디지털 현미경을 이용한 면화 잎과 포엽 꿀의 시각화를 통해 점수 정확도 향상과 데이터 보존

Summary

여기서는 디지털 현미경으로 생성된 이미지를 사용해 목화 식물의 잎과 포엽 꿀관을 표현형화하는 단계별 과정을 설명합니다. 이 방법은 면화의 잎과 포상의 꿀을 표시하는 데 효과적인 방법으로, 정보를 디지털 이미지 형태로 수집하고 보존할 수 있습니다.

Abstract

꿀샘은 많은 식물 종에 존재하는 독특한 꿀샘입니다. 꿀은 다양한 구조와 기능을 보입니다. 면화에서는 꿀 형질의 전통적인 점수 측정이 오류가 잦고 신뢰할 수 없으며, 이 형질의 표현형이 육안으로는 보이지 않는 경우가 많아 한계가 있습니다. 꿀 형질 발현은 Ne1 및/또는 Ne2 유전자에 의해 조절됩니다.또한, 형질 발현은 환경과 성장 단계에 의해 영향을 받을 수 있어 정확한 점수 매기기의 필요성을 강조합니다. 특히, 디지털 이미지를 이용한 표현형 점수 측정은 꿀의 정확한 점수 측정 방식을 가능하게 합니다. 이 방법은 고해상도 이미지를 생성함으로써 전통적인 점수 매기기의 한계를 극복합니다. 또한, 이 디지털 이미지를 보존하여 향후 참고를 위해 꿀 형질 발현의 미세한 차이를 식별하고 구분하는 데 도움을 줍니다. 여기서 설명한 이 표현형 평가 방법은 분비선, 털, 색깔 등 다른 식물 특성에도 쉽게 적용할 수 있습니다. 이 점수 매기기는 다른 식물 종에 맞게 조정할 수 있습니다. 이 글에서는 필드나 온실에서 샘플을 채취하고, 디지털 현미경으로 해부하여 관찰하며, 향후 채점 분석을 위해 이 이미지를 보존하는 단계별 절차를 설명합니다. 이 방법에서는 예를 들어 목화 식물의 잎과 포엽 샘플을 점수 채굴하여 꿀(완전히 발달, 축소, 퇴화된 상태)과 꿀의 부재를 구분할 것입니다.

Introduction

식물은 대부분의 속자식물, 일부 양치식물, 일부 순씨식물에서 꿀을 합성하고 생산하는 특수한 샘을 가지고 있습니다 1,2,3,4. 꿀은 꿀을 생성하는 세포의 기원에 따라 중엽형, 삼엽형, 상피형의 세 가지 유형으로 분류^됩니다. 면화의 꿀은 유두라 불리는 분비선 트리코움으로 구성된 변형된 기공이며, 삼염형 ^5,6으로 분류됩니다. 대부분의 고시피움 종은 꿀을 가지고 있으며; 하지만 이 속에 존재하는 꿀의 수는 종마다^{다릅니다.} 식물에서는 꽃 꿀(FN)이 꽃 외 꿀즙(EFN)보다 더 흔합니다⁸. 이 꿀은 뿌리 ^1,2를 제외한 식물 어디에나 나타날 수 있습니다. 예를 들어, Gossypium hirsutum은 꽃과 꽃 외 꿀을 모두 보^{입니다. 9}. 국내 면화 식물은 꽃향 3개와 꽃 꿀 1개를 보입니다¹⁰. 세 개의 추가 꽃 꿀은 잎, 포엽, 그리고 원형 꿀(circumbracteal nectary^)입니다. 잎 꿀은 영양성이며 보통 중간맥 아래쪽 잎에 존재하며, 포엽과 주변 꿀은 생식하며 포엽과 복부 꽃포각 표면의 기저부에서 발달합니다. 꽃 꿀은 꽃과 관련이 있으며, 꽃은 꽃다발의 상부(adaxial surface)에서 발달합니다. 이 꿀 형질은 단일 유전자 좌위¹²에 의해 조절됩니다. 두 개의 독립 연구 그룹의 연구에서 꿀 형질은 A 게놈의 Ne1 또는 D 게놈의 Ne2 유전자에 의해 조절되며, 각각 염색체 12와 26에 매핑되어^12,13에 매핑되어 있음을 확인했습니다. 이 형질은 이중 열성 상태에서만 발현되므로, 호모접합 열성 상태에서만 꿀 없는 형질을 발현할 수 있습니다.

