이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

단일 항체 표지를 이용한 막 단백질의 단분자 위치 현미경

1.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/69853

⸱

2026년 3월 20일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of Illinois Chicago, 2University of Illinois Cancer Center, 3Department of Biomedical Engineering, University of Illinois Chicago, 4Department of Biochemistry and Molecular Genetics, College of Medicine, University of Illinois Chicago

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 원형질막 단백질의 나노스케일 공간 조직을 해명하기 위한 단일 항체 표지(SAL)를 설명합니다. 단일 분자 수준에서 누적된 항체-에피토프 상호작용을 활용하여 막 SAL(mSAL)은 국소 에피토프 분포를 지도화하는 동시에 천연 세포 환경에서 항체 결합 행동을 포착합니다.

초록

형질막은 세포 형태를 정의하며 세포 간 통신을 조절하는 인터페이스 역할을 합니다. 막 단백질은 주요 치료 표적 범주를 이루며; 따라서 구성 단백질을 통해 세포막을 초분해하는 것은 세포 생물학과 항체 치료제의 발전에 큰 가능성을 지니고 있습니다. 이와 관련해 단일 분자 위치 현미경(SMLM)은 생물학적 구조 위의 단백질 조직을 나노 규모로 시각화할 수 있게 합니다. SMLM을 원질막 단백질에 적용하는 것은 중요함에도 불구하고 독특한 도전 과제를 안겨줍니다. 이 프로토콜에서는 시경 단일 항체 표지(SAL)를 이용한 효과적인 접근법인 막 SAL(mSAL)을 제시합니다. 항체 농도, 레이저 출력 밀도, 비조명 간격 지속 시간, 영상 재구성, 밀도 기반 클러스터 분석 등 나노스케일 막 단백질 분포와 막 형태를 해결하기 위한 상세한 단계별 지침을 제공합니다. 우리는 모델막 단백질로 테트라스패닌 단백질 CD81을 사용하여 mSAL이 부착 및 현탁 세포 모두에 미치는 능력을 입증합니다. 세포막과 막 단백질의 분포를 초로 분해하는 것 외에도, 이 기술은 천연 막 환경에서 막 표적과 상호작용하는 치료용 항체의 약리역학을 조사할 수 있게 합니다.

서론

형질막에는 세포 이동성, 부착, 감지, 세포 간 통신을 조절하는 다양한 단백질이 포함되어 있습니다. 단백질 기능이 발현 수준뿐만 아니라 막 내 공간적 조직에 의해 결정되는 경우가 많기 때문에 원형질막 단백질의 나노스케일 분포를 이해하는 것은 중요합니다. 특히, 많은 치료용 항체가 막 단백질을 표적으로 삼아 나노스케일 연구가 항체 상호작용이 국소 막 단백질 조직에 의해 어떻게 영향을 받는지 이해하는 데 필수적입니다. 그러나 막 단백질 분포의 정밀한 지도화, 단일 분자 개체 프로필 분석, 결합 파트너와의 동적 상호작용 모니터링은 여전히 도전적입니다.

직접 확률적 광학 재구성 현미경(dSTORM)5,6과 나노스케일 지형에서 이미징을 위한 DNA 기반 점 축적(DNA-PAINT)7과 같은 널리 사용되는 단일 분자 위치 현미경(SMLM) 기법은 샘플 표지에 면역형광(IF) 염색을 사용합니다. 이들은 ~ 10 nm의 측면 해상도를 달성하며, 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER2)8,9, CD2010, T 세포 수용체 11,12,13, 프로그래밍된 죽음 리간드 1 14, B 세포 수용체 15,16,17, CD19 17 등 치료용 막 표적의 나노스케일 조직에 대한 광범위한 통찰을 제공했습니다.18. 예를 들어, 치료용 단클론 항체 트라스투주맙을 이용해 유방암과 관련된 핵심 수용체인 HER2를 직접 검출한 d STORM 연구는 HER2 양성 환자 8명에서 뚜렷한 군집 상태를 확인했으며, 다른 치료용 항체는 HER2군집 조절을 촉진하는 것으로 나타났습니다. DNA-PAINT와 격자 광판 현미경을 결합하여 치료용 단클론 항체 리툭시맙, 오파투무맙, 오비누투주맙10과 함께 B세포 내 CD20의 올리고머 상태와 상호작용 프로필을 밝혀냈습니다. 기존 SMLM은 나노스케일 조직에 대한 귀중한 통찰을 제공하지만, 그 잠재력은 전통적인 IF 염색 방식에 의해 제한됩니다. SMLM 이미지의 품질은 IF 염색에 따라 달라지며, 이는 표지 항체의 특이성과 친화도에 의해 결정됩니다. 전통적인 SMLM은 일반적으로 우수한 IF 염색과 이미지 품질을 보이는 고친화성 항체를 사용합니다. 그러나 대부분의 치료용 항체는 중간 정도의 친화력을 가진 생세포의 막 수용체와 상호작용하여 표적 부작용을 최소화합니다19. 예를 들어, 이중특이적 T 세포 참여자(TCEs)는 CD3에 대한 친화도가 낮아 TCR 내화를 방지합니다 20,21,22. 이러한 상호작용은 기존의 IF 기법으로는 정확히 포착할 수 없습니다.

우리는 이전에 단일 분자 항체-에피토프 상호작용을 직접 활용하는 전략인 단일 항체 표지(SAL)를 개발한 바 있습니다. SAL은 항체-에피토프 상호작용의 고밀도 매핑을 가능하게 하면서 천연 결합 평형을 유지합니다. 이전에 세포 내 세포골격 및 미토콘드리아 단백질에 대한 프로토콜을 보고한바 있지만, 막 단백질에 대한 SAL은 아직 입증되지 않았습니다. 이 프로토콜에서는 테트라스패닌 CD81(보고된 치료 표적후보 25,26,27,28)을 현탁 세포와 부착 세포 모두에서 표지함으로써 SAL을 막 단백질에 적용하는 단계별 워크플로우를 제공합니다. 형광 표지된 항-CD81 항체를 이용해 U2OS와 Jurkat T 세포의 CD81 공간 분포를 직접 탐구하여, 막 단백질의 SAL 나노스케일 연구를 시연하였습니다. 우리는 이 전략을 막 SAL(mSAL)이라고 명명했습니다. 마지막으로, 세포 외부에서 분리된 단일 분자 검출을 줄이기 위한 클러스터링 기반 전략을 설명합니다.

본질적으로 SAL은 타임랩스 단일 분자 표지를 사용해 개별 항체-에피토프 상호작용을 포착하고, 이후 단일 방출체 디컨볼루션을 통해 SMLM 기반 초해상도 이미지를 생성합니다. 항체 농도를 조절하고 연속된 이미지 프레임 사이에 적절한 비조명 간격(NII)을 선택함으로써, SAL은 항체 온라인트를 단일 분자 검출률에 맞추어 단일 분자 위치 지정을 가능하게 합니다. SAL은 항체의 본질적으로 느린 결합 반응학 때문에 영상 획득 시간이 길어지기 때문에 더 긴 NII가 필요합니다(~3-17시간). SAL은 에피토프의 정밀한 나노스케일 매핑과 개별 항체-에피토프 상호작용 역학 평가가 필요한 응용 분야에 가장 적합합니다. 처리량이 낮음에도 불구하고, SAL은 거의 생리학적 조건에서 에피토프 조직과 항체 참여에 대한 독특한 통찰을 제공하여 치료 항체를 현장에서 특성화하는 데 특히 유용합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

이 프로토콜은 확립된 Jurkat E6.1 및 U2OS 세포주를 사용하며, 주요 인간 또는 살아있는 동물 재료를 사용하지 않습니다.

