방법 논문

재현 가능한 거시적 조직 구성체를 위한 인간 ASC 기반 생체제작의 생물학적 표준화

DOI:

10.3791/69839

⸱

2026년 6월 5일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Eukaryotic Cell Biology (Labio), National Institute of Metrology, Quality and Technology (INMETRO), 2Post-graduation Program of Translational Biomedicine (Biotrans), UNIGRANRIO, 3Post-graduation Program in Biotechnology, National Institute of Metrology, Quality and Technology (INMETRO), 4Post-graduation Program in Science and Technology of Polymers, Laboratory of Catalysis for Polymerization, Recycling and Biodegradable Polymers (LCPRB), Institute of Macromolecules, Federal University of Rio de Janeiro, 5Post-graduation Program in Metrology and Technology, National Institute of Metrology, Quality and Technology (INMETRO), 6Campus of Duque de Caxias, Federal University of Rio de Janeiro

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

본 연구는 지방에서 유래한 줄기세포 구상체와 3D 프린팅된 GelMA 스캐폴드를 이용한 재현 가능한 바이오프로이브레이션 워크플로우를 제시합니다. 공간 제어, 융합 능력, 품질 관리 지표를 입증하여 재생 의학에 잠재적 응용이 가능한 이식 가능한 거시적 조직 구조물을 만들어냅니다.

초록

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실험실 간 표준화된 프로토콜의 부재는 실험 결과의 비교 가능성과 바이오패임베이케이션 기술의 효율적인 이전에 큰 장애물이 됩니다. 엄격한 생물학적 표준화는 재현성을 높일 뿐만 아니라, 조직 공학 전략의 임상 전환에 필수적인 국내외 규제 체계와의 정렬을 촉진합니다. 본 연구는 hADSCs의 단층 배양, 구형 형성, 젤라틴 메타크릴로일(GelMA) 스캐폴드의 3D 프린팅, 구형 생체조립으로 구성된 표준화된 생체제조 워크플로우를 소개합니다. 품질 관리 지표가 통합되어 재현성을 보장했습니다. 3D 프린팅된 GelMA 비계는 두 개의 중앙 구멍으로 설계되었으며, 각 구멍은 수백 개의 구상체를 수용할 수 있었습니다. 인쇄 정확도는 스캐폴드 치수를 CAD 모델과 비교하여 확인되었으며, 약간의 비유의미한 편차가 있었습니다. hADSC는 아가로스 마이크로몰드 내에서 24시간 이내에 균일한 구형체를 형성했다. 구상체가 비계 구멍에 씨앗을 심었을 때, 구체는 72시간 동안 연속적으로 융합되어 공초점 영상으로 확인된 거시적 구조를 형성했다. 비계 설계와 인쇄 정확도는 구조적 지지를 보장했고, 구형 균일성은 구조물의 예측 가능한 형성을 가능하게 했습니다. 비계 기공 내 구형 융합은 비계 유무에 관계없이 이식에 적합한 조직 구조물을 만들어내며, 이 생체 조립 접근법의 유연성을 강조했습니다. 이 연구 결과는 생물학적 표준화가 살아있는 조직 구성체의 생체 제조 재현 방법론을 발전시키는 데 중요한 역할을 한다는 점을 강조하며, 재생 의학 분야의 미래 임상 응용에 유망한 시사점을 지니고 있습니다.

서론

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바이오어셈블리와 바이오프린팅은 조직공학에서 보완적인 바이오패브리케이션 접근법으로,자동화 기술을 사용해 거시적 규모에서 복잡한 조직과 기관을 구성하는 데 중점을 둡니다.

구체는 주로 바이오어셈블리 접근법을 위한 구성 요소로 바이오패브리케이션에 통합되었습니다. 구체는 세포와 주변 조직 미세 환경 간의 상호작용을 생체 내에서 재현하는 미세조직으로 간주됩니다. 구형 형성에 사용되는 세포원 중 지방유래 줄기세포(ADSC)는 분리가 용이하고, 장기 배양 유지되며, 분화 잠재력이 6,7,8로 두드러집니다.