이 유전자 외에도 환경 조건과 성장 단계가 발현 정도를 조절하는 데 역할을 합니다. 따라서 이 특성을 평가하는 정확한 방법이 필요합니다. 현재 연구는 면화에서 잎과 포엽 꿀의 표현형에 초점을 맞추고 있습니다. 눈에 띄는 꿀을 생성하는 식물은 꿀이 있는 것으로 평가되며, 이 특성이 없는 식물은 꿀이 없는 ^1,2,3,4로 평가됩니다. 이 글의 주요 목적은 디지털 현미경 기술을 이용한 꿀 형질의 정확한 점수 측정 방법을 제시하는 것입니다. 전통적인 직접적인 육안으로 점수 매기는 꿀 형질의 표현 변이 차이를 육안으로 쉽게 감지할 수 없습니다. 이러한 꿀 특성 발현의 미묘한 차이는 디지털 현미경을 통해 시각화할 수 있습니다. 예를 들어, 면잎 꿀의 점수 기준은 1-4의 표준 척도를 따르며, 1은 꿀이 없음, 2는 정맥 표현형의 돌출, 3은 꿀이 없는 미발달 패드나 능선, 4는 투명한 패드와 능선이 있는 완전하거나 완전한 꿀통을 나타냅니다¹³. 이 표현형 점수는 잎 꿀의 디지털 이미지를 사용하여 [잎 중갈의 아브사이드(아래쪽) 디지털 이미지를 사용]을 사용하여 생성되었습니다. 일반적으로 꿀이 없는 경우는 0으로 점수를 받지만, 통계적 유의성을 위해 0 값은 1로 대체할 수 없습니다. 따라서 표현형 점수 범위는 표준화된 분류인 0-4¹³에서 1-4로 수정되었습니다. 꽃의 점수 기준은 1-4의 유사한 점수 패턴을 따릅니다. 여기서 1은 꿀이 없고 뚜렷한 샘이 없으며 패드나 능선이 없는 경우, 2는 꿀이 미세한 패드 무늬만 있고 꿀이 없는 가려진 샘, 3은 약하거나 희미하거나 없는 미완성된 샘, 4는 꿀이 있는 완전히 형성된 꿀샘을 나타냅니다. 이 점수 패턴은 꿀이 있는 표현형(한 유전자에 대해 동형접합/이형접합 우성)에서 4점, 이형접합과 마찬가지로 꿀 형질의 차별 발현에 대해 3, 2점, 그리고 꿀이 없는 경우(두 유전자 모두 동형접합 열성)에서 1점을 보여줍니다.

마찬가지로, 꽃은 이 글에서 설명한 대로 단계별로 수집 및 해부하여 포엽 꿀을 채취하기 위한 디지털 이미지를 수집합니다. 이 표현형은 현미경으로 시각화하여 정확한 점수 채점이 가능하며, 이를 디지털 이미지 형태로 저장할 수 있습니다. 면화에서는 꿀 특성이 수분 매개자를 끌어들일 뿐만 아니라 수확량 손실을 일으키는 해충도 끌어들인다¹⁴. 이 문제를 해결하기 위해 육종가들은 꿀이 없는 식물을 선택해 화학 농약 없이 자연적으로 해충을 방제했습니다^9,15. 꿀 없는 형질은 원래 다음에서 도입되었습니다 Gossypium tomentosum 로 Gossypium hirsutum (업랜드 면화 재배)⁸. 이 점수 측정 방법은 꿀이 있는 부모와 꿀이 없는 부모를 교배하여 생성되는 집단 내 무꿀 특성 분리를 식별하는 데 특히 유용합니다. 이러한 다양한 부모의 교배 결과, F₂ (2차 사육 세대)는 동형접합 꿀집, 이형접합 꿀집, 동형접합 꿀 없는 유전자형을 보여준다. 꿀 형질 발현에는 우성 유전자가 하나만 필요하며, 이는 15:1(9:3:3:1)의 분리 비율을 따릅니다. 따라서 16명 중 1명은 유전자형과 함께 동형접합 열성 상태에서 꿀 없는 형질을 발현합니다 ne1ne1ne2ne2. 그러나 번식 프로그램 연구진은 예상보다 더 많은 무분열 계통을 관찰했습니다. 즉, 유전자가 다음과 같이 발현될 때 꿀 형질이 발현된다는 의미입니다. Ne1Ne1Ne2Ne2, Ne1ne1Ne2ne2, ne1ne1Ne2Ne2, ne1ne1Ne2ne2, Ne1ne1ne2ne2, and ne1ne1ne2Ne2. 이러한 동형접합 꿀개 집단에서 꿀 특성 발현의 다양한 패턴(Ne1Ne1Ne2Ne2), 이형접합 꿀(Ne1ne1Ne2ne2), 그리고 동형접합 꿀이 없는 (ne1ne1ne2ne2) 식물은 디지털 이미지에서 시각화된 변화를 감지하여 완벽하게 점수를 매길 수 있습니다^12,13. 꿀이 줄어든 이형접합 식물은 시각적으로 꿀 형질을 보이지 않을 수 있고, 꿀이 없는 무형질과 유사할 수 있기 때문에, 시각적 표현형 분석은 이 형질의 신뢰성 있는 선택에 어려움을 제기합니다. 이러한 문제는 일부 면화 품종에서 꿀이 없는 생장 후반기에 더욱 심각해집니다. 이형접합 식물과 동형접합 꿀이 없는 식물 간의 차이는 디지털 영상으로 쉽게 감지할 수 있는데, 이형접합 식물은 꿀구가 작거나 축소된 반면 동형접합 식물은 이 특성이 전혀 없기 때문입니다. 표현형적으로, 꿀의 존재는 꿀 모양(동형접합/이형접합 유전자 중 최소 하나의 우성 유전자를 가진 형태), 작거나 퇴화된 꿀즙의 존재는 이형접합, 꿀의 부재는 동형접합 무꿀 식물로 분류됩니다. 디지털 이미지 점수 분석은 이형접합 식물을 꿀이 없는 식물로 부정확하게 평가하는 것을 줄였습니다. 마찬가지로, 특성 발현이 가장 큰 중간 개화 단계가 선호됩니다. 따라서 이 단계에서 잎과 꽃 샘플을 수집하여 꿀 형질의 정확하고 신뢰할 수 있는 평가를 위한 표현형 평가 실험을 수행했습니다. 더 나아가, 디지털 현미경을 이용한 꿀 형질의 시각화는 꿀 형질이 없는 집단의 오양성을 예방하거나 감소시킵니다. 이 꿀 형질의 표현형 점수 분석은 무꿀 형질과 관련된 DNA 마커를 식별하는 지도 연구에도 활용되고 있으며, 이를 번식자는 마커 보조 선택(MAS)에 활용할 수 있습니다¹³. 이 점수 측정 기법은 분비선, 털, 색상 등 다른 형질을 연구하는 것 외에도 다른 식물 종에도 확장될 수 있습니다. 전반적으로 디지털 이미지 점수는 고해상도 이미지를 제공함으로써 부정확한 꿀 형질 점수 문제를 해결할 뿐만 아니라, 미묘한 표정 변화를 식별하고 디지털 이미지를 저장하여 향후 사용을 위해 제공합니다. 무흡즙 특성을 가진 면화는 해충 생물방제에 사용될 수 있으며, 이 특성이 곤충과의 유익한 상호작용을 어떻게 촉진하는지에 대한 연구 질문에 답하는 데도 활용됩니다.