1. 세포 시딩/착지 및 고정

참고: 샘플 준비는 표준 면역형광(IF) 염색 프로토콜을 따르며, 다양한 세포 유형에 걸쳐 원형질막 단백질의 세포 내 조직을 보존하도록 최적화되어 있습니다. 관심 대상에 대해 확립된 면역염색 프로토콜이 존재한다면, 사용자는 샘플 차단 단계 1.2.14까지 그 프로토콜을 따를 수 있습니다. 단일 항체 표지(SAL)는 형광 표지된 항체가 단일 분자 수준에서 항원에 결합하면서 누적적으로 검출되는 데 의존합니다. 형광 표지된 항체를 영상 버퍼에서 희석한 상태로 현미경 단계에서 샘플에 첨가하며, 영상 획득이 진행됨에 따라 형광 표지가 동적으로 이루어집니다. 샘플 준비 단계에서는 형광 표지가 이루어지지 않습니다.

  1. 이전에 발표된 프로토콜에 설명된 대로 U2OS 세포주와 같은 부착 세포를 준비합니다24.
  2. 셀 서스펜션
    1. 주르캇 T 세포를 10 mL의 완전한 RPMI 배지(RPMI 1640에 10% 태아 소 혈청, 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신 보충)를 37°C 가습 인큐베이터에 5%CO2 보충 상태로 유지합니다.
      참고: 권장되는 완전 배지 10mL는 T25 플라스크에 해당하며; 사용자는 다양한 배양 용기를 사용할 때 부피를 적절히 조절해야 합니다.
    2. 8웰 챔버드 커버 유리에 사용할 수 있도록 0.01% 폴리-L-라이신(PLL) 용액 200 μL을 웰에 첨가하여 유리 표면을 준비합니다. 4°C에서 하룻밤 또는 37°C에서 2시간 부화하세요.
    3. 혈액세포계를 이용해 배양 세포를 세고, 3.5 x 104개의 세포 를 1.5 mL 마이크로 원심분리관으로 옮깁니다.
      참고: 단일 셀의 적절한 분포를 위해 셀 수를 조정해야 할 수 있습니다. 30,000-60,000개의 Jurkat T 세포 시딩 범위는 단일 세포가 서로 명확하게 분리되면서도 너무 드문드문 분포되지 않는 이상적인 밀도를 달성합니다. 세포 수는 새로운 세포 유형에 맞게 조정이 필요할 수 있습니다.
    4. 300 x g 에서 3분간 원심분리기를 통해 세포 펠릿을 얻습니다. 상청액을 버리고 세포 펠릿을 200 μL 예열(37 °C) 1x Dulbecco's 인산 완충 생리식염수(DPBS)에 재현탁합니다. 생성된 세포 펠릿은 마이크로 원심분리기 튜브 바닥에 작은 흰색 침전물로 보입니다.
      참고: 생물학적 폐기물은 기관의 지침과 모든 적용 가능한 지역, 주, 연방 규정에 따라 처리해야 합니다.
    5. 준비된 챔버드 커버 유리에서 PLL 용액을 흡입합니다(1.2.2단계). PLL 인큐베이션이 4 °C에서 하룻밤 동안 진행될 경우, 8웰 챔버 덮개 유리를 37 °C로 미리 가열한 후 용액을 흡입합니다.
    6. 1.2.4 단계의 셀 서스펜션을 추가하세요. PLL 코팅된 챔버 웰 위로 작업합니다. 37°C의 가습 인큐베이터에서 5%CO2 를 보충하여 세포가 표면에 부착할 수 있도록 30분간 배양합니다. 도금 전에 셀 현탁액을 충분히 섞고, 피펫을 위아래로 움직여 셀 덩어리를 부수고 웰 전체에 고르게 분포되도록 하세요.
    7. 광학 현미경으로 셀이 유리 표면에 붙어 있는 상태를 확인해 보세요. 10배 확대 상태에서 현미경을 커버 유리 하단에 초점을 맞추세요.
      참고: 현미경으로 관찰할 때 챔버 커버 유리를 부드럽게 두드리면 세포가 표면에 붙었는지 아직 떠 있는지 판단하는 데 도움이 될 수 있습니다.
    8. 고정 완충제 200 μL(4% 파라포름알데히드 및 0.1% 글루타알데히드 포함)을 준비하고 수욕에서 37 °C까지 미리 가열합니다.
      참고: 제공된 고정 완충제는 CD81에 최적화되어 있으며, 일반적으로 막 단백질 보존에 적합합니다. 새로운 막 단백질 표적의 경우, 최적의 보존을 위해 완충제 조성을 조정해야 할 수 있습니다. 사용자는 새로운 표적에 맞춘 고정 조건에 대해 문헌을 참고할 것을 권장합니다.
      주의: 파라포름알데히드는 독성이 있고 발암성이 있습니다. 글루타알데히드는 독성이 있고 부식성이 있습니다. 이 시약을 다룰 때는 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용하세요. 피부 접촉 시 즉시 비누와 물로 해당 부위를 철저히 씻으세요. 시약은 사용자의 기관 지침과 모든 적용 가능한 지역, 주, 연방 규정에 따라 폐기해야 합니다.
    9. 각 샘플 웰에서 DPBS를 마이크로피펫으로 흡입하세요(1.2.6단계부터 기준).
      참고: 모든 용액 교환 단계를 천천히 수행하여 셀이 덮개 유리에서 떨어지지 않도록 하는 것이 중요합니다. 사용자 기관의 지침과 모든 관련 지역, 주, 연방 규정에 따라 생물학적 유해 폐기물을 처리해야 합니다.
    10. 웰 한쪽 구석에 미리 가열된 37°C 고정 완충제 200 μL를 추가하고 실온에서 15분간 배큐합니다.
