마우스 각막에서 단일 세포 현탁액을 채취하는 프로토콜

요약

여기서는 콜라겐제 A와 트립신을 이용한 순차적 소화를 통해 전체 마우스 각막에서 고품질 단세포 현탁액을 얻는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 높은 RNA 무결성을 가진 생존 가능한 단일 세포를 생성하여 단일 세포 RNA 시퀀싱 및 유세포기체 y와 같은 후속 응용과 호환됩니다.

초록

안구의 가장 바깥층인 각막은 안구 표면의 항상성과 시력을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다. 최근 단세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq)의 발전으로 각막 세포 이질성의 고해상도 분석이 가능해졌지만, 각막 조직에서 고품질 단세포 현탁액을 제조하는 것은 여전히 조밀하고 복잡한 구조 때문에 여전히 도전적입니다. 본 연구에서는 전체 마우스 각막에서 단일 세포 현탁액을 생성하는 견고한 프로토콜을 확립합니다. 이 시술은 각막을 미세한 조각으로 잘게 만든 후 콜라겐제 A와 트립신을 이용한 순차적인 효소 소화를 진행합니다. 결과 세포 현탁액은 여러 지표를 통해 품질을 평가했습니다: 트리판 블루 염색을 사용해 세포 생존성과 개체수를 평가했고; 판사이토케라틴과 케라토칸에 대한 면역형광 염색은 주요 각막 세포 유형의 식별 및 정량을 가능하게 했으며; RNA 무결성은 바이오분석기를 사용해 검증되었습니다. 이 프로토콜은 높은 세포 수, 우수한 생존율(≥ 94.6%), 단일 세포 비율(96.3%)을 가진 단일 세포 제제를 지속적으로 생산하며, scRNA-seq를 포함한 까다로운 하위 응용 요구사항을 충족합니다.

서론

안구의 가장 바깥층에 위치한 각막은 다섯 개의 뚜렷한 층(상피, 보우만 층, 기질, 데스케메 막, 내피¹)으로 구성된 매우 조직적인 구조 덕분에 장벽과 굴절 기능에 필수적입니다. 각막 상피는 각막화되지 않은 층화된 편평 구조로, 외부 병원체에 대한 물리적 장벽을 제공하며 강력한 항균 및 재생 능력을 보입니다. 기질은 정확히 정렬된 콜라겐 섬유로 구성되어 각막의 투명성과 균일한 굴절률²를 유지합니다. 내피는 단세포층으로, 기질과 방양성 간의 체액 이동을 조절하여 각막의 수분과 영양 공급을 유지합니다^. 그럼에도 불구하고, 이러한 복잡한 구조적·세포적 복잡성은 각막의 생물학적 기능과 그 기저 메커니즘을 연구하는 데 역사적으로 상당한 도전을 제기해 왔습니다^.

세포 간 상호작용을 연구하고 세포 유형별 특이적 표지를 규명하기 위해 유세포 분류⁵ 와 단일 세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq)⁶ 과 같은 기법이 널리 사용되고 있습니다. 그러나 두 접근법 모두에서 공통적으로 겪는 주요 기술적 장애물은 고품질 단일 셀 현탁액의 준비입니다. 총 세포 수율, 단일 세포 비율, 세포 생존성 등의 매개변수는 각막 세포 기능과 표면 표지 발현을 특성화하는 후속 응용 프로그램의 신뢰성에 매우^{중요합니다.} 중요함에도 불구하고, 전체 마우스 각막에서 단일 세포 현탁액을 생성하는 표준화되고 효율적인 프로토콜은 여전히 부족합니다.

각막 조직에서 단일 세포 현탁액을 얻기 위한 여러 방법이 확립되었습니다. 콜라겐제 A, 트립신 또는 TrypLE를 이용한 순차적 효소 소화가 인간과 쥐 각막에서 단일 세포를 분리하는 데 사용되었습니다⁸. 반복적인 트립신화는 각막 해리에도 활용되어 왔습니다. 또한, Miltenyi Biotec과 같은 상업용 다조직 해리 키트가 각막 단세포 현탁액을 생성하는 데 성공적으로 적용된 바^{있습니다.} 이전 각막 소화 방법에 대한 비교 연구에서 콜라겐아제와 트립신을 순차적으로 사용하는 치료가 최적의 접근법임을 입증했습니다. 이 방법은 꾸준히 높은 세포 수, 우수한 생존성(≥94.6%), 높은 단일 세포 비율(96.3%), 그리고 잘 보존된 RNA 무결성을 제공합니다¹⁰.