Protocol

1. 온실/야외 낙엽 샘플링 (그림 1)

1. 샘플 ID가 적힌 샘플 지퍼락 봉지를 준비하세요. 샘플 봉지는 사용 전까지 실온에 보관하세요.
2. 샘플 채취 하루 전에 쿨러를 냉장고에 넣으세요. 냉동고에서 꺼낸 얼음팩을 쿨러 바닥에 놓으세요. 냉장고 얼음찜질 위에 플라스틱 쟁반을 올려놓으세요.
   참고: 이 목적에는 어떤 휴대용 쿨러도 사용할 수 있습니다. 냉열기를 샘플 채취 장소로 옮긴 후 냉기통을 보관하고 플라스틱 트레이를 넣습니다(이 분리는 샘플이 얼음과 직접 접촉해 발생하는 얼음 손상을 방지합니다).
3. 샘플을 채취할 때 쿨러와 라벨이 붙은 지퍼백을 온실이나 들판으로 옮기세요. 해충 없는 샘플을 채취하기 위해 현장 식물에 정기적인 살포가 예정되어 있었습니다. 마찬가지로 온실 식물의 경우, 건강한 식물에 대해서는 정기적인 살포와 비료 주기가 따랐습니다.
4. 라벨이 붙은 샘플 봉지에 8주에서 12주 정도의 온실이나 밭에서 재배된 목화 식물의 어린 잎 조직을 채취하세요.
   1. 이 단계에서 꿀 특성이 가장 많이 발현되는 중간 개화 단계를 선택하여 샘플을 선택하세요. 이 발달 단계의 모든 식물에서 어린 잎을 선택하세요. 유전적 및 환경적 영향 외에도 꿀 특성은 발달 단계의 영향도 받습니다.
   2. F2 개체군 내 다양한 유전자형을 비교할 때 발달 단계를 일정하게 유지하기 위해, 잎 샘플을 한 단계에서 균일하게 수집하여 이 단계와의 비교를 제한합니다. 5에서 7cm 사이의 잎 크기를 기준으로 사용하지만, 모든 샘플에서 같은 크기의 어린 잎을 채취할 수 있습니다. 오래된 잎은 꿀 특성 발현을 보이지만, 일부 계통에서는 발달 후반부에 꿀 특성이 나타나지 않습니다. 이러한 변동을 피하고 데이터 수집의 일관성을 높이기 위해서는 샘플을 채취할 때 다음 지침을 따르세요.
5. 샘플 잎 조직을 수집하여 해당 샘플 봉지에 넣으세요. 식물 샘플당 최소 2장의 잎을 채취하세요.
6. 잎 조직으로는 식물 윗가지에서 잎 잎 방향으로 5에서 7cm 정도 되는 건강한 잎을 선택하세요.
   참고: 모든 샘플에서 상단 가지에 있는 어린 잎이 선호됩니다. 이러한 샘플 수집은 특정 발달 단계로 샘플링을 제한할 뿐만 아니라, 표본 유형을 일정하게 유지하여 표현형 오차를 줄여줍니다. 기타 조건으로는 접근이 용이하고 잎이 건강하다는 점이 포함됩니다. 동일한 발달 단계에서 여러 개의 식물 잎을 수집하여 개체군 내 유전자형 기반 표현형 차이를 식별하기 위해 일관된 데이터 비교가 이루어집니다.
7. 잎 조직이 든 밀봉된 샘플 봉지를 쿨러에 넣으세요. 쿨러를 실험실로 옮겨.
8. 개별 샘플을 냉장고로 옮겨 4 °C의 냉각 조건을 유지하세요. 꿀의 디지털 영상이 나올 때까지 샘플을 냉장고에 보관하세요. 잎은 디지털 영상을 위해 최대 2일간 보관할 수 있지만, 같은 날 또는 다음 날 촬영하는 것이 선호됩니다.
9. 많은 잎 샘플을 선별할 때는 샘플을 배치로 채취하여 수확 후 1일 이내에 영상 검사를 마무리합니다. 10-20개 단위로 샘플을 채취하거나 여러 개의 쿨러를 사용해 조직 손상이나 조직 접힘을 방지하세요. 좋은 디지털 이미지를 위해 샘플 수집에 주의가 필요합니다.