구체는 더 큰 응집체를 형성할 수 있는 고유한 능력 때문에, 바이오어셈블리 접근법을 통해 더 복잡한 조직 구조물을 생성할 수 있습니다. 이 융합 기반 조직은 줄기세포 구체의 재생 및 분화 잠재력을 향상시킵니다 9,10.

구형 생체조립은 생체재료에 의해 지원되거나 심지어 안내될 수 있어, 이 전략은 확장 가능하고 자동화된 생체제작에 적합하다12,13.

기존의 생체제조 전략은 대략적으로 스캐폴드 없는 구형 조립 방식과 하이드로겔 내장형 바이오프린팅 시스템으로 분류할 수 있습니다 2,5,14. 스캐폴드 없는 방법은 자발적 세포 자기 조립과 구체 간 융합에만 의존하며, 내재적 세포 간 상호작용을 활용합니다. 그러나 외부 건축적 지침이나 기하학적 제한 없이 이루어지기 때문에 이러한 접근법은 공간 제어가 줄고 구조적 예측 가능성이 낮아집니다 5,15. 반면, 하이드로겔 기반 캡슐화 접근법은 세포를 벌크 매트릭스 내에 내장하여 구조적 지지와 미리 정의된 구조를 제공하며, 이는 초기 융합 단계에서 세포 간 직접 접촉을 부분적으로 제한하고 세포 이동 역학에 영향을 미칠 수 있다18. 이 틀에서 젤라틴 메타크릴로일(GelMA)과 같은 인쇄 가능한 생체재료는 세포 부착 모티프를 나타내며, 구형 생체 조립을 촉진하는 비계 역할을 할 수 있습니다19. 3D 프린팅된 GelMA 스캐폴드는 구체에 대한 기하학적 가두기와 공간적 안내를 제공하여, 융합을 통한 더 크고 구조적으로 정의된 구조체로 제어된 조직 형성을 촉진할 것으로 가설화됩니다. 이 접근법은 스캐폴드 유도 조직과 구형 융합을 결합하여 구체 생체 조립 중 공간 제어와 구조 재현성을 향상시키는 것을 목표로 합니다. 그러나 현재의 워크플로우는 공정 표준화와 구조 바이오패브리케이션 매개변수에 집중하며, 장기 조직 성숙, 기능적 분화, 대규모 자동화 생산에는 다루지 않습니다.

생물학적 표준화는 재현성과 확장성을 보장할 뿐만 아니라 생체 제조 조직의 기능적 완전성을 보존하는 데 필수적입니다19,20. 따라서 공학적, 기하학적, 구조적 매개변수의 정밀한 제어가 매우 중요하며, 이러한 요인들은 조직 기능과 성숙을 포함한 생물학적 성능에 직접적인 영향을 미칩니다 5,21. 표준화되고 재현 가능한 바이오패브리케이션 워크플로우를 제시하며, 주요 단계를 포함합니다: (1) ASC 단일층 배양; (2) ASC 구형 형성; (3) GelMA 스캐폴드의 3D 프린팅; 그리고 (4) 구형 생물조립체(그림 1). 이 워크플로우 내에서 구형 균일성과 구도, 인쇄 충실도, 스캐폴드 형태 무결성 등 객관적인 품질 관리 지표가 설정되었습니다.

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프로토콜

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시약과 사용된 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 아가로스 마이크로몰드 준비 및 GelMA 3D 프린팅 비계 제작