      주의: 파라포름알데히드는 독성이 있고 발암성이 있습니다. 글루타알데히드는 독성이 있고 부식성이 있습니다. 이 시약들을 다룰 때는 적절한 개인 보호 장비를 착용하세요. 피부 접촉 시 즉시 비누와 물로 해당 부위를 철저히 씻으세요. 시약은 사용자의 기관 지침과 모든 적용 가능한 지역, 주, 연방 규정에 따라 폐기해야 합니다.
    11. 고정된 셀을 500 μL DPBS로 3번 세척하세요. 1.2.12 단계를 진행하려면 이 단계를 건너뛰세요.
    12. 선택 사항: 고정액을 천천히 제거하고 갓 준비한 0.1% 붕화나트륨 200 μL을 DPBS에 추가한 후 실온에서 7분간 배양합니다. 붕소화나트륨 환원제를 사용하지 않는다면 이 단계를 건너뛰고 1.2.14단계로 진행하세요.
      참고: 붕소화나트륨으로 환원하면 글루타알데히드가 생성하는 자가형광을 억제하고 반응하지 않은 알데히드를 중화하는 데 도움을 줍니다. 붕소나트륨이 수용액과 반응하여 수소 가스가 방출되면, 기포가 방출되는 현상이 나타납니다. 수소 가스 방출이 관찰되지 않는다면, 갓 만든 붕소나트륨 용액을 사용하세요.
      주의: 붕소나트륨은 독성이 있고 부식성이 있습니다. 이 시약을 다룰 때는 적절한 개인 보호 장비를 착용하세요. 피부 접촉 시 즉시 비누와 물로 해당 부위를 철저히 씻으세요. 시약은 사용자의 기관 지침과 모든 적용 가능한 지역, 주, 연방 규정에 따라 폐기해야 합니다.
    13. 각 웰에서 붕소수소화나트륨 용액을 흡입한 후, 500 μL DPBS로 세 번 세척합니다.
    14. 블로킹 버퍼 200 μL를 준비하여 우물에 추가합니다. 실온에서 30분간 부양하세요. 투과성 시약(예: TritonX-100, Saponin)은 막 단백질을 제거할 수 있으므로 사용하지 마십시오. 여기서 제시된 CD81 막 SAL(mSAL) 프로토콜에는 차단 단계가 포함되지 않았습니다.
      참고: 새로운 표적을 가진 mSAL에는 DPBS 내 5% (w/v) 소 혈청 알부민(BSA)을 포함한 차단 완충제가 권장됩니다. 2차 항체를 사용할 때는 해당 혈청이 차단에 사용됩니다. 예를 들어, 염소-숙주 2차 항체를 사용할 때 DPBS에 10%(v/v) 염소 혈청을 투여합니다. 목표에 대한 확립된 차단 버퍼 레시피와 프로토콜이 존재한다면, 사용자는 그 프로토콜을 따를 수 있습니다. 차단 버퍼는 선택적으로 아이소타입 대조 항체 또는 혈청유래 항체를 보충하여 항체의 비표적 결합을 줄일 수 있습니다23,24. 차단 버퍼에 투과화 시약을 포함하되, 항체가 막 단백질의 세포내 에피토프를 표적으로 할 때만 포함되어야 합니다.
    15. 염료 결합 1차 항체가 포함된 mSAL의 경우, 1.2.20 단계로 바로 진행합니다.
    16. 1차 항체 염색액(차단 완충액에 희석된 원료 농도의 항체) 150 μL을 준비합니다. 염료 결합 1차 항체를 가진 mSAL의 경우, 이 단계를 건너뛰세요.
      참고: 1차 항체 염색에 대해서는 권장 조건에 대해 공급업체의 데이터시트를 참조하십시오. 농도 정보가 제공되지 않은 경우, 전체 길이의 IgG23,24는 4 μg/mL(27 nM)부터 시작하세요.
    17. 차단 버퍼를 1차 항체 용액으로 교체하세요. 습한 방에서 실온에서 2시간 또는 4°C에서 하룻밤 배양하세요. 염료 결합 1차 항체를 가진 mSAL의 경우, 이 단계를 건너뛰세요.
    18. 샘플을 400 μL DPBS로 2번 세척하세요. 우물에 200 μL의 차단 버퍼를 추가하세요.
    19. 선택적으로: 차단 완충제를 고정 후 200 μL 버퍼(4% 파라포름알데히드)로 교체하고 실온에서 10분간 배양합니다.
      참고: 사후 고정은 SAL23,24의 샘플 차단을 보존하는 데 도움이 됩니다. 하지만 이 단계가 에피토프 접근성을 감소시킨다면 생략해야 합니다. 고정 후 부착이 항체에 의한 에피토프 인식에 미치는 영향을 평가하기 위해, 고정 후 고정 여부와 함께 표준 면역형광 염색을 수행하고 염색 품질을 비교합니다.
    20. 선택 사항: 샘플을 DPBS로 두 번 세척하세요.
    21. 각 웰에 200 μL DPBS를 추가하고, 증발을 막기 위해 챔버를 투명 필름으로 덮습니다. 샘플은 최대 1개월간 4°C에서 보관할 수 있습니다. 1.2.14단계 직후 mSAL을 수행하거나 1.2.19에서 후고정 없이 시료를 차단 버퍼에 보관한 후 바로 2.2단계로 진행합니다.
      참고: 샘플을 5 mM 아지이드 나트륨을 보충한 DPBS에 보관하면 저장 중 박테리아 증식을 방지할 수 있습니다.
      주의: 나트륨 아지드는 급성 독성이 있으며 섭취 시 치명적일 수 있습니다. 이 시약을 다룰 때는 적절한 개인 보호 장비를 착용하세요. 피부 접촉 시 즉시 비누와 물로 해당 부위를 철저히 씻으세요. 시약은 사용자의 기관 지침과 모든 적용 가능한 지역, 주, 연방 규정에 따라 폐기해야 합니다.