2. 온실/현장 꽃 샘플링(그림 1)

1. 1.1부터 1.6까지의 단계를 따라가세요. 8주에서 12주 된 온실이나 밭에서 재배한 목화 식물에서 꽃을 채취하세요. 식물 샘플당 최소 2송이의 꽃을 채취하세요.
   1. 꽃은 보통 꽃이 피는 한가운데 있을 때 꼭대기 가지에서 채취하세요. 꿀 특성은 중간 개화 단계에서 가장 높은 표현을 보입니다.
2. 건강한 꽃을 따세요. 밀봉된 샘플 봉지를 최소 두 송이 이상의 꽃이 들어 쿨러에 넣으세요. 쿨러를 실험실로 옮겨.
3. 개별 샘플을 냉장고로 옮겨 4 °C의 냉각 조건을 유지하세요. 포엽 꿀의 디지털 영상 촬영 전까지 샘플을 냉장고에 보관하세요.
   1. 샘플은 수집 후 당일 또는 다음 날 처리하세요. 꽃 샘플을 채취하여 4°C에 보관하고, 같은 날 포엽 꿀을 처리하세요. 다음 날 또는 주 후반에 피어나는 꽃을 수집하고, 같은 날 포엽 꿀의 디지털 이미징을 위해 처리합니다.

3. 디지털 현미경 초기 설정 (보충 그림 1)

참고: 이와 유사한 다른 현미경들도 디지털 캡처 및 저장에 사용할 수 있습니다.

1. 현미경(VHX 600)을 켜고 초기 단계를 완료하세요. 현미경 스테이지 크기와 맞춘 반쯤 접힌 A4 흰색 용지를 놓으세요.
2. 콘솔 컨트롤러에 있는 작은 조명 노브를 이용해 현미경 플랫폼/무대의 조명을 조절하세요.
3. 콘솔의 작은 노브를 최대 높이로 돌리면 최대 조명을, 밝기 스위치(콘솔의 큰 노브)를 3/4 정도 돌리면 중간 높음으로 돌리세요.
4. 내장 VHX 600 소프트웨어는 컴퓨터 화면에서 렌즈 조절 옵션을 보여줍니다. 화면에서 10배 렌즈 옵션을 선택해 렌즈를 10배로 조정하세요. 컴퓨터 전면 화면의 모니터 전원 스위치를 켜면 메인 메뉴가 나타나 렌즈 및 사진 녹화 옵션 옵션이 표시됩니다.
5. 냉장고에서 소량(3개에서 5개) 샘플을 쿨러에 넣어 디지털 이미징을 하세요. 샘플이 든 쿨러를 현미경 옆에 두세요.
6. 도마와 멸균 칼날은 현미경 근처 작업대에 두세요. 쿨러에서 샘플 하나를 꺼내 샘플 조직을 꺼내 디지털 영상을 진행합니다(그림 1).