  1. 0.9% 염화나트륨(NaCl) 용액에서 2% 아가로스 마이크로몰드의 생산 과정( 그림 2A 참조)
    참고: 모든 화학 폐기물은 기관의 화학 안전 규정과 유해 폐기물 지침에 따라 취급 및 처리되어야 합니다.
    1. 0.9% NaCl 용액을 초순수수에 준비한 후 121 °C에서 30분간 오토클레이브합니다. 사용 전에는 멸균 상태에서 유지하세요.
    2. 멸균 초순수 아가로스 1g을 0.9% NaCl 용액 50mL에 희석합니다. 아가로오스를 마이크로파에서 10초 간격으로 3–5사이클 동안 균질화하고 탈중합하여 완전히 용해합니다.
    3. 생물학적 안전 캐비닛 안에서 81개의 원형 홈이 있는 상업용 실리콘 몰드를 멸균 거즈 위에 올려놓습니다.
    4. 실리콘 몰드 중앙에 600 μL의 아가로스를 조심스럽게 침착시키고 40분간 휴지시켜 완전한 중합을 보장합니다.
    5. 완전히 중합된 아가로스 마이크로몰드를 조심스럽게 탈몰하여 12웰 마이크로타이터 플레이트의 웰로 옮깁니다.
    6. 아가로스 마이크로몰드의 위치를 조정하고 600 μL의 아가로스를 채워 우물 바닥에 고정합니다.
    7. 미세몰드를 15분간 Dulbecco's Modified Eagle Medium Low Glucose(DMEM, 2 mL/well)로 15분 동안 배양하여 미리 배양합니다. 이 과정을 두 번 반복한 후 세 번째 인큐베이션에서는 DMEM에 아스코르브산(50 μg/mL), 인간 혈청 알부민(1.25 μg/mL), 페니실린-스트렙토마이신(PS, 1×, 100× 스톡 용액에서), ITS 보충제(1×, 100× 스톡 용액으로 구성된 3차원(3D) 배양 배양지로 교체합니다.
      참고: 3D 배양 배지는 단일층 확장액과 달리 태아 소 혈청(FBS)이 없고, 세포 간 상호작용과 세포외 기질 지지를 촉진하는 정의된 보충제가 포함되어 있어 구체의 적절한 자기 조립과 안정화를 촉진합니다. 곰팡이 생산과 세포 도금이 다른 날에 이루어지는 경우, 두 번째 DMEM 배양 후 절차를 중단할 수 있으며, 몰드는 37°C의 가습 인큐베이터에서 최대 5일간 멸균 상태로 보관해야 합니다. 3D 배양 배양지를 이용한 세 번째 배양은 반드시 플레이트 당일에만 수행되어야 합니다. 세포를 씨앗하기 전에 우물과 마이크로몰드 모두에서 배지를 완전히 제거하세요.
  2. 젤라틴 메타크릴로일(GelMA) 하이드로겔 제조
    참고: 시약이 광감성이므로 전체 시술은 어두운 곳에서 진행해야 합니다. 본 연구에서는 GelMA(젤 강도 300g Bloom, 치환 60%)와 광시작제 리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트(LAP)를 사용하였습니다. 0.5% w/v LAP를 포함한 10% w/v GelMA 용액 10mL를 준비하려면:
    1. 50mg의 LAP 분말을 1mL의 DMEM에 녹인 후, 피펫으로 부드럽게 섞어 투명하고 균질한 용액이 나올 때까지 사용합니다.
    2. LAP 용액을 9mL DMEM이 든 원심분리관에 옮겨 완전히 혼합합니다.
    3. 생물학적 안전 캐비닛에서 0.22 μm 필터를 통해 여과하여 결과 용액을 멸균합니다.
    4. 용액에 GelMA 1g을 첨가하고 약 3시간 동안 자기 교반을 사용해 균질화하여 투명하고 균질한 용액이 얻을 때까지 합니다. 플라스크를 빛에 대어 용액에 눈에 보이는 입자와 탁도가 없는지 확인하세요.
    5. 생성된 하이드로겔은 10mL 주사기에 넣어 다음 인쇄를 하거나, 즉시 사용하지 않을 경우 빛으로부터 보호한 채 2–8 °C에서 보관하여 사용한다.