이 프로토콜에서는 검증된 경험과 이전 결과를 바탕으로 최적화된 효소 소화 전략을 사용하여 전체 마우스 각막에서 고품질 단세포 현탁물을 생성하는 상세하고 단계별 절차를 제공합니다.

프로토콜

6-8주 된 암컷 C57BL/6 (B6) 마우스는 구이저우 의과대학 실험동물센터에서 공급하였습니다. 동물들은 12시간 빛/12시간 어둠 주기 하에 살았으며, 자유롭게 음식과 물을 사용할 수 있었습니다. 모든 절차는 구이저우 의과대학 실험동물윤리위원회(승인번호 2305185)의 승인을 받았으며, 안과 및 시각 연구에 동물 사용을 위한 ARVO 성명을 준수하였습니다.

1. 준비

1. 수술 기구 준비: 안과 가위 두 쌍, 검자 두 쌍, 조직 겸자 한 쌍, 2mL 원심분리관 한 쌍을 이중 증류수(DDW)로 두 번 헹구어 세척합니다. 증기 오토클레이브를 사용해 기구와 튜브를 멸균하세요. 모든 물건은 65°C의 일반 오븐에서 하룻밤 건조하세요.
2. 용액 준비
   1. 보조 호르몬 상피 배지(SHEM): DMEM/F12 배지에 다음 성분을 보충하여 SHEM을 준비합니다: 5% (v/v) 태아 소 혈청(FBS), 0.5% (v/v) 디메틸 설폭시드(DMSO), 10 ng/mL 마우스 표피 성장 인자, 5.5 μg/mL 트랜스페린, 0.5 μg/mL 하이드로코르티손, 1% (v/v) 페니실린-스트렙토마이신 (100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신).
      참고: SHEM은 처리 과정에서 세포 생존력을 유지하는 데 사용됩니다. 최소 10% (v/v) FBS를 포함한 기저 DMEM 또는 인산 완충 식염수(PBS)와 같은 대체 배지로 대체할 수 있습니다.
   2. 인산염 완충 식염수(PBS)
      1. 자기 교반기를 사용해 22.4g의 PBS 분말을 2L의 이중 증류수(DDW)에 녹여 1× PBS를 얻습니다.
      2. PBS 용액을 하루 전에 오토클레이브하고 식히세요.
      3. 멸균 상태에서 멸균 1× PBS 47.5 mL를 50 mL 원심분리관에 옮기고, 1% (v/v) 페니실린-스트렙토마이신 2.5 mL를 첨가합니다.
         참고: 1× PBS 제형(2L)은 137 mM NaCl, 8 mM Na₂HPO₄, 2 mM NaH₂PO₄, pH 7.2를 포함하고 있습니다.
   3. 콜라겐제 A 용액
      1. 스톡 용액: 콜라겐제 A 분말 1g을 DDW 40mL에 녹입니다. 0.2 μm 필터로 소독한 후 -20 °C에서 보관하세요.
      2. 작동 용액: 콜라겐제 1mL를 4mL의 멸균 DDW에 희석하여 최종 농도인 5 mg/mL를 얻습니다.
   4. 트립신 용액: 사용 전에 상업적으로 이용 가능한 0.25% (w/v) 트립신/EDTA 용액(0.91 mM EDTA 함유)을 얼음 위에 해동합니다.
   5. 트리판 블루 용액(0.4%): 100mL의 DDW에 0.4g의 트리판 블루를 녹입니다. 여과지를 사용해 4°C에서 보관하세요.
      참고: 0.4% 트리판 블루 용액은 총 세포 수, 단일 세포 비율 및 생존 가능성을 평가하는 데 사용됩니다. 상업용 생/죽음 염색 키트나 자동 세포 계수 시스템으로 대체할 수 있습니다.

