC 필터링을 수행합니다.
      참고: 더블릿(스크럽렛)을 제거하세요; <200개 또는 >5,000개의 유전자, total_counts >40,000개, 즉 mt_ratio >20%의 유전자를 가진 세포는 제외합니다.
  5. 차원 축소 및 주석
    1. 정규화 고유 분자 식별자(UMI)는 세포당 10,000개까지 개수를 세합니다.
    2. 변이가 큰 유전자를 식별하세요.
    3. 주성분 분석(PCA)을 수행하세요.
    4. k-최근접 이웃 그래프를 구성합니다.
    5. UMAP 임베딩을 수행하세요.
    6. Scanpy(v1.9.3)에서 Leiden 알고리즘을 사용한 클러스터 셀.
      참고: sc.pp.neighbors와 sc.tl.leiden(해상도 = 0.5)을 사용하세요.
    7. 단일 세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq) 데이터에서 세포 유형에 대한 자동화되고 고정밀 주석을 달기 위해 설계된 도구를 사용하여 세포 유형을 주석 달 수 있습니다.
  6. 미분 해석
    1. Seurat(v4.3.0)를 사용하여 R(v4.2.2)에서 차별유전자 발현 분석을 수행하세요.
      참고: FindMarkers 함수와 함께 Wilcoxon 랭크 합 검정을 사용하세요.
    2. enrichGO와 함께 clusterProfiler(v4.8.1)를 사용하여 GO 농축 분석을 수행합니다.
      참고: CC, MF, BP 카테고리가 포함되어 있습니다.
    3. enrichKEGG10과 함께 clusterProfiler(v4.8.1)를 사용하여 KEGG 경로 농축 분석을 수행합니다.

3. 폐기물 처리

  1. 파라포름알데히드와 자일렌 함유 폐기물을 따로 수집하세요.
  2. 적절할 경우 산성 용액을 중화하거나 유해 폐기물로 폐기하세요.
  3. 기관 환경 보건 및 안전(EHS) 규정을 준수하세요.

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결과

헤마톡실린과 에오신(HE) 염색(그림 1)은 신경절과 강절 구간 간에 뚜렷한 조직학적 차이를 드러냈습니다. 신경절 분절과 비교할 때, 신경절 분절은 점막 박탈이 증가하고, 고블릿 세포와 점막하 뉴런이 현저히 감소하며, 점막과 근육층 경계가 흐려졌다. 일부 절편에서는 조직 보존이 최적이 아니었으며, 부분적인 상피 박리와 조직 구조의 붕괴로 인해 조직학적 평가가 제한되었습니다.

품질 관리(QC) 필터링 후, 그룹당 6,000개 이상의 셀이 후속 분석을 위해 보관되었습니다(표 2; 그림 2). 차원 축소와 군집화를 위해 균등 다양체 근사 및 투영(UMAP)이 적용되었습니다. 정준 마커 유전자 발현을 바탕으로 세포는 24개의 전사적으로 구별되는 클러스터로 분류되었습니다(

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토론

단일 세포 RNA 시퀀싱을 통해 히르슈스프룽 질환 환자에서 외과적으로 절제된 대장 조직(신경절 및 고절 분절)의 전사 특징을 프로파일링하는 데 적용되었습니다 4,5. 특히 해리 매개변수가 세포 회복, 세포 유형 표현, RNA 무결성에 영향을 미치는 조직 해리 전략에 주목했습니다. 효소적 소화 조건은 충분한 조직 해리와 세포 생존력 및 전사체 질 보존의 균형을 맞추도록 최적화되었습니다. 밀도가 높은 세포외 기질과 복잡한 장 조직 구조를 고려할 때, 적당한 효소 강도와 조절된 잠복 시간이 사용되어 세포 손상, 스트레스로 인한 전사 인공물, RNA 분해를 최소화하였습니다.

해리 효율은 세포 유형에 따라 다르며, 특히 면역 세포 등 특정 집단은 효소 소화와 기계적 해리 과정에서 손실에 더 취약할 수 있습니다. 따라서 scR...