      참고: GelMA와 LAP 용액은 준비 후 약 24시간 후에 사용되었습니다. 이 용액의 장기간 보관은 권장되지 않습니다. GelMA와 LAP 분말 모두 제조사 지침에 따라 2–8 °C에서 보관해야 합니다. LAP 광시작기는 ABNT NBR 14725 및 규정(EC) nº 1272/2008과 같은 기준에 따라 비위험 등급으로 분류됩니다. 하지만 제조사는 호흡기, 피부, 눈 자극을 방지하기 위해 개인 보호 장비 착용을 권장합니다. NIOSH(미국 국립산업안전보건연구소) 또는 EN 166(EU)와 같은 관련 정부 기준에 따라 시험 및 승인된 안전안경과 최소 두께 0.11mm의 니트릴 고무장갑 착용이 권장됩니다. 호흡기 보호는 먼지가 발생할 때만 필요합니다. 제조업체의 필터 이용한 호흡기 보호 권고는 DIN EN 143, DIN EN 14387 및 사용되는 특정 호흡 보호 시스템과 관련된 기타 보완 표준을 기반으로 합니다. 제조사는 P1 타입 필터 사용을 권장합니다.
  3. 3D 모델 설계, 슬라이싱 및 G-코드 파일 생성
    참고: 3D 비계 모델은 온라인 3D 컴퓨터 지원 설계(CAD) 소프트웨어인 Tinkercad를 사용하여 설계되었습니다. 이 프로토콜을 위해 직경 15mm, 하단 두께 1mm, 직경 5.50mm, 깊이 2mm의 원형 기공 두 개를 가진 원통형 비계가 생성되었습니다.
    1. 3D 모델 설계가 완료되면 *.stl 파일(보조 파일 1)로 내보내세요.
    2. Repetier-Host V2.3.2 소프트웨어를 열면 설계된 모델을 슬라이스하는 데 사용될 것입니다.
    3. "슬라이서" 탭에서 원하는 슬라이서 옵션을 선택하세요. 이 연구에서는 CuraEngine 이 사용되었습니다.
    4. 적절한 매개변수 프로필을 설정하세요. 이 작업에서 속도는 10 mm/s; 층 높이 0.2 mm; 채움 패턴: 그리드; 노즐 직경 0.41mm가 사용되었습니다.
    5. 출력할 3D 모델의 *.stl 파일을 불러오세요.
    6. "슬라이서" 탭에서 이전에 생성된 구성을 선택하세요.
    7. "CuraEngine으로 슬라이스"를 클릭하세요. 슬라이싱된 3D 모델은 소프트웨어 인터페이스에서 시각화됩니다.
    8. "파일에 저장"을 클릭하여 원하는 위치에 G코드 파일을 저장하세요.
  4. 구형 생체조립용 젤라틴 메타크릴로일(GelMA) 하이드로겔 스캐폴드의 3D 프린팅
    참고: 3D 프린팅은 멸균 환경에서 수행되어야 합니다. 따라서 인쇄 과정을 시작하기 전에 프린터를 보관하는 생물학적 안전 캐비닛이 켜져 있고 공기 흐름이 정상적으로 작동하는지 확인하세요. 캐비닛 보호 유리의 높이가 장비 센서 표시와 같은 높이인지 확인하세요.
    1. 바이오프린터의 안전 잠금장치를 제거하세요.
    2. 금속 클립을 풀어 인쇄 베드에서 유리판을 분리하세요.
    3. 금속 클립을 사용해 배양판을 인쇄 플랫폼에 고정할 수 있도록 적절한 모양의 아크릴 가이드를 부착하세요.
    4. 프린터를 전원 공급원에 연결하세요. 이 장비는 듀얼 전압(110/220 V)을 지원합니다.
    5. 프린터 USB 케이블을 컴퓨터에 연결하세요.
    6. 프린터를 켜려면 켜기/끄 기 버튼을 누르세요.
    7. Repetier-Host V2.3.2 소프트웨어를 열어 3D 모델을 확인하고 출력할 예정입니다.
    8. 소프트웨어 인터페이스에서 "연결" 옵션을 클릭하세요.
    9. 소프트웨어 수동 제어를 사용해 익스트루더(1 또는 2)를 선택하고 프린트 헤드를 홈 위치(X = 0, Y = 0, Z = 0)로 보냅니다.
    10. Repetier의 수동 제어에 적합한 도구를 사용해 선택한 익스트루더를 적절한 주사기 장착에 맞게 조정하세요.