2. 이미지 획득

참고: 부착 세포와 현탁 세포 모두에 대한 영상 촬영 절차는 유사하며, 전반사 형광(TIRF) 현미경을 사용하여 수행됩니다. 하지만 각 세포 유형에 맞게 영상 조건을 최적화해야 합니다.

  1. 영상 촬영 전에 저장된 샘플(4 °C)을 실온에 두어 유리에 응결을 방지하세요. 샘플 준비 후 바로 영상 촬영으로 진행할 경우 이 단계를 건너뛰세요.
  2. 현미경 시스템에 전원을 공급하세요: 현미경, sCMOS 카메라, 레이저 유닛, 그리고 이미지 획득 소프트웨어가 있는 컴퓨터. 전원이 켜진 후 현미경 시스템이 5-10분 동안 안정화되도록 하여 시스템 부품이 작동 온도에 도달하고 열 드리프트를 최소화할 수 있도록 하세요.
    참고: mSAL은 모든 TIRF 현미경 장비와 호환 소프트웨어를 사용하여 수행할 수 있습니다. 기기 설명서에 따라 시스템을 켜세요.
  3. 침수 오일을 TIRF 대물렌즈(예: 100x/1.49)에 바르고, 챔버 커버 글라스를 현미경 스테이지에 장착합니다.
    참고: 대물렌즈에 교정 칼라가 장착되어 있다면, 23 °C에서 커버 유리의 정확한 두께로 설정해야 합니다. 이 연구에 사용된 커버 유리의 두께는 0.13-0.17 mm였습니다.
  4. 장착 시 Perfect Focus System(PFS)을 작동시키고, 조심스럽게 대물렌즈를 커버 유리에 올려 샘플을 초점에 맞추세요.
  5. 금 콜로이드를 기준 표지자로 준비하세요(초순수수에서 1:2 희석). 희석 전에 금 콜로이드를 초음파 처리하여 응집체를 분산시킵니다.
  6. 샘플 웰에서 저장 버퍼(DPBS 또는 블로킹 버퍼)를 부드럽게 흡입한 후 금 콜로이드 용액 200 μL를 샘플에 첨가합니다. 1분간 배양한 후 용액을 제거하세요.
  7. 밝은 필드 조명을 사용하여 충분한 금 콜로이드가 침착되었는지 확인한 후 용액을 흡입하세요. 이상적인 밀도는 지정된 관심 영역(ROI) 내에 5개에서 10개의 금 콜로이드로 구성됩니다.
    참고: 또는 형광 미세구( 재료표 참조)는 DPBS에서 1:1,000 희석으로 사용할 수 있습니다.
  8. 과도한 금 콜로이드를 제거하기 위해 500 μL 초순수수로 1회 세척한 후 200 μL DPBS를 추가합니다.
  9. 영상 소프트웨어에서 항체 프로브의 형광체(형광체)에 대한 광학 구성을 생성하며, 적절한 이색성, 레이저 여기 파장, 전력 밀도, 카메라 통합 시간, 방출 필터, 카메라 픽셀 비닝(해당 시 포함)을 포함합니다. 최적의 해상도를 위해 150-160 nm의 픽셀 크기가 권장됩니다.
  10. 광표백 단계의 광학 구성을 만드세요. 레이저 출력은 380 W/cm이상 이고 카메라 통합 시간은 1초가 권장됩니다.
    참고: 획득 중 광표백은 개별 형광 항체 결합 사건 간의 중복을 최소화하는 데 도움이 됩니다. 수집된 빛은 카메라 포화를 피하기 위해 파장이 맞지 않는 방출 필터를 통과시킬 수 있습니다.
  11. 레이저 각도를 조절하여 TIRF 조명을 설정하세요. 밝은 필드 조명을 사용해 mSAL을 위한 세포를 식별합니다. 이미지 재구성 중 단계 드리프트를 보정하려면 ROI 내에 최소 5개의 금 콜로이드가 보이도록 하세요. 영상 레이저 출력 밀도에서 금 콜로이드의 자가형광을 확인하세요.
  12. 영상 획득 소프트웨어에서 비조명 간격(NII), 프레임 수, 그리고 광표백 단계의 주파수(필요 시)를 설정하세요. CD81 항체를 가진 U2OS와 Jurkat T 세포에서 CD81의 mSAL 검사를 할 때, 최적의 설정은 NII를 5초, 총 2,000프레임, 그리고 5프레임마다 한 단계씩 광표백하는 것이었습니다.
    참고: 이 매개변수들은 관심 있는 각 단백질, mSAL에 사용되는 항체, 세포 유형에 대해 최적화되어야 합니다. 최적화에 대한 자세한 내용은 3단계를 참고하세요. 최적의 프레임 수는 항체 표적과 세포 유형에 따라 달라질 수 있습니다. 새로운 타겟 시스템의 경우, 2,000-3,000프레임을 촬영하는 것이 시작점으로 권장됩니다. NII는 이미지 획득 시간을 연장합니다. 예를 들어, 20초 NII를 가진 3,000프레임 mSAL 획득은 획득 시간이 ~17시간입니다.
  13. CD81 항체를 200 μL 5% BSA(w/v) DPBS에 희석하여 1 μg/mL 농도로 희석하여 영상 버퍼를 준비합니다. CD81의 mSAL에서 최종 항체 농도는 Jurkat T 세포에서 0.5 nM, U2OS 세포에서 2 nM이었습니다.
    참고: 항체 농도는 국소 기질 풍부도와 항체의 친화도에 따라 달라집니다. 각 단백질 표적, 영상에 사용되는 각 항체, 그리고 각 세포 유형별로 항체 농도를 최적화하는 것이 매우 중요합니다. 최적화에 대한 자세한 내용은 3.1단계를 참고하세요.
  14. 준비된 영상 버퍼를 웰에 추가하고 획득을 시작하세요.

3. 영상 매개변수 최적화

참고: mSAL 영상 매개변수는 단백질 발현, 국소 조직, 그리고 영상에 사용되는 항체 선택에 의해 영향을 받습니다. 영상 매개변수 최적화의 목적은 공간적으로 해상도된 단일 분자 사건을 생성하면서도 충분한 밀도를 유지하여 에피토프 샘플링을 극대화하는 항체 농도와 NII를 식별하는 것입니다.

  1. 항체 농도
    1. 주르캣 세포의 항체를 200 μL 5% BSA(w/v) BSA에 희석한 후 항체 용액을 웰에 첨가합니다. 최적의 단일 항체 표지를 위해서는 평형 해리 상수(Kd) 근처의 항체 농도를 사용하세요; Kd 가 알려지지 않았다면 1 nM에서 시작하는 것이 권장된다.
    2. mSAL용으로 설정된 영상 소프트웨어의 라이브 뷰 기능을 사용하여 항체 결합을 모니터링하세요.
    3. TIRF 각도와 영상 매개변수를 조정하여 신호 대 잡음비(SNR)를 ≥ 3으로 달성합니다.
      참고: 최적의 TIRF 각도는 영상 버퍼 내 확산된 항체로 인한 초점 어긋난 형광을 제한하여 SNR을 향상시킵니다. 시작 시 100-200 W/cm 2의 레이저 전력 밀도와 50ms 카메라 통합 시간을 사용할 수 있습니다. SNR이 낮으면 레이저 출력이나 카메라 통합 시간을 점차 늘리고 최적 값에 도달할 때까지 SNR 변화를 모니터링합니다.
    4. 이미지 획득 소프트웨어에서 최소 10프레임 획득을 5초 NII로 얻도록 영상 파라미터를 설정하세요(2.12단계 참조).
      참고: 시작 기준으로 5초 NII를 권장합니다. 새로운 항체 표적 시스템에 최적의 NII를 찾기 위해 NII 스캔을 수행해야 합니다(3.2단계).
    5. 인수를 시작하세요. 녹화된 영화의 단일 분자 국소화의 희소성을 평가합니다.
      참고: 국소화 밀도를 얻는 자세한 단계는 이전 논문인24에 설명되어 있습니다. mSAL에서는 0.02에서 0.15 이벤트/μm2 사이의 단일 분자 위치 밀도가 최적임이 밝혀졌습니다.
    6. 영상 버퍼를 추가한 직후 여러 겹치는 항체 결합 사건이 관찰되거나 기록이 진행됨에 따라 단일 분자 위치가 누적된다면, 획득을 중단해야 합니다. 항체 농도를 2배 낮춘 후 새로운 샘플에서 다시 채취합니다. 항체 농도를 2배 감소시키고 단위면적당 사건 수를 재평가하여 원하는 단일 분자 위치 사건 밀도를 달성하는 과정을 반복합니다.
      참고: 겹치는 사건들은 첫 번째 항체의 회절 한계 내에서 새로운 항체가 결합할 때 여러 개의 큰 지점이 더 밝거나 커지는 형태로 나타납니다.
    7. 이벤트 밀도가 희박할 경우, 영상 버퍼 내 항체 농도를 2배 증가시키고 새로운 샘플에서 채취를 반복합니다. 항체 농도를 2배 증가시키고 단위 면적당 결합 이벤트 수를 재평가하여 원하는 단일 분자 위치 사건 밀도를 달성하는 과정을 반복합니다.
      참고: 이후 위치 밀도 평가에서 전결합된 항체의 간섭을 피하기 위해 각 농도 최적화 시험마다 신선한 샘플을 사용하는 것이 권장됩니다.
  2. NII 최적화
    1. 이미지 획득 소프트웨어에서 영상 매개변수를 설정하여 50프레임 획득을 얻으세요(2.12단계 참조). NII를 0으로 설정하세요 (지연 없음).
    2. 3.1단계에서 최적화된 항체 농도로 영상 버퍼를 준비한 후 샘플 웰에 첨가합니다. 인수를 시작하세요.
    3. 3.2.1-3.2.2단계를 반복하며 NII를 1, 3, 5, 10, 또는 20초로 조정합니다. 각 채취 시 새로운 샘플을 수행하세요.
    4. 녹화된 영화의 단일 분자 국소화의 밀도와 희소성을 평가합니다(3.1.5-3.1.7 단계 참조). 단일 분자 사건 밀도가 최적 이른 최적 NII가 결정됩니다.
      참고: 해당 NII에 대해 최적의 단일 분자 위치 밀도를 달성하기 위해 항체 농도를 추가로 최적화해야 할 수 있습니다. 3.1단계를 참고하세요. 이전 보고서들은 NII가 길어지면(10-20초) 더 높은 밀도 결합 사건에 더 선택적이었으나, NII를 20초 이상 연장해도 추가 개선은 없었다23,24. 영상 획득 과정에서 공간적으로 겹치는 결합 현상이 발생하면, 결합된 항체에서 형광을 제거할 수 있을 만큼 충분한 간격으로 광표백 단계를 도입합니다. 예를 들어, 다섯 번째 프레임에 겹치는 사건이 나타난다면 다섯 번째 프레임마다 사진 표백을 적용합니다. 공간적으로 겹치는 사건의 출현은 3.1.6단계의 주석에 설명되어 있습니다.