4. 잎 꿀 디지털 영상 및 기록 (그림 2)

1. 1단계와 3단계를 따라 하세요. 샘플 지퍼락 봉지를 열고 잎 샘플을 도마 위에 올려놓으세요. 멸균된 칼날로 잎자루를 자르세요.
   참고: 칼날을 안전하게 사용하려면 장갑을 착용하고, 칼날의 날카로운 모서리가 손가락에서 멀어지도록 하여 절개할 때 조직을 손가락 사이에 위치시키세요.
2. 잎 조직을 무대 위에 놓인 미리 잘라진 흰색 시트 위에 옮깁니다. 현미경 스테이지 중앙의 잎 조직을 뒤집어 배 쪽이 위를 향하게 합니다.
3. 현미경 노브의 거칠고 미세한 조정을 부드럽게 돌려 잎의 중앙 갈비뼈에 집중하세요. 이미지에 흐림이 없을 때까지 계속 조정하세요.
4. 중갈의 아래쪽 끝에 꿀이 있으므로, 중앙맥과 이후 갈라진 정맥이 관찰된 곳 중앙에 두세요. 잎사귀를 무대 중앙에 집중시키세요.
   참고: 가정용 면화에서는 잎 꿀이 하나만 관찰되며, 야생 개체는 중간 갈기와 양쪽 측면 정맥에 각각 각각 한 개씩 세 개의 꿀을 보입니다(총 꿀 수 :3).
5. 현미경의 거칠고 미세한 조정을 조정하여 디지털 이미지의 선명도를 높이세요. 잎의 꿀 이미지를 캡처하고 저장하기 위해 모든 이미지 조정을 하세요.
   1. 디지털 이미지에 빛이 반사되지 않도록 모든 조명을 끄고 이미지를 컴퓨터 화면에 기록하세요. 방 안의 모든 조명을 끄고 테이블 램프를 사용해 각 샘플을 처리하세요. 모든 작업이 완료된 후 램프를 끄고 현미경 조명만 켜둔 채 이미지를 기록하세요.
6. 프로그램이 여러 저장 옵션을 보여주는 창을 띄우면 이미지를 저장하세요. 각 이미지에 샘플의 ID 번호를 표시하여 저장하세요. 잎 꿀의 디지털 이미지를 1, 2, 3, 4로 점수를 매깁니다. 각 샘플 ID에 대한 점수표를 업데이트하세요.

5. 디지털 영상 및 감낭 꿀샘 채점 (그림 3)

1. 2단계와 3단계를 따라 하세요. 소수의 꽃 샘플(2-3개)을 이뇨병 촬영을 위해 옮깁니다. 지퍼락 봉투에서 꽃 샘플을 꺼내세요.
2. 포도나무를 집자나 손으로 꽃에서 제거하세요. 꽃을 깨끗한 도마 위에 올려놓으세요. 멸균된 칼날로 꽃대를 자르세요. 멸균 칼날을 사용해 제거된 포삭 가장자리를 따라 직선으로 절개하세요.
3. 조직을 미리 잘라진 흰색 시트 위에 거꾸로(잎자루가 위를 향한 채) 현미경 스테이지 위에 놓으세요.
4. 화면에 표시되는 이미지의 선명도를 높이기 위해 거칠고 미세한 조정을 사용하세요. 모든 이미지 조정을 하고 콘솔 컨트롤러의 녹화 버튼을 눌러 잎사귀 이미지를 캡처하세요.
   1. 작은 노브/조명 스위치는 최대 값으로, 큰 노브/밝기 스위치는 중간 높음으로 설정하세요(노브를 3/4^도로 돌림). 그 다음, 현미경의 거칠고 미세한 조정을 회전시켜 이미지 해상도를 향상시킵니다. 이 조정은 일정하게 유지하며 샘플을 전환하여 전체 샘플 세트의 이미지가 기록될 때까지 반복합니다. 디지털 이미지에 빛이 반사되는 것을 피하려면 모든 조명을 끄고 이미지를 컴퓨터에 기록하세요.
5. 그 후 프로그램은 이미지를 저장하라는 모든 컴퓨터 위치를 보여주는 창을 팝니다. 샘플의 ID 번호가 포함된 디지털 이미지를 컴퓨터에 저장하세요.
6. 획득된 디지털 이미지에서 관찰된 표현형을 기준으로 포엽 꿀즙(보충 그림 2)을 1, 2, 3, 4로 채점합니다. 향후 분석을 위해 샘플 ID와 해당 점수를 반영하여 점수표를 업데이트하세요