    11. 주사기를 이미 하이드로겔이 채워진 압출기에 조심스럽게 삽입하고 압출 노즐에 연결하세요(이번 연구에서는 내경 0.41mm의 원뿔형 폴리프로필렌 노즐을 사용했습니다).
    12. 배양판을 인쇄 베드에 부착된 아크릴 가이드에 맞춰 넣으세요.
    13. 바이오프린터 왼쪽에 위치한 Z 엔드스톱 나사를 사용해 Z 홈 위치(Z = 0)를 조정합니다. 즉, 압출 노즐과 인쇄 표면 사이의 원하는 거리를 설정하세요. 이상적으로는 노즐이 이 연구에서 배양판인 기판에 가볍게 닿아야 합니다.
    14. 프린트헤드를 홈 위치로 되돌려 놓으세요.
    15. 이전에 생성된 G-코드 파일을 불러오세요.
    16. 소프트웨어의 적절한 수동 제어 도구를 사용해 주사기에서 일부 하이드로겔을 배출하여 노즐을 통한 물질 흐름을 보장하세요.
    17. 인쇄 과정을 시작하세요.
    18. 출력 후, 395-400 nm 해상도의 두 개의 LED가 장착된 3D 바이오프린터의 UV 조명 시스템을 사용하여 결과 스캐폴드의 광가교를 수행합니다. 비계를 5분간 자외선에 노출시키세요(빛 세기는 20 mW/cm 2).
    19. 마이크로몰드 제작에 사용된 동일한 탈중합 2% 아가로스 용액을 사용해 3D 프린팅 스캐폴드를 12웰 배양판의 웰에 부착합니다. 비계를 우물 바닥에 고정하는 것은 안정성을 높이고 구형 파종 및 배양 기간 동안 이동을 방지하기 위해 필요합니다.
      참고: 4.16단계를 수행할 때는 압출 과정에서 하이드로겔이 연속적인 필라멘트를 형성하는지 확인하세요. 일반적으로 젤라틴 용액은 액체 상태(약 37 °C)일 때 주사기에 주입됩니다. 실온(22–25 °C)에서 몇 분 만에 이 생체 재료는 젤 같은 형태로 전환되기 시작합니다. 압출 중에 재료가 떨어져서는 안 되며, 이는 인쇄 품질에 부정적인 영향을 줄 수 있습니다. 압출 중 필라멘트가 연속적으로 형성된다면 하이드로겔이 인쇄에 최적의 농도에 도달했음을 나타냅니다. DMEM에 희석된 GelMA와 LAP 용액은 약간 주황빛을 띠는 색을 띱니다. 자외선에 의한 광가교 이후에는 색상 변화가 흔히 관찰되며, 이는 물질이 희끄거나 반투명해지는 것으로 보이며, 이는 그림 3D, E에 나타난다. UV 시스템을 작동시킬 때는 자외선으로부터 충분한 눈 보호를 위해 안전 안경 착용이 필수입니다.
  5. 인쇄 충실도 분석
    참고: GelMA 비계의 3D 프린팅 정확도 분석에서는 비계 직경, 기공 직경, 비계 두께 등 다음 매개변수를 고려합니다. 측정에는 ImageJ 버전 1.54 소프트웨어를 사용했습니다.
    1. 먼저, 입체현미경으로 관찰한 비계 이미지를 촬영하세요. 기준으로 자나 캘리퍼를 사용하세요.
    2. 이미지를 분석하기 전에 ImageJ에서 보정하고 스케일을 설정하여 측정을 수행하세요.
    3. 직선 도구를 사용해 측정을 수행하세요.
    4. 비계와 기공 형태 모두 원형이므로, 통계 분석에는 비계와 기공 직경의 산술 평균을 사용한다.
    5. 인쇄 충실도 분석의 경우, ImageJ가 인쇄된 스캐폴드에서 얻은 측정값과 Tinkercad가 생성한 3D 모델에서 정의된 값을 비교하세요.
      참고: 측정된 인쇄된 비계 두께는 Tinkercad에서 투영된 기공 깊이와 바닥 두께 값의 합과 비교됩니다.
    6. 얻은 데이터를 통계적으로 분석합니다. 이 경우 측정된 스캐폴드 값과 기대값을 비교하기 위해 Mann-Whitney U 검정(비모수 검정)을 사용할 수 있습니다. 샤피로-윌크 검정은 정상성을 평가하는 데 사용됩니다. 차이는 p < 0.05일 때 통계적으로 유의미하다고 간주됩니다.