4. 데이터 분석

참고: mSAL 이미지 재구성은 무료 NIH 소프트웨어인 Fiji29와 ThunderSTORM30 플러그인을 사용합니다. 이 프로토콜에는 피지 버전 v1.54r와 ThunderSTORM 버전 1.3이 사용되었습니다. 상세한 영상 분석은 이전 프로토콜 24에서 기술된 바 있습니다. 이 섹션에서는 mSAL에 특별히 사용되는 분석 워크플로우를 개괄합니다. 이 프로토콜에서 제시된 분석은 광전자 수당 A/D 0.98, 카메라 기준 레벨 100의 Prime95B sCMOS 카메라(일련번호 A18B203004)를 사용했습니다. 이미징 픽셀 크기는 147 nm로 설정되어 있습니다.

  1. 재구성 매개변수는 실행 분석 창에서 설정하세요. CD81 mSAL 이미지 재구성에 사용되는 매개변수는 아래에 설명되어 있습니다. 전체 분석을 실행하기 전에 선택된 프레임에서 감지된 단일 분자 결합 이벤트를 평가하는 데 미리보기 기능을 사용해야 합니다.
    이미지 필터링:
    필터: 웨이블릿 필터 (B-스플라인)
    B-스플라인 순서: 2
    B-스플라인 스케일: 4
    분자의 대략적인 위치:
    방법: 국소 최대값
    최고 강도 임계치: std(Wave.F1)
    연결성: 8개 동네
    분자의 서브픽셀 위치:
    방법: PSF: 통합 가우시안
    적합 반경 [px]: 2
    적합 방법: 최대 확도
    초기 시그마 [px]: 0.75
    다중 방출기 적합 분석: 선택되지 않음
    결과 시각화:
    방법: 정규화 가우시안
    배율: 7.3
    업데이트 빈도 [프레임]: 50
    측면 불확실성: 20
    참고: 사전 필터링 매개변수는 배경에서 단일 방출기 검출을 향상시키기 위해 사용됩니다. 이들은 출발점으로 제공되지만, 각 데이터셋에 맞게 최적화되어야 합니다. 단일 분자 결합 사건에는 대략적인 위치 및 검출 방법 매개변수가 사용됩니다. 8-이웃 연결성을 가진 국소 강도 최대값 사용은 신뢰할 수 있는 성능을 제공하는 것으로 보입니다. 최대우도 적합을 가진 통합 가우시안 방법이 선택되었는데, 이는 널리 사용되고 단일 분자 영상 응용에서 점확산 함수(PSF)를 신뢰성 있게 근사할 수 있기 때문입니다 32,33,34,35. 이 프로토콜에서 사용되는 시각화 방법은 정규화 가우시안입니다. 사용자는 자신의 데이터에 가장 적합한 시각화 방법을 선택할 수 있습니다. 배율은 20 nm의 재구성 픽셀 크기를 얻도록 설정되었으며, 이는 항체 기반 표지로 달성할 수 있는 위치 정밀에 적합하며, 결합 오차는 약 ~10 nm 정도입니다. 7.3의 배율은 회절 제한 픽셀 크기를 원하는 재구성 픽셀 크기(147 nm / 20 nm = 7.3)로 나누어 계산했습니다. 업데이트 빈도는 재구성 이미지가 처리 중 얼마나 자주 새로고침되는지를 결정하지만, 최종 결과에는 영향을 미치지 않습니다. 측면 불확실성은 20으로 설정되어 (강제되지 않음), 재구성에 계산된 국소화 불확실성을 포함시킵니다. 이용 가능한 옵션에 대한 추가 정보는 ThunderSTORM 사용자 가이드30을 참조하거나 입력란 옆의 물음표를 클릭하세요.
  2. ThunderSTORM 분석을 시작 시 초기 시그마 1.6픽셀, 적합 반경 3으로 시작하세요. 필요에 따라 매개변수를 정밀하게 조정하세요. 회절 제한 이미지에서 사건 밀도가 겹치지 않도록 다중 방출기 피팅은 사용되지 않았습니다.
  3. 복원 작업을 실행하려면 확인 버튼을 클릭하세요. 완료되면 결과 창이 자동으로 열립니다.
  4. 플롯 히스토그램 기능을 사용해 피크 시그마를 찾으세요. 이 값(nm)을 원시 데이터 픽셀 크기로 나누어 픽셀로 변환한 후, 초기 시그마의 새 값과 피팅 반경을 3배 초기 시그마30에 가까운 정수로 설정하여 ThunderSTORM 분석을 다시 실행하세요.
  5. 선택한 피듀셜 마커24를 사용하여 드리프트 보정을 결정합니다.
  6. 전체 시야각에서 이미지 재구성을 수행하고 계산된 드리프트 보정을 적용합니다.
  7. 이미지 후처리를 원하시면 결과 창의 필터 탭을 클릭하세요. 필터를 적용해 지역적으로 잘 파악되지 않은 이벤트를 제거하세요. CD81 결과에서는 200nm 이상의 시그마와 20nm 이상의 불확실성을 가진 사건이 제거되었습니다. 플롯 히스토그램 함수를 사용하여 시그마 분포를 분석하고 적절한 컷오프를 결정하세요.
    참고: 시그마 값이 큰 단일 분자 국소화는 일반적으로 광자 수가 적은 어두운 형광체나 겹치는 방출체에서 발생합니다. 불확실성이 20 nm를 초과하는 위치 지정도 제거되었는데, 이는 최종 픽셀 크기를 초과하는 불확실성은 위치 정확도가 낮다는 의미입니다. 필터링 매개변수에 대한 추가 지침은 ThunderSTORM 사용자 가이드30을 참조하십시오.
  8. 결과 표와 함께 단일 분자 위치 데이터를 저장하여 하위 분석을 위해 ' 내보내기'를 선택하세요. 내보내진 파일은 .csv 파일 형식으로 제공되며, 이 프로토콜에서는 mSAL.csv라고 부릅니다. 결과로 나온 정규화된 가우시안 이미지를 저장하세요.