2. 쥐 각막 준비

1. 해부 현미경과 작업 공간을 75% 에탄올로 닦아 멸균한 후, 생물학적 안전 캐비닛 안에서 30분간 자외선에 노출하세요.
2. 멸균 조건에서 다음 것을 준비하세요: SHEM 배지 5mL가 담긴 60mm 페트리 접시 1개, 5% 페니실린-스트렙토마이신(P-S)이 보충된 1× PBS 5mL가 들어있는 60mm 페트리 접시 3개, 5mL 1× PBS가 담긴 60mm 페트리 접시 3개, 그리고 멸균 2mL 원심분리관 1개
3. _CO-2 질식사로 쥐를 안락사시키고, 이어서 경추 탈구를 시행합니다.
4. 적출술을 진행하기 전에 5% P-S가 포함된 PBS에 쥐 머리와 감은 눈꺼풀을 세 번 담그고 깨끗이 씻어내세요.
5. 안과 가위를 사용해 각 안구 뒤쪽 극을 따라 절개를 하고, 분리된 눈을 얼음처럼 차가운 SHEM 매체가 담긴 페트리 접시에 조심스럽게 넣습니다(그림 1A).
   참고: 세포 생존 가능성을 극대화하기 위해 모든 용액은 4 °C까지 미리 냉각되어야 하며, 모든 해부 단계는 얼음 위에서 수행해야 합니다.
6. 즉시 페트리 접시를 눈알이 들어간 생물학적 안전 캐비닛으로 옮기세요. 안구를 5% P-S가 포함된 1× PBS에 세 번 세척하고, 한 번 세척당 5분간 배양하세요.
7. 해부 현미경 아래에서 각막 조직을 조심스럽게 분리합니다: 안과 가위와 겸자를 사용해 후방 극에서 각막 변두막 쪽으로 절개를 합니다. 변연 경계를 따라 각막을 공막과 결막에서 부드럽게 분리하세요. 수정체와 홍채를 두 쌍의 겸자를 사용해 완전히 제거하세요(그림 1B).
8. 안과 겸자를 사용해 각막 조직을 1× PBS가 들어 있는 페트리 접시에 옮기고, 각막 밖 조직과 항생제를 제거하기 위해 각막 조직 3회(각각 5분씩)를 세척합니다.
   참고: 홍채는 종종 각막에 단단히 붙어 있습니다. 오염을 막기 위해 겸자를 사용해 부드럽고 완전히 제거하여 투명한 각막 조직만 남기세요.
9. 안과 겸자를 사용해 세척된 각막 조직을 2mL 원심분리관에 옮기고 콜라겐제 A 작동 용액 1mL(5 mg/mL)를 첨가합니다.
10. 안과 가위를 사용해 각막 조직을 관 안에서 약 0.5mm × 0.5mm 조각으로 잘게 만듭니다.
11. 각막 조각과 콜라겐제 A 용액이 담긴 튜브를 세포 배양 인큐베이터에서 37°C에서 1시간 동안 배양합니다(그림 2A-C).
12. 콜라겐제 A 소화 과정 동안 10분마다 조직을 관찰하세요. 큰 조직 조각이 남아 있지 않으면 원심분리로 진행하여 소화를 종료합니다. 시료를 실온에서 300 x g 에서 원심분리기로 5분간 원심분리합니다. 상정액을 조심스럽게 흡취하세요.
13. 펠릿을 0.25% 트립신/EDTA 용액 200 μL에 재현탁합니다.
14. 튜브를 37°C의 세포 배양 인큐베이터에서 10분간 배양하여 남은 조직 조각을 소화합니다.

3. 각막 단세포 분리

1. 넓은 구경 팁을 가진 P1000 피펫을 사용해 조직과 트립신/EDTA 용액을 부드럽게 분쇄하여 조직을 단일 세포 현탁액으로 분리합니다.
2. 세포 현탁액을 300 x g 에서 5분간 원심분리한 후 상청액을 버립니다. 세포 펠릿을 0.04% 소 혈청 알부민(BSA)이 포함된 1mL의 PBS에 재현탁하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다.
   참고: 시퀀싱 또는 유세포분석용 세포의 경우, 혈청이 없는 PBS에 재현탁하세요. 배양할 세포는 0.04% BSA를 보충한 PBS 1배를 사용하세요.
3. 셀 현탁액을 미리 습윤한 40 μm 셀 체를 통해 새로운 50 mL 원심분리관에 걸러서 세포 덩어리와 이물질을 제거합니다.
   참고: 세포 손실을 최소화하기 위해 PBS로 미리 적셔야 합니다. 필요 시 여과된 셀을 다시 원심분리하여 원하는 부피에 재현탁하여 농축할 수 있습니다.