2. hADSC 및 구형 형성의 준비

참고: 시중에 구할 수 있는 인간 지방유래 중간엽 줄기세포(hADSC)를 세포 특이적 배양지에서 배양하고 제조사 권고에 따라 80%–90% 합류율로 배선하였습니다. 이 프로토콜에서는 7번째 통과시까지 세포를 사용했습니다. 모든 생물학적 폐기물은 폐기 전에 적절히 오염 제거 또는 멸균되어야 하며, 기관의 생물안전 지침에 따라 처리되어야 합니다. 이후 공초점 시각화를 위해 단층체는 구형 형성 전에 형광 염료로 표지하고 제조사 권장에 따라 배양해야 합니다. 구형 형성은 표지 부착 후 30분 후에 시작될 수 있습니다.

  1. ASC 단층의 트립신화
    1. 생물학적 안전 캐비닛에서 배양 플라스크를 열고 내용물을 폐기물로 옮기세요.
    2. 단층을 1× 인산염 완충 식염수(PBS)로 두 번 세척한 후 용액을 버립니다.
    3. 단일층을 덮을 수 있을 만큼 0.125% 트립신/EDTA 용액을 추가하세요. 플라스크를 닫고 37°C의 가습 인큐베이터에서 최대 5분간 배양하세요.
    4. 트립신/EDTA를 같은 양의 DMEM에 10% 태아 소 혈청(FBS)을 보충하여 비활성화합니다.
    5. 혈청학적 피펫을 사용해 세포 현탁액을 수집하거나 원심분리관으로 옮기세요. 400 x g 원심분리기에서 실온(20–25 °C)에서 5분간 돌립니다.
    6. 상액을 조심스럽게 버리세요.
    7. 세포 펠릿을 DMEM에 재현탁하고 균질화합니다. 세포 수와 생존 가능성 평가를 위한 분할 검사를 받으세요.
  2. 구형 문화( 그림 2B 참조)
    1. 각 몰드에 맞는 적절한 수의 세포를 15mL 원심분리관에 분리합니다. hADSC의 경우, 81개의 홈을 가진 각 아가로스 몰드에는 ×10개의6 셀이 포함되어야 하며, 각 마이크로웰마다 1개의 구형 형태가 이루어져 1개의 구형 형태를 생성하여 마이크로몰드당 81개의 구체를 생성합니다.
    2. PBS 1×을 넣고 500 x g 에서 실온에서 5분간 원심분리합니다. 상원액을 버리고 PBS 1×을 추가하세요. 이 단계를 두 번 반복하세요.
    3. 세 번째 원심분리 후에는 상청액을 조심스럽게 버리고 멸균 거즈로 튜브 입구를 건조한 후 다시 수직으로 되돌립니다.
    4. 세포 펠릿을 120 μL 3D 배양 배지에 재현탁하여 구형 배양 및 균원화합니다. 필요 시 추가 3D 배양지를 사용하여 현탁 부피를 200 μL로 조절하세요.
      참고: 81회 절제된 각 몰드는 200 μL의 용량을 가집니다.
    5. 200 μL를 흡입하여 몰드 중앙에 조심스럽게 도금하여 기포 형성을 방지하세요.
      참고: 이 단계는 앞서 설명한22와 같이 로봇 피펫팅 시스템을 통해 자동화할 수 있습니다.
    6. 세포가 절제 부위에 자리 잡을 때까지 5분간 생체 안전 캐비닛에 플레이트를 두세요.
    7. 접시를 가습 인큐베이터에 40분간 넣으세요.
    8. 이 기간 후, 각 웰에 3D 배지 2mL를 조심스럽게 추가하세요. 플레이트를 37°C의 가습 인큐베이터로 다시 넣으세요.
  3. 구형 측정 및 통계 분석
    1. 디지털 카메라와 10× 대물렌즈가 장착된 역광학 현미경을 사용해 아가로스 마이크로몰드의 두 대각선을 따라 "X" 패턴을 형성하는 구형 이미지를 촬영합니다. 직경을 측정하기 전에 100 μm 스케일 바를 사용해 이미지 스케일을 보정하세요.
    2. 구체의 장지름과 소지름을 결정하려면 소프트웨어의 '선' 도구를 사용해 각 촬영된 구면마다 대략 90° 각도로 수직으로 두 번 측정합니다.
    3. 각 구체의 평균 직경을 이전에 측정한 두 수직 직경의 산술 평균으로 계산합니다. 구면도를 각 구면의 가장 큰 지름과 가장 작은 직경의 비율로 계산하며, 값이 1에 가까울수록 더 균일하고 더 구형임을 나타냅니다.
    4. 얻은 직경과 구면 값을 사용하여 통계 분석을 수행합니다.