5. 군집 분석

참고: 에피토프 탐침 과정에서 항체는 의도한 표적(특이적 상호작용)과 비표적 분자(비특이적 상호작용)와 상호작용합니다. mSAL은 단일 항체-항원 결합 사건의 누적 검출에 의존하기 때문에, 일부 비특이적 상호작용이 재구성된 영상에 필연적으로 기여합니다. 항체-에피토프 상호작용은 원칙적으로 특이적 결합과 비특이적 결합을 구분할 수 있는 독특한 동역학적 지문을 보이며, 특이적과 비특이적 사건은 단일 분자 거주 시간36이 아니라 국소적 상호작용 밀도로 구분됩니다. 여기서는 노이즈 분석을 이용한 밀도 기반 공간적 응용(DBSCAN)37 클러스터링을 통해 저밀도 이벤트를 제거하고, 특정 항체 결합을 더 잘 반영하는 고밀도 이벤트는 유지합니다. 또한, 밀도 기반 클러스터링은 특히 CD81이 테트라스패닌 풍부 마이크로도메인 38,39,40,41,42로 자연스럽게 클러스터로 조직되는 단백질의 나노스케일 공간 조직에 대한 정량적 통찰을 제공할 수 있습니다. 제공된 DBSCAN 분석은 MATLAB 2025a를 사용하여 수행되었습니다. MATLAB에 접근할 수 없는 사용자에게는 Python이나 R43, 44, 45와 같은 오픈 소스 대안으로 유사한 DBSCAN 분석을 수행하는 것이 권장됩니다. 이 프로토콜에서 사용되는 코드는 다음 https://github.com/nrams12/DBSCAN_SAL_Clusterer/tree/main 에서 얻을 수 있습니다.

  1. 코드 실행
    1. 위의 GitHub 링크에서 MATLAB 파일을 다운로드하세요.
    2. MATLAB을 시작하고 코드를 열어보세요. 37과 38행에서는 클러스터링 매개변수의 최소 점수(minPTS)와 epsilon을 설정합니다. 다음과 같은 매개변수가 사용되었습니다:
      주르캇 T 세포:
      최소 포인트: 7
      엡실론: 60
      U2OS 셀:
      최소 포인트: 7
      엡실론: 80
      참고: 이 매개변수들을 최적화하는 자세한 내용은 5.2단계를 참조하세요.
    3. MATLAB 소프트웨어에서 파일 경로를 재구성된 mSAL.csv 파일이 포함된 폴더로 설정하세요.
    4. 실행 을 클릭해 코드를 실행하세요. 코드는 사용자가 파일을 선택하도록 안내합니다. mSAL.csv 파일을 선택하고 열기를 클릭하세요.
    5. 클러스터화된 데이터는 코드에서 지정된 파일 경로의 MATLAB Data라는 폴더에 자동으로 저장됩니다. ThunderSTORM에서 Plugins > ThunderSTORM을 클릭해 Import/Export > 결과를 가져오> 이 파일을 엽니다.
    6. 결과물인 단일 분자 위치 현미경 이미지를 저장하세요.
  2. 클러스터링 입력의 최적화
    참고: DBSCAN 알고리즘의 두 입력 매개변수는 minPTS와 엡실론입니다. 엡실론은 점의 이웃을 설정하기 위해 반지름을 정의하는 반면, minPTS는 그 이웃 내에서 밀집 영역을 형성하는 데 필요한 최소 점의 수를 지정합니다. 이 밀도 요구를 충족하는 점들은 코어 점으로 분류되며, 이들의 이웃은 클러스터에 재귀적으로 추가됩니다. 밀도 요건을 충족하지 못하지만 코어 점의 이웃 내에 속하는 점들은 경계 점으로 표시되며, 나머지 모든 점은 잡음 점으로 간주됩니다.
    1. 위에 설명한 입력값(단계 5.1.2)을 출발점으로 분석하세요. 셀 내 노이즈 국소화 수보다 높고 국소화 수보다는 낮은 minPTS 값을 선택하세요. minPTS를 선택한 후, 이 수의 국소화가 대표적인 온셀 영역의 이웃 반경 내에서 포착되도록 에프실론을 조정합니다.
      참고: minPTS와 엡실론은 서로 독립적으로 조정할 수 있습니다. 이러한 매개변수를 선택하는 실용적인 방법은 먼저 셀 외부의 잡음점들의 산점도를 살펴보고, 이를 셀 내 유사한 크기의 영역에서 관찰된 국지화 수와 비교하는 것입니다.
    2. 군집화된 데이터를 나타내는 그림 2 의 창을 평가합니다. 데이터가 예상 표현형을 포함하는 셀 내에서 클러스터를 유지하고 셀 외부의 위치가 최소화된다면, 클러스터링 입력은 적절합니다.
      참고: 클러스터 데이터는 mSAL로 수집된 데이터의 구조를 유지해야 합니다. 클러스터가 작고 원래 데이터의 매우 높은 밀도 영역에만 국한되어 있으며, 예상 표현형과 상관관계가 있는 많은 결합 이벤트를 제외한다면, 클러스터링 매개변수가 너무 제한적일 수 있습니다. 세포 외부의 비특이적 결합이 큰 클러스터로 충분히 줄어들지 않으면, 클러스터링 매개변수가 너무 포괄적일 수 있습니다.
    3. 군집 매개변수가 너무 제한적이라면 minPTS를 줄이고 epsilon을 늘려 클러스터 데이터에 더 많은 점을 포함하도록 합니다. 군집 매개변수가 너무 포괄적이라면 minPTS를 늘리고 엡실론을 줄이세요.
    4. minPTS와 epsilon을 조정한 후 코드를 다시 실행하세요. 최적의 클러스터링이 달성될 때까지 5.2.2-5.2.3 단계를 반복합니다.

6. 항체가 표적에 결합하는 검증

참고: 형태가 명확하지 않은 막 단백질의 경우, 분해된 구조의 정확성을 검증하는 것이 어려울 수 있습니다. 항체의 특이성을 검증하기 위해 사용자는 표적 단백질의 형광 단백질(FP) 융합을 발현할 수 있습니다. 초기 검사로, FP 융합을 발현하는 세포에 대해 기존의 면역형광 염색을 시행할 수 있습니다. 새로운 항체 평가 시 보다 정밀한 검증을 위해, FP-발현 세포에 mSAL을 수행하여 국소화된 결합 이벤트가 형광 표적과 일치하는지 확인할 수 있습니다. 여기서는 CD81-mStayGold로 U2OS 세포를 형질전환하는 프로토콜을 예시로 설명하여, CD81 mSAL 위치가 세포 표면의 FP-표지된 CD81과 일치함을 확인할 수 있게 합니다. 사용자는 검증 대상 항체의 형광 채널과 방출이 겹치지 않는 한 적합한 형광 단백질을 대체할 수 있습니다.