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공개 사항

저자들은 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 작업은 구이저우 과학기술프로젝트(구이저우 과학기술협력 - 재단 - ZK - [2024] General 344)(양 X.F. 제공)와 준이 과학기술 프로젝트 계약(과학기술 협력) (조니 과학기술 협력 HZ (2023) 번호)의 지원을 받았습니다. (Y. Qu에게)

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
밀랍시노팜 화학 시약 주식회사8012-89-3그리고 nbsp; https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/8012-89-3
밀랍시노팜 화학 시약 주식회사8012-89-3그리고 nbsp; https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/8012-89-3
소 혈청 알부민서모피셔30066575그리고 nbsp; https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/30066575? SID=srch-srp-30066575
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셀타이피스트해당 없음NAhttp://celltypist.org/tutorials/onlineguide
셀타이피스트해당 없음NAhttp://celltypist.org/tutorials/onlineguide
클러스터 프로파일러 패키지생체도체v4.8.1https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/clusterProfiler.html
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콜라게나제 II서모피셔17101015그리고 nbsp; https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/17101015? SID=srch-srp-17101015
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커버 유리CITOTEST80340-0130그리고 nbsp; https://cn.citotest.com/pd40971476.html
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일회용 미세절기 블레이드깃털S-35그리고 nbsp; https://www.feather.co.jp/en/m_Products/pathology01.html
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DNase I서모피셔18047019그리고 nbsp; https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/18047019? SID=srch-srp-18047019
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건조 오븐보룩DHG-9140A그리고 nbsp; http://www.shboruike.com/sys-pd/84.html
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둘벡코 s 변형 이글 미디엄서모피셔12491015그리고 nbsp; https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/12491015
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헤마톡실린 및 에오신 염색 키트비요타임C0105S그리고 nbsp; https://m.beyotime.com/mobilegoods.do?method=code& 코드=C0105S
헤마톡실린 및 에오신 염색 키트비요타임C0105S그리고 nbsp; https://m.beyotime.com/mobilegoods.do?method=code& 코드=C0105S
염산시노팜 화학 시약 주식회사10011028그리고 nbsp; https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/10011028
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현미경 슬라이드CITOTEST80302-3111그리고 nbsp; https://cn.citotest.com/pd530614548.html
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장착 매체비요타임C0173-100ml그리고 nbsp; https://m.beyotime.com/mobilegoods.do?method=code& 코드=C0173-100ml
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광학 현미경니콘이립스 SI그리고 nbsp; https://www.microscope.healthcare.nikon.com/ja_JP/products/upright-microscopes/eclipse-si
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파라핀 왁스  시노팜 화학 시약 주식회사8002-74-2그리고 nbsp; https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/8002-74-2
파라핀 왁스  시노팜 화학 시약 주식회사8002-74-2그리고 nbsp; https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/8002-74-2
파라포름알데히드 고정 용액비요타임P0099-3L그리고 nbsp; https://m.beyotime.com/mobilegoods.do?method=code& 코드=P0099-3L
파라포름알데히드 고정 용액비요타임P0099-3L그리고 nbsp; https://m.beyotime.com/mobilegoods.do?method=code& 코드=P0099-3L
페니실린&대시; 스트렙토마이신서모피셔15140122그리고 nbsp; https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/15140122? SID=srch-srp-15140122
페니실린&대시; 스트렙토마이신서모피셔15140122그리고 nbsp; https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/15140122? SID=srch-srp-15140122
인산 완충 식염수서모피셔10010023그리고 nbsp; https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/10010023
인산 완충 식염수서모피셔10010023그리고 nbsp; https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/10010023
정성적 여과지솔라비오YA0166https://www.solarbio.com
정성적 여과지솔라비오YA0166https://www.solarbio.com
R 소프트웨어 패키지R 통계 컴퓨팅 재단v4.2.2https://www.r-project.org/
R 소프트웨어 패키지R 통계 컴퓨팅 재단v4.2.2https://www.r-project.org/
회전 미세토름라이카라이카 RM2125 RTShttps://www.leicabiosystems.com/en-jp/histology-equipment/microtomes/histocore-biocut/
회전 미세토름라이카라이카 RM2125 RTShttps://www.leicabiosystems.com/en-jp/histology-equipment/microtomes/histocore-biocut/
스캐피커뮤니티 개발v1.9.3https://scanpy.readthedocs.io/en/latest/?utm_source=chatgpt.com
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참고문헌

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