3. 구형 융합 및 생체 조립을 위한 GelMA 스캐폴드 시딩

  1. 구형 형성 후 24시간 동안 구형 팁이 넓은 피펫을 사용해 아가로스 마이크로몰드에서 수집하여 2mL 마이크로튜브로 옮깁니다.
  2. 구체가 마이크로튜브 바닥에 가라앉으면 상청액을 버리세요.
  3. 구체를 3D 매체 50 μL에 재현탁합니다.
  4. 넓은 구경 팁을 가진 피펫을 사용해 구형을 모아 GelMA 비계 구멍에 부드럽게 박습니다.
    참고: 직경 약 5.50mm, 깊이 2mm의 GelMA 지지공에서, 약 480개에서 640개의 구형체(6–8개의 아가로스 마이크로몰드에 해당하며, 각각 직경 200에서 400 μm 사이의 구형 81개를 생성함)를 50 μL에 씨앗합니다. 이 추정치는 기공 부피와 평균 구형 직경을 기반으로 했으며, 개별 구형 수가 아닌 완전한 마이크로몰드 수로 정량화하여 기공 내 구형 밀도를 실용적이고 재현 가능하게 추정했습니다.
  5. 구체를 GelMA 지지 구멍에 침착시킨 후, 구체가 가라앉을 때까지 20–40분을 기다립니다. 각 웰에 3D 배지 1mL를 추가하세요.
  6. 24시간 후에는 각 웰에 3D 배지 1mL를 추가합니다.
  7. GelMA 스캐폴드 내 구형 융합을 위상 차이 현미경과 입체 현미경으로 모니터링합니다. 시딩 직후 0일차부터 3일차(72시간)까지 24시간마다 이미지를 획득하세요.
  8. 72시간 후 4% 파라포름알데히드에 생물학적 구성을 고정하여 공초점 현미경으로 시각화합니다. 파라포름알데히드는 독성 및 자극성 특성 때문에 인증된 화학 연기 후드에서 적절한 개인 보호 장비(실험복, 장갑, 안구 보호구)를 사용하여 취급하며, 폐기물은 기관 화학 안전 지침에 따라 처리해야 합니다. 공초점 관찰을 위해서는 구형 형성 전에 단층 내에 형광 염료로 미리 표지되어야 합니다.
    참고: GelMA 구멍에서 구조물을 제거해야 하거나 생체 내 적용이 필요한 경우, 정밀 핀셋이나 적절한 크기의 생검 펀치를 사용해 조심스럽게 회수하십시오.