  1. 8웰 챔버 슬라이드에 U2OS 세포를 씨앗 뿌려 ~70% 합류율로 성장합니다. 완전 성장 배지 200 μL에 세포를 유지하며(DMEM에 10% (v/v) 태아 소 혈청, 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신 보충).
  2. 단백질을 암호화하는 DNA 구성체 100 ng와 형광 리포타민 리포타민 2000 5 μL를 결합합니다. 30초 동안 소용돌이 후 상온에서 30분간 부양하세요.
    참고: 이 연구는 CD81을 mStayGold에 융합하여 사용했습니다. 표준 분자 클로닝 기법이 DNA 플라스미드 생성에 사용되었으나, 이 프로토콜에는 기술되지 않았습니다. 제공된 DNA: 리포펙타민 비율은 8웰 챔버 슬라이드에 시딩된 세포에 최적화되어 있으며, 다른 샘플 형식의 경우 제조사 지침에 따라 조정이 필요할 수 있습니다.
  3. 세포에 5 μL DNA/리포펙타민 용액을 첨가합니다. 37°C에서 4시간 동안 보관하고, 습한 환경에서 5%CO2 를 보충합니다.
  4. 배재는 미리 데워진 완전 성장 배재로 교체하세요. 37°C에서 5%CO2 를 보충하여 습한 환경에서 8시간 > 배양하여 단백질 발현 수준을 감지할 수 있도록 합니다.
  5. 형광 현미경이나 이미저를 사용해 세포의 형광 발현 수준을 평가합니다. 트랜스펙션 효율은 ≥ 30%가 권장됩니다. 형광 발현 수준이 최적이 아니라면, 제조사 지침에 따라 DNA와 리포펙타민 비율을 최적화하세요.
    참고: 일시적으로 발현된 세포는 형질전환 후 24-48시간 이내에 항체 검증을 위해 사용해야 합니다.
  6. 셀을 수정하려면 1.2.8-1.2.13 단계를 따라 하시기 바랍니다.
  7. 고정된 샘플을 5 mM 아지드 나트륨이 포함된 200 μL DPBS에 보관하여 영상 촬영 준비가 될 때까지 보관합니다. 샘플은 최대 1개월간 4°C에서 보관할 수 있습니다.
    주의: 나트륨 아지드는 급성 독성이 있으며 섭취 시 치명적일 수 있습니다. 이 시약을 다룰 때는 적절한 개인 보호 장비를 착용하세요. 피부 접촉 시 즉시 비누와 물로 해당 부위를 철저히 씻으세요. 시약은 사용자의 기관 지침과 모든 적용 가능한 지역, 주, 연방 규정에 따라 폐기해야 합니다.
  8. 현미경을 설치하고 샘플을 마운트하는 2.1-2.12 단계를 따라 하세요. 형광 신호를 이용해 관심 단백질을 발현하는 세포를 식별합니다.
  9. 참고로, 셀의 TIRF 이미지를 캡처하세요. mSAL 항체와 같은 영상 채널에 있는 형광 단백질을 사용할 경우, 형광 단백질의 광표백을 수행합니다. 단백질을 광표백하려면 신호가 없을 때까지 최대 레이저 출력을 10분 동안 > 사용합니다.
  10. 준비된 영상 버퍼를 웰에 추가하고 영상 촬영을 시작하세요. 분석은 앞서 설명한 대로 완료되어야 합니다(4단계).
  11. mSAL 획득 전에 획득한 형광 단백질의 재구성 이미지와 TIRF 이미지를 모두 열어. 회절 제한 TIRF 이미지에 나타나는 발현 단백질의 외관과 위치 위치를 mSAL 이미지와 비교하여 mSAL 항체 결합 위치를 평가합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

이 프로토콜에서 설명된 mSAL 기법은 단일 항체가 해당 원형질막 단백질 표적에 결합하는 현상을 시각화하여 막 단백질 분포의 초해상도 지도를 생성할 수 있게 합니다. CD81이 대표적인 예로 사용되지만, 이 접근법은 다른 막 단백질에도 쉽게 적용할 수 있습니다.

Jurkat T 세포를 세포 간 충분한 간격으로 고정시키면, 항체와 유리 표면에 의해 막 에피토프가 접근하여 fiducial이 침전할 수 있도록 합니다(그림 1A). 또한, 피펫팅 기술은 섬세한 막 구조의 보존에도 직접적인 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 용액 교환 단계에서는 피펫을 부드럽게 사용하는 것이 권장됩니다. 샘플 챔버를 각도를 잡고 용액을 웰 모서리에 피펫 넣으면 용액 흐름이 세포를 밀어내고 섬세한 막 구조를 파괴하는 것을 방지할 수 있습니다(그림 1B

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

원형질막 단백질의 조직은 세포 기능 조절에 중요한 역할을 합니다. 기존의 형광 현미경 기술은 빛의 회절 한계에 의해 제한되어 나노 규모 조직이 가려집니다. SMLM은 10-20 nm47의 공간 해상도를 달성함으로써 이 한계를 극복하여, 나노스케일 조립체10, 48, 49의 특성화를 가능하게 합니다. SMLM 내 클러스터링 아티팩트는 동일한 플루로포어50을 반복 검출하여 단백질 클러스터의 모습을 유발할 수 있습니다. 단일 분자 검출은 형광체의 광전환 특성에 의존하므로 국소 에피토프 농도인 51,52,53,54,55를 완전히 나타내지 못합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

모든 저자는 공개할 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 출판물에 보고된 연구는 국립보건원(NIH) 산하 국립일반의학과학연구소(National Institute of General Medical Sciences)의 수여 번호 R35GM146786과 일리노이 대학교 시카고 교양대학의 지원을 받았습니다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며, 반드시 국립보건원(NIH)의 공식 입장을 대표하지는 않습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
항-CD81 알렉사 플루오르 488 항체써모피셔 사이언티브MA5-44132영상 항체
벤치탑 원심분리기에펜도르프5424
소 혈청 알부민밀리포어 시그마A7906-100G
챔버드 커버 유리, 8웰셀비스C8-1-N
DMEM 미디어써모피셔 사이언티브11960069
둘벡코의 인산염 완축 식염수써모피셔 사이언티브14190-144
태아 소 혈청밀리포어 시그마F0926-500ML
글루타알데히드, 10%전자현미경 과학16120
금 콜로이드, 100nm테드 펠라15711년과 이하; 20피듀셜 마커
침수 오일 & nbsp;카길 연구소16245
역현미경   TIRF 모듈 장착니콘 인스트루먼트이클립스 Ti2-E현미경
Jurkat E6.1 세포주밀리포어 시그마88042803-1VL서스펜션 셀
레이저 런치, 6라인옥시우스L6CC-CS8-1511여기 레이저
리포펙타민 2000써모피셔 사이언티브11668019트랜스펙션 시약
마이크로 원심분리관, 1.5 mL  VWR89000-028
현미경 영상 소프트웨어니콘 인스트루먼트NIS-엘리먼트 고급 연구이미지 수집 소프트웨어
목표 기준, 100x/1.49 CFI APO TIRF 니콘 인스트루먼트MRD01991현미경 대물렌즈
파라포름알데히드, 16%전자현미경 과학15710
페니실린-스트렙토마이신써모피셔 사이언티브15140-122항생제
폴리-L-라이신 용액, 0.01% & nbsp;밀리포어 시그마P4707-50ML
Prime 95B sCMOS 카메라텔레다인 비전 솔루션01-프라임-95B-R-M-16-C카메라
RPMI 1640 미디어써모피셔 사이언티브11875-093현탁 셀용 매체
아자이드나트륨써모피셔 사이언티브19038-1000
붕소나트륨밀리포어 시그마213462-25G
T25 배양 플라스크써모피셔 사이언티브169900
테트라스펙 마이크로스피어피듀셜 마커
조직 배양 접시, 100 mm 코닝353003
U2OS 세포주ATCCHTB-96부착 세포

