Method Article

단일 항체 표지를 이용한 막 단백질의 단분자 위치 현미경

DOI:

10.3791/69853

⸱

March 20th, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of Illinois Chicago, 2University of Illinois Cancer Center, 3Department of Biomedical Engineering, University of Illinois Chicago, 4Department of Biochemistry and Molecular Genetics, College of Medicine, University of Illinois Chicago

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 원형질막 단백질의 나노스케일 공간 조직을 해명하기 위한 단일 항체 표지(SAL)를 설명합니다. 단일 분자 수준에서 누적된 항체-에피토프 상호작용을 활용하여 막 SAL(mSAL)은 국소 에피토프 분포를 지도화하는 동시에 천연 세포 환경에서 항체 결합 행동을 포착합니다.

Abstract

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형질막은 세포 형태를 정의하며 세포 간 통신을 조절하는 인터페이스 역할을 합니다. 막 단백질은 주요 치료 표적 범주를 이루며; 따라서 구성 단백질을 통해 세포막을 초분해하는 것은 세포 생물학과 항체 치료제의 발전에 큰 가능성을 지니고 있습니다. 이와 관련해 단일 분자 위치 현미경(SMLM)은 생물학적 구조 위의 단백질 조직을 나노 규모로 시각화할 수 있게 합니다. SMLM을 원질막 단백질에 적용하는 것은 중요함에도 불구하고 독특한 도전 과제를 안겨줍니다. 이 프로토콜에서는 시경 단일 항체 표지(SAL)를 이용한 효과적인 접근법인 막 SAL(mSAL)을 제시합니다. 항체 농도, 레이저 출력 밀도, 비조명 간격 지속 시간, 영상 재구성, 밀도 기반 클러스터 분석 등 나노스케일 막 단백질 분포와 막 형태를 해결하기 위한 상세한 단계별 지침을 제공합니다. 우리는 모델막 단백질로 테트라스패닌 단백질 CD81을 사용하여 mSAL이 부착 및 현탁 세포 모두에 미치는 능력을 입증합니다. 세포막과 막 단백질의 분포를 초로 분해하는 것 외에도, 이 기술은 천연 막 환경에서 막 표적과 상호작용하는 치료용 항체의 약리역학을 조사할 수 있게 합니다.

Introduction

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형질막에는 세포 이동성, 부착, 감지, 세포 간 통신을 조절하는 다양한 단백질이 포함되어 있습니다. 단백질 기능이 발현 수준뿐만 아니라 막 내 공간적 조직에 의해 결정되는 경우가 많기 때문에 원형질막 단백질의 나노스케일 분포를 이해하는 것은 중요합니다. 특히, 많은 치료용 항체가 막 단백질을 표적으로 삼아 나노스케일 연구가 항체 상호작용이 국소 막 단백질 조직에 의해 어떻게 영향을 받는지 이해하는 데 필수적입니다. 그러나 막 단백질 분포의 정밀한 지도화, 단일 분자 개체 프로필 분석, 결합 파트너와의 동적 상호작용 모니터링은 여전히 도전적입니다.

직접 확률적 광학 재구성 현미경(dSTORM)5,6과 나노스케일 지형에서 이미징을 위한 DNA 기반 점 축적(DNA-PAINT)7과 같은 널리 사용되는 단일 분자 위치 현미경(SMLM) 기법은 샘플 표지에 면역형광....

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Protocol

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이 프로토콜은 확립된 Jurkat E6.1 및 U2OS 세포주를 사용하며, 주요 인간 또는 살아있는 동물 재료를 사용하지 않습니다.

1. 세포 시딩/착지 및 고정

참고: 샘플 준비는 표준 면역형광(IF) 염색 프로토콜을 따르며, 다양한 세포 유형에 걸쳐 원형질막 단백질의 세포 내 조직을 보존하도록 최적화되어 있습니다. 관심 대상에 대해 확립된 면역염색 프로토콜이 존재한다면, 사용자는 샘플 차단 단계 1.2.14까지 그 프로토콜을 따를 수 있습니다. 단일 항체 표지(SAL)는 형광 표지된 항체가 단일 분자 수준에서 항원에 결합하면서 누적적으로 검출되는 데 의존합니다. 형광 표지된 항체를 영상 버퍼에서 희석한 상태로 현미경 단계에서 샘플에 첨가하며, 영상 획득이 진행됨에 따라 형광 표지가 동적으로 이루어집니다. 샘플 준비 단계에서는 형광 표지가 이루어지지 않습니다.

  1. 이전에 발표된 프로토콜에 설명된 대로 U2OS 세포주와 같은 부착 세포를 준비합니다24.
  2. 셀 서스펜션
    1. 주르캇 T 세포를 10 mL의 완전한 RPMI 배지(RPMI 1640에 1....