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결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

인간 지방유래 줄기세포(hASCs)를 단층 배양(그림 2C)으로 배양한 후, 아가로스 마이크로몰드에 씨앗 후 24시간 이내에 구형 형성을 성공적으로 유도하였다(그림 2D). 결과적으로 생성된 구형들은 조밀하고 명확한 형태를 보였습니다. 형태계측 분석 결과 24시간에서 평균 직경 239.8 μm ± 87.0 μm(그림 2E)와 구형 값이 거의 1(0.947 ± 0.123)에 가깝다는 것이 밝혀졌으며(그림 2F), 이는 균일하고 대칭적인 구형체임을 나타낸다.

3D 프린팅 비계의 CAD 모델은 비계 전체 직경의 약 3분의 1을 차지하는 두 개의 기공으로 설계되었습니다(그림 3A, B)...

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토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

본 연구에서 나온 결과는 품질 관리 지표를 표준화된 바이오패브리케이션 워크플로우에 성공적으로 통합하여 재현성을 보장했음을 강조합니다. 사전 확립된 설계를 기반으로 한 3D 프린팅 비계의 사용은 구형 생물조립에 구조적 지지를 제공합니다19,23. 개념 증명으로, 고밀도 구형 하중과 유도 생체 조립을 지원할 수 있도록 치수가 조정된 두 개의 중앙 다공성 영역을 가진 견고한 비계가 설계되었다.

첫 품질 관리 검사점으로서, 구형 측정값은 3D 프린팅된 GelMA 기반 스캐폴드에 시딩하기 전에 평가되었습니다. 아가로스 마이크로몰딩 하이드로겔을 사용해 24시간 후 균일한 구상체가 생성되었다(그림 2D). 형태계측학적 분석 결과, 지름이 일관되고 구면도 값이 높음이 나타났습니...

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자들은 이해 충돌이 없다고 보고합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BioRender.com (https://BioRender.com/x1lxn0y) 도표 속 삽화를 참고하세요.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1x Phosphate-Buffered Saline (PBS)Prepared in the laboratory-
593iCAN 3D Bioprinter, Model 593 iCan2X Printhead593iCAN--
AgaroseSigma-Aldrich16500-500-
Ascorbic Acid Sigma-Aldrich A4544-100MG-
Carl Zeiss Microscopy GmbH Primovert Zeiss-415510-1101-000
Celldiscover Zeiss-LSM 900 with Airyscan 2
CelltrackerInvitrogen C7025-
CentrifugeEppendorf -5702
Class II Biological Safety CabinetStreamline-Model SC2-4E3
CO2 incubator for cell cultureThermo Fisher Scientific-Series 8000 WJ 
Conical polypropylene nozzle 0.41 mm593iCAN--
Dulbecco’s Modified Eagle Medium Low Glucose Sigma-Aldrich D2902-10L-
EDTASigma-Aldrich E9884-
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco 12657-029-
Gelatin methacryloyl gel strength 300 g Bloom, degree of substitution 60%Sigma-Aldrich900622Lot/Batch number: MKCS2673. Documentation for each batch, including the Safety Data Sheet (SDS) and the Certificate of Analysis (CoA), can be obtained from the manufacturer’s website.
GraphPad Prism 6.0 softwareGraphPad Inc--
Hot plate magnetic stirrerIKAZ671797Model C-MAG HS7
Human serum albumin 100 mg/mlFUJIFILM Irvine Scientific9988-
ITS (Insulin-transferrin-sodium selenite) supplement 100x Sigma-AldrichI3146-5ML-
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)Sigma-Aldrich900889
Luxoeo 4Z Stereozoom Microscope Labomed--
MicroTissues® 3D Petri Dish® micro-mold spheroidsSigma-AldrichZ764019-
Penicillin-streptomycin 100xSigma-Aldrich15140122-
Poietics™ human adipose derived stem cells (ADSC)Lonza PT-5006
Sodium Chloride (NaCl)Sigma-Aldrich71382-500G-
Trypsin/EDTAGibco 27250018-

참고문헌

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