Results

이 연구에는 8주에서 12주 동안 밭에서 재배한 면화 식물이 선정되었습니다. 각 식물마다 조직 유형별로 최소 두 개의 기술 복제가 수집되었습니다. 건강한 어린 잎 샘플은 5cm에서 7cm 길이의 잎이 있는 상단 가지에서 채취됩니다. 건강한 꽃 샘플은 같은 날 피는 꽃이나 꽃봉오리에서 채취됩니다. 다양한 식물 계통에서 잎과 꽃 샘플을 채취하였고, 현미경을 사용해 실험실에서 두 조직 유형의 디지털 이미지를 생성했습니다(그림 1). 샘플 채취부터 영상 촬영까지 위에서 설명한 절차의 모든 단계를 따랐습니다(그림 2와 그림 3에 설명됨). 잎과 손 두 가지 꿀의 대표 결과는 일반적으로 꿀이 없음(1), 중간 표현형을 가진 꿀이 존재함(2, 3), 그리고 꿀을 생성하는 완전히 발달한 꿀관(4)을 보여준다. 그림 4에서 생성된 데이터는 두 가지 다른 목화 식물(넥터리와 무넥터리)에서 획득한 디지털 이미지입니다. 잎 배쪽 표면(중갈맥 아래쪽)의 디지털 이미지 점수 측정 결과, 두 가지 표현형이 나타났으며, 점수는 1(중앙맥에 꿀이 없음), 4는 완전히 발달한 꿀과 꿀이 있는 경우; 그림 4A, B). 마찬가지로, 꽃 샘플에서 포엽 꿀을 분석했을 때, 꿀이 없는 1과 완전히 형성된 꿀을 생성하는 4의 두 가지 표현형이 나타났습니다; 그림 4C,D). 이상적으로는 같은 식물에서 채집한 잎과 꽃이 같은 패턴을 따라야 하며, 즉 꿀이 없는 잎과 꿀이 없는 꽃은 한 식물에 속하고, 꿀이 있는 잎과 꿀이 있는 꽃은 같은 식물에 속해야 합니다. 그림 5는 꿀에 노출된 식물의 잎과 포쪽 꿀을 10배, 20배, 40배로 디지털 촬영하여 꿀 특성을 명확히 시각화하여 제작했습니다. 또한, 꿀을 가진 면화 부모와 꿀이 없는 부모의 F2_개체군을 구분할 때 이 점수가 어떻게 부여되는지 이해하기 위해, 이들 집단 중 하나에서 잎 조직을 채취하고 각 잎 꿀 샘플마다 디지털 이미지를 제작했습니다. 표준 형식의 1, 2, 3, 4에 해당하는 선택된 잎 디지털 이미지는 그림 6, ¹³에 강조되어 있습니다. 흔하고 쉽게 구별할 수 있는 패턴은 꿀이 없다는 것과 꿀이 존재하는 것입니다. 꿀이 없을 때는 가장 낮은 점수가 부여되며, 완전히 발달한 꿀이 가장 높은 점수인 4점을 받습니다. 1에서 4 사이의 점수 범위인 2, 3은 일반 꿀보다 덜 발달하고 작습니다. 이 패턴은 동형접합 꿀이 없는 상태에서 관찰할 수 있는데, 이는 1개(부재), 2개 및 3개 점수(꿀 감소), 4개(완전 발달) 꿀 상태입니다. 또한, 꿀이 있는 부모계와 없는 부모 계통을 개체군과 함께 키워 비교하고 이해할 수 있습니다.