4. 셀 세기

1. 세포 현탁액 9 μL과 0.4% Trypan Blue 용액 1 μL을 부드럽게 섞습니다.
2. 지정된 적재 채널 을 통해 혼합물을 천천히 혈구계 챔버에 주입합니다. 4사분면 방법을 사용해 세포 수를 세어 총 세포 수, 생존 가능성, 단일 세포 비율을 결정합니다. 최소 두 번의 기술적 복제를 수행하세요.

결과

단일 세포 현탁액의 품질은 총 세포 수율, 단일 세포 비율, 세포 생존력을 기준으로 평가되었습니다. 현탁액은 트리판 블루로 염색되어 여러 영역에서 위상 대비 현미경으로 분석되었습니다(그림 3). 네 개의 쥐 눈(각막 8개)에서 총 1.05개의 ×⁵ 개의 세포가 얻어졌으며, 평균 세포 생존율은 94.6%이고 단일 세포 비율은 96.3%를 초과하였다. 이 결과는 준비된 세포 현탁액이 유세포 분석(flow cytometry) 분류나 단일 세포 RNA 시퀀싱과 같은 후속 응용에 적합함을 확인시켜 줍니다.

현탁액 내 상피, 기질, 내피세포의 비례 조성을 확인하기 위해 상피 표지자 판사이토케라틴(Pan-CK)과 기질 표지자 케라토칸⁸을 이용한 면역형광 염색이 수행되었습니다. Pan-CK 양성 세포는 상피세포로, 각막...

토론

단세포 RNA 시퀀싱의 도입은 안구 연구에서 유전체, 전사체, 후생유전학, 단백질체 기술의 활용을 크게 증가시켰습니다 9,10,11,12. 따라서 고품질 단일 세포 현탁액 제조는 개별 세포 간 신호 전달 변이를 감지하고 세포 이질성에 대한 더 깊은 통찰을 제공하여 기존의 대량 유전자 발현 프로파일링에서는 제공되지 않는 이점을 제공하기 때문에 점점 더 중요해졌습니다^13,14. 이전 연구들은 정제된 상피 및 내피 세포를 해리시키기 위해 트립신/EDTA에 의존하는 경우가 많았다^15,16

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
알렉사 플루어 594 당나귀 안티래빗	앱캠	ab150064
항케라틴	앱캠	AB230175
항판사이토케라틴	써모피셔 사이언티브	AE1/AE3, 알렉사 플루어TM 488
오토클레이브 살균기	안셴	LDZH-100KBS
소 혈청 알부민 V	솔라비오	A8020
셀 필터	네스트	258369	40 & mu; m
원심 기계	에펜도르프 AG	22331 함부르크
콜라게나제 A	로슈	10103578001
공초점 현미경	그리고 nbsp; 오버코헨	자이스 LSM 880
카운팅 플레이트	마리엔펠트	M407859
원심관	네스트	620611	2mL, 50mL
커버슬립	마리엔펠트	M407859
다피	솔라비오	C0065
해부 현미경	칼 자이스	VISU150
DMEM/F12  미디어	깁코	11320033
DMSO	솔라비오	D8371
태아들   Bovine  세럼	깁코	16140071
하이드로코르티손	솔라비오	IH0100
그	깁코	23337619
쥐 표피 성장 인자	인비트로젠	PMG8041
안과 외과 및 nbsp; 겸자	두모트	0208-5-PO
안과 외과 가위	FST	15021-15
오븐	아이사이트	DH6000 II
페니실린 & 스트렙토마이신	깁코	15070063	100mL
페트리 접시	네스트	705201	60mm
인산염 완충 식염수	솔라비오	P1010
온도 조절 인큐베이터	써모피셔 사이언티브	3111
트라이톤-X 100	솔라비오	T8200
트리판 블루	솔라비오	T8070
트립신/EDTA	깁코	R001100
초청정 테이블	유치	VS-840-2
4% 파라포름알데히드	솔라비오	P1110