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Results

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이 프로토콜에서 설명된 mSAL 기법은 단일 항체가 해당 원형질막 단백질 표적에 결합하는 현상을 시각화하여 막 단백질 분포의 초해상도 지도를 생성할 수 있게 합니다. CD81이 대표적인 예로 사용되지만, 이 접근법은 다른 막 단백질에도 쉽게 적용할 수 있습니다.

Jurkat T 세포를 세포 간 충분한 간격으로 고정시키면, 항체와 유리 표면에 의해 막 에피토프가 접근하여 fiducial이 침전할 수 있도록 합니다(그림 1A). 또한, 피펫팅 기술은 섬세한 막 구조의 보존에도 직접적인 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 용액 교환 단계에서는 피펫을 부드럽게 사용하는 것이 권장됩니다. 샘플 챔버를 각도를 잡고 용액을 웰 모서리에 피펫 넣으면 용액 흐름이 세포를 밀어내고 섬세한 막 구조를 파괴하는 것을 방지할 수 있습니다(그림 1B

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Discussion

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원형질막 단백질의 조직은 세포 기능 조절에 중요한 역할을 합니다. 기존의 형광 현미경 기술은 빛의 회절 한계에 의해 제한되어 나노 규모 조직이 가려집니다. SMLM은 10-20 nm47의 공간 해상도를 달성함으로써 이 한계를 극복하여, 나노스케일 조립체10, 48, 49의 특성화를 가능하게 합니다. SMLM 내 클러스터링 아티팩트는 동일한 플루로포어50을 반복 검출하여 단백질 클러스터의 모습을 유발할 수 있습니다. 단일 분자 검출은 형광체의 광전환 특성에 의존하므로 국소 에피토프 농도인 51,52,53,54,55를 완전히 나타내지 못합니다.

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Disclosures

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모든 저자는 공개할 이해 상충이 없음을 선언합니다.

Acknowledgements

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이 출판물에 보고된 연구는 국립보건원(NIH) 산하 국립일반의학과학연구소(National Institute of General Medical Sciences)의 수여 번호 R35GM146786과 일리노이 대학교 시카고 교양대학의 지원을 받았습니다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며, 반드시 국립보건원(NIH)의 공식 입장을 대표하지는 않습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
항-CD81 알렉사 플루오르 488 항체써모피셔 사이언티브MA5-44132영상 항체
벤치탑 원심분리기에펜도르프5424
소 혈청 알부민밀리포어 시그마A7906-100G
챔버드 커버 유리, 8웰셀비스C8-1-N
DMEM 미디어써모피셔 사이언티브11960069
둘벡코의 인산염 완축 식염수써모피셔 사이언티브14190-144
태아 소 혈청밀리포어 시그마F0926-500ML
글루타알데히드, 10%전자현미경 과학16120
금 콜로이드, 100nm테드 펠라15711년과 이하; 20피듀셜 마커
침수 오일 & nbsp;카길 연구소16245
역현미경   TIRF 모듈 장착니콘 인스트루먼트이클립스 Ti2-E현미경
Jurkat E6.1 세포주밀리포어 시그마88042803-1VL서스펜션 셀
레이저 런치, 6라인옥시우스L6CC-CS8-1511여기 레이저
리포펙타민 2000써모피셔 사이언티브11668019트랜스펙션 시약
마이크로 원심분리관, 1.5 mL  VWR89000-028
현미경 영상 소프트웨어니콘 인스트루먼트NIS-엘리먼트 고급 연구이미지 수집 소프트웨어
목표 기준, 100x/1.49 CFI APO TIRF 니콘 인스트루먼트MRD01991현미경 대물렌즈
파라포름알데히드, 16%전자현미경 과학15710
페니실린-스트렙토마이신써모피셔 사이언티브15140-122항생제
폴리-L-라이신 용액, 0.01% & nbsp;밀리포어 시그마P4707-50ML
Prime 95B sCMOS 카메라텔레다인 비전 솔루션01-프라임-95B-R-M-16-C카메라
RPMI 1640 미디어써모피셔 사이언티브11875-093현탁 셀용 매체
아자이드나트륨써모피셔 사이언티브19038-1000
붕소나트륨밀리포어 시그마213462-25G
T25 배양 플라스크써모피셔 사이언티브169900
테트라스펙 마이크로스피어피듀셜 마커
조직 배양 접시, 100 mm 코닝353003
U2OS 세포주ATCCHTB-96부착 세포

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zulueta Diaz, Y., de las, M., Arnspang, E. C. Super-resolution microscopy to study membrane nanodomains and transport mechanisms in the plasma membrane. Front Mol Biosci. 11, 1455153(2024).
  2. Levental, I., Lyman, E. Regulatio....

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