그림 1: 샘플링부터 디지털 현미경까지의 잎과 포엽 꿀 시각화 단계 . (A) 잎과 꽃 샘플 모두 채취할 중간 개화 단계 목화 식물을 선별합니다. (B) 잎의 꿀 특성을 관찰하기 위해 현장에서 잎 샘플을 수집합니다. (C) 잎을 뒤집어 잎의 뒷면이 위를 향하게 하고, 강조된 검은 상자 영역의 꿀 특성을 관찰합니다. (D) 잎을 현미경 스테이지에 올려놓고, 잎 꿀의 디지털 이미지를 기록하기 위해 강조된 블랙박스 영역에 초점을 유지합니다. (E) 중간 개화 단계에서 밭에서 꽃을 채취한다. (A) (F) 꽃을 도마 위에 올려놓고 화살표 방향으로 흰 상자 부분에 직선으로 파서 꽃 밑동을 분리합니다. (G) 절개 부위를 현미경 스테이지에 올려 포낭 꿀의 디지털 영상을 만듭니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 2: 면화에서 잎 꿀을 디지털 영상화하고 점수 매기는 단계별 절차. 1. 표지판에서 잎 재료를 표지가 붙은 샘플 봉지에 담아 쿨러에 보관한다 2. 샘플이 담긴 쿨러를 실험실 3으로 옮기세요. 쿨러 4에서 개별 샘플을 꺼내세요. 개별 샘플 봉지를 열고 잎 5를 꺼내세요. 잎의 잎자루를 직접 자르거나 칼날을 사용하세요. 6. 잎을 미리 설정된 현미경 스테이지에 올려놓고 밑쪽(아래쪽)을 향하게 한다. 7. 컴퓨터 화면의 VHX 600 프로그램에서 줌을 10배로 조절하세요. 이미지의 해상도를 높이기 위해 현미경의 거친 조정과 미세한 조정을 모두 수행하세요. 8. 컴퓨터 화면에서 관찰된 이미지 조정 사항을 확인하라(작고 큰 노브를 돌려 빛과 밝기를 조절하고, 현미경의 미세한 버튼과 굵은 버튼을 사용해 최상의 이미지 해상도를 얻고, 반사를 제거하기 위해 다른 조명을 끄는 등). 디지털 이미지를 점수 매기기 위해 저장하세요. 잎 속 꿀 주위를 원으로 찍은 점이 8, 9번 이미지에서 잎 꿀 부위를 강조합니다. 현미경으로 10배(100 μm) 배율로 잎 꿀을 관찰하세요. 가정용 목화에서는 잎 꿀이 단 한 개만 관찰됩니다(이 이미지에서 관찰됨). 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 3: 면화에서 포엽 꿀관의 디지털 영상 및 점수 측정을 위한 단계별 절차. 1. 표지판에서 꽃 샘플을 라벨이 붙은 샘플 봉지에 채취해 쿨러에 보관 2. 쿨러에서 샘플 하나를 제거하세요. 꽃 한 송이 제거, 4. 꽃에서 떨어진 곳에서 포엽을 잘라내서 수동으로 제거하세요. 5. 멸균 칼날을 사용해 포근 가장자리를 직선으로 절단합니다( 그림 1 에 흰색 상자 표시, 디지털 포근 꿀 영상 촬영 전 참조) 6. 7번 절개를 뒤집어보세요. 절개된 부분을 잎자루 쪽이 위를 향하게 하여 현미경 스테이지 8단계에 놓으세요. 현미경에 부착된 콘솔의 조명 및 밝기 스위치를 사용해 조명을 조절하세요. 해상도가 좋은 이미지를 수집하려면 현미경에서 거칠고 미세한 조정을 사용하세요. 모든 이미지는 현미경으로 10배(100μm) 배율로 관찰됩니다. 포엽 꿀을 채취하기 위해 디지털 이미지를 수집하세요. 포엽 꿀의 디지털 이미지에서 원이 그려져 있으며, 가정용 면화에는 3개의 포엽 꿀이 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 4: 목화잎 꿀과 포엽 꿀 디지털 이미지. (A) 잎과 꿀이 함께; (B) 꿀이 없는 잎; (C) 포엽 꿀이 3개씩 보이는 꽃, (D) 포엽 꿀이 없는 꽃. 현미경으로 10배(100 μm) 확대율로 잎과 꽃의 꿀을 관찰하세요. 대시 원은 잎 꿀과 포엽 꿀의 존재 여부를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 5: 잎과 포엽 꿀을 10배, 20배, 40배로 확대하여 디지털 이미지에서 꿀을 명확히 식별하였다. (A) 잎 샘플을 채취하여 주갈기의 꿀 특성을 관찰한다. (B) 현미경으로 10배 확대로 중앙맥의 잎 꿀을 관찰합니다. (C) 현미경으로 20배 확대로 중앙맥의 잎 꿀을 관찰합니다. (D) 현미경으로 40배 확대로 중앙맥의 잎 꿀을 관찰한다. (E) 포엽 꿀을 위한 꽃 절개. (F) 10배 확대 확대로 포엽 꿀을 현미경으로 관찰합니다. (G) 20배 확대 현미경으로 포엽 꿀을 관찰합니다. (H) 40배 확대율로 포엽 꿀을 현미경으로 관찰합니다. 각 이미지의 축척 막대는 잎 꿀 또는 포엽 꿀 이미지가 촬영된 배율(여기서는 10배, 20배, 40배)을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 6: 1, 2, 3, 4 패턴을 따른 낙엽 꿀의 표준 점수 패턴. (A) 점선으로 표시된 낙엽 꿀이 없는 잎 샘플 (꿀이 없음 점수 1). (B) 관찰된 작은 잎 꿀은 이형접합 상태 중 하나의 패턴을 보인다(점선 원 그림, 점수 2). (C) 3번 스코어가 있는 잎 꿀, 이형접합체의 또 다른 패턴. (D) 점수 4점의 완전히 형성된 꿀. 10배 스케일은 이미지를 촬영할 때 사용하는 배율을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 7: 현미경을 사용하지 않은 잎 꿀과 손막 꿀. 도형은 전통적인 점수 표시와 함께 꿀이 어떻게 나타나는지를 보여줍니다. 이 수치는¹³에서 변형된 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 8: 개체군의 가능한 유전자형 그림은 다양한 부모(꿀이 있는 개체와 없는 개체)의 교배에서 나온 F₂ 개체군의 유전자형을 보여줍니다. 이 표는¹³에서 각색한 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 그림 1: 디지털 현미경 설치. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 그림 2: 관찰된 다양한 수의 포근 꿀. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하세요.

Discussion

꿀은 식물에서 꿀을 생성하여 성공적인 교차수분을 돕는 특수화된 분비샘 삼모입니다. 식물에는 영양성 및 생식 꿀이 모두 존재합니다. 고시피움 속(목화)에는 50종 이상의 종이 있으며, 대부분은 잎 꿀을 포함하고^{있습니다.} 그러나 이 특성은 면화에서 해충도 끌어들여 추가적인 수확량 손실을 초래합니다¹⁷. 번식가들은 이 문제를 해결하기 위해 G. tomentosum 에서 처음 발견된 자연적으로 존재하는 꿀이 없는 형질(꿀이 없는 형태)을 선택했습니다. 이 때문에 이 무흡즙 특성을 재배된 고지^{대 면화}에 도입했다. 결국 꿀이 있는 계통과 없는 계통을 부모로 선택하여 여러 개체군이 생성되었습니다. 동형접합 무흡즙 집단과 이형접합 무분체 집단은 육안으로 관찰할 때 차이가 없기 때문에, 이 식물들을 구별할 특별한 도구가 필요합니다. 따라서 디지털 현미경을 이용한 이 점수 측정법은 전통적인 점수 측정( 그림 7에 나타난 것)과 달리, 감소된 꿀을 시각화할 뿐만 아니라, 이형접합 꿀이 없는 식물이 동형접합 꿀이 없는 식물로 부정확하게 점수를 매기는 것을 방지합니다.

디지털 이미지를 이용한 표현형 점수 산정은 샘플 채취의 구체적 시점, 샘플 선택, 잎 및 포엽 꿀샘에 대한 표준 점수 척도 사용, 가능한 유전자형, 그리고 후속 응용을 위한 점수 데이터 해석 방법 등 여러 핵심 요소에 따라 달라집니다. 우선, 7월 꽃 중기 동안 잎과 꽃을 모으는 것이 중요합니다. 둘째, 적절한 크기와 단계의 잎이나 꽃 선택은 표현형 점수 부여에 중요한 역할을 합니다. 잎의 경우, 잎잎이 5cm에서 7cm 길이인 윗가지가 잎 꿀즙 자국을 위해 선호되었습니다. 마찬가지로 포대의 꿀 점수를 얻을 때는 꼭대기 가지에서 건강한 꽃이 선택되었습니다. 특정 발달 단계에서 샘플을 선택하는 것이 도움이 되며, 발달 단계별 형질 발현을 제외하고 개체군 내 모든 식물을 비교할 때도 마찬가지입니다( 그림 8에 보시다). 점수 측정이 반복 가능한지 확인하기 위해, 식물당 조직당 최소 두 개의 샘플에 대해 디지털 이미지를 생성했습니다. 동일한 식물의 여러 복제 개체를 수집하는 것은 일관된 데이터 수집에 도움이 됩니다.

이 방법의 가능한 한계는 샘플 채취 전까지 해충 없는 식물을 유지하는 점입니다. 해충 침입 지역은 조직 내에 산란된 조직이나 알의 반점, 또는 진딧물이나 다른 곤충이 먹어 꿀이 눈에 띄지 않는 검은 영역이 있는 꿀 부위 손상으로 식별할 수 있습니다. 이는 수백 개의 샘플을 선별하는 과정에서 관찰되었습니다. 이런 경우에는 건강한 잎과 꽃을 다시 수집하여 샘플에서 일관된 데이터를 분석했습니다. 이 문제는 정기적인 해충 방제 일정을 유지하고 비료를 보충하여 건강한 식물을 키우는 것으로 해결할 수 있습니다. 설명된 모든 중요한 단계를 따르면 표현형 점수 측정 문제 해결에 도움이 됩니다.

이 기술은 DNA 마커를 식별하는 매핑 등 여러 응용이 있으며, 이는 육종가가 마커 보조 선택을 위한 유전자형을 식별하는 데 도움을 줍니다. 이 표현형 점수는 환경 및 발달 단계 영향과 이 형질을 조절하는 유전자들 때문에 DNA 마커의 확인이 필요합니다. 따라서 디지털 현미경을 이용한 이 형질의 표현형을 구분하는 것이 여러 개체군에서 소수의 의심되는 무즙 계통으로 많은 식물을 좁히는 출발점이 될 것입니다. DNA 마커를 사용하여 이 계통들은 새롭게 개발된 품종에서 무효성 형질 매개 질병 저항성 개발을 위한 육종 프로그램에 더욱 검증됩니다. 이 방법은 식물에서 꿀 특성과 유익한 곤충 상호작용의 역할을 이해하는 데도 도움을 줄 수 있습니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
디지털 현미경	키엔스 VHX	VHX 600	다른 현미경도 사용할 수 있습니다
파버웨어 도마	파버웨어	모델 번호 78892-10	14''L x 11''W X 0.5''Th, 어떤 브랜드든 사용할 수 있으며, 이 제품은 amazon.com 에서 구매할 수 있습니다
이글루스 라구나 소형 9쿼터 쿨러	이글루	부품 번호 00043567	프로젝트 필요에 따라 어떤 브랜드나 크기도 사용할 수 있습니다
그리고 nbsp; 비닐봉지 (400개), 3 X 4인치	오베코 브랜드	NA	4''L x 3''W X 0.01''H, 어떤 브랜드든 사용 가능하며, 선호하는 플라스틱 투명색 제품입니다
싱글  엣지 레이저 블레이드, 100팩	위우페	NA	어떤 브랜드든 사용할 수 있으며, 이 제품은 amazon.com 에서 구입할 수 있습니다