참고문헌

  1. Zulueta Diaz, Y., de las, M., Arnspang, E. C. Super-resolution microscopy to study membrane nanodomains and transport mechanisms in the plasma membrane. Front Mol Biosci. 11, 1455153(2024).
  2. Levental, I., Lyman, E. Regulation of membrane protein structure and function by their paralipidomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 24 (2), 107(2022).
  3. Stephens, A. D., Wilkinson, T. Discovery of Therapeutic Antibodies Targeting Complex Multi-Spanning Membrane Proteins. Biodrugs. 38 (6), 769(2024).
  4. Chan, A. C., Martyn, G. D., Carter, P. J. Fifty years of monoclonals: the past, present and future of antibody therapeutics. Nat Rev Immunol. 25, 745-765 (2025).
  5. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
  6. Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angew Chem Int Ed Engl. 47 (33), 6172-6176 (2008).
  7. Jungmann, R., et al. Multiplexed 3D cellular super-resolution imaging with DNA-PAINT and Exchange-PAINT. Nat Methods. 11 (3), 313-318 (2014).
  8. Tobin, S. J., et al. Single molecule localization microscopy coupled with touch preparation for the quantification of trastuzumab-bound HER2. Sci Rep. 8 (1), 15154(2018).
  9. Wakefield, D. L., et al. Using quantitative single molecule localization microscopy to optimize multivalent HER2-targeting ligands. Front Med. 10, 1064242(2023).
  10. Ghosh, A., et al. Decoding the molecular interplay of CD20 and therapeutic antibodies with fast volumetric nanoscopy. Science. 387 (6730), eadq4510(2025).
  11. Lillemeier, B. F., et al. TCR and Lat are expressed on separate protein islands on T cell membranes and concatenate during activation. Nat Immunol. 11 (1), 90-96 (2010).
  12. Hu, Y. S., Cang, H., Lillemeier, B. F. Superresolution imaging reveals nanometer- and micrometer-scale spatial distributions of T-cell receptors in lymph nodes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (26), 7201-7206 (2016).
  13. Rossboth, B., et al. TCRs are randomly distributed on the plasma membrane of resting antigen-experienced T cells. Nat Immunol. 19 (8), 821-827 (2018).
  14. Civita, S., et al. Nanoscale engagement of programmed death ligand 1 (PD-L1) in membrane lipid raft domains of cancer cells. FEBS J. 292 (22), 5979-5997 (2025).
  15. Lee, J., Sengupta, P., Brzostowski, J., Lippincott-Schwartz, J., Pierce, S. K. The nanoscale spatial organization of B-cell receptors on immunoglobulin M- and G-expressing human B-cells. Mol Biol Cell. 28 (4), 511(2017).
  16. Ferapontov, A., et al. Antigen footprint governs activation of the B cell receptor. Nat Commun. 14 (1), 976(2023).
  17. Mattila, P. K., et al. The actin and tetraspanin networks organize receptor nanoclusters to regulate B cell receptor-mediated signaling. Immunity. 38 (3), 461-474 (2013).
  18. Nerreter, T., et al. Super-resolution microscopy reveals ultra-low CD19 expression on myeloma cells that triggers elimination by CD19 CAR-T. Nat Commun. 10 (1), 3137(2019).
  19. Slaga, D., et al. Avidity-based binding to HER2 results in selective killing of HER2-overexpressing cells by anti-HER2/CD3. Sci Transl Med. 10 (463), eaat5775(2018).
  20. Haber, L., et al. Generation of T-cell-redirecting bispecific antibodies with differentiated profiles of cytokine release and biodistribution by CD3 affinity tuning. Sci Rep. 11 (1), 14397(2021).
  21. Abdelmotaleb, O., Schneider, A., Gassner, C., Märsch, S., Klein, C. The impact of CD3 affinity-attenuation on T cell engaging bispecific antibodies: is it really that simple. Expert Opin Drug Discov. 20 (8), 943-949 (2025).
  22. Dang, K., et al. Attenuating CD3 affinity in a PSMAxCD3 bispecific antibody enables killing of prostate tumor cells with reduced cytokine release. J Immunother Cancer. 9 (6), e002488(2021).
  23. Gunasekara, H., et al. Superresolution Imaging with Single-Antibody Labeling. Bioconjugate Chem. 34 (5), 825-833 (2023).
  24. Perera, T., Gunasekara, H., Hu, Y. S. Single-Molecule Localization Microscopy Using Time-Lapse Imaging of Single-Antibody Labeling. Curr Protoc. 3 (10), e908(2023).
  25. Küppers, R. CD81 as target for B cell lymphomas. J Exp Med. 216 (7), 1469-1470 (2019).
  26. Vences-Catalán, F., et al. CD81 is a novel immunotherapeutic target for B cell lymphoma. J Exp Med. 216 (7), 1497-1508 (2019).
  27. Vences-Catalán, F., et al. Targeting the tetraspanin CD81 reduces cancer invasion and metastasis. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (24), e2018961118(2021).
  28. Bailly, C., Thuru, X. Targeting of Tetraspanin CD81 with Monoclonal Antibodies and Small Molecules to Combat Cancers and Viral Diseases. Cancers. 15 (7), 2186(2023).
  29. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  30. Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
  31. Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. Image analysis for single-molecule localization microscopy. In: Super-Resolution Imaging in Biomedicine. , 79-94 (2016).
  32. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).
  33. Stallinga, S., Rieger, B. Accuracy of the Gaussian point spread function model in 2D localization microscopy. Opt Express. 18 (24), 24461-24476 (2010).
  34. Huang, F., Schwartz, S. L., Byars, J. M., Lidke, K. A. Simultaneous multiple-emitter fitting for single molecule super-resolution imaging. Biomed Opt Express. 2 (5), 1377-1393 (2011).
  35. Smith, C. S., Joseph, N., Rieger, B., Lidke, K. A. Fast, single-molecule localization that achieves theoretically minimum uncertainty. Nat Methods. 7 (5), 373-375 (2010).
  36. Chatterjee, T., et al. Direct Kinetic Fingerprinting and Digital Counting of Single Protein Molecules. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (37), 22815-22822 (2020).
  37. A density-based algorithm for discovering clusters in large spatial databases with noise. Ester, M., Kriegel, H. P., Sander, J., Xu, X. Int Conf Knowledge Disc Data Mining, 240, 226-231 (1996).
  38. Termini, C. M., Gillette, J. M. Tetraspanins Function as Regulators of Cellular Signaling. Front Cell Dev Biol. 5, 242379(2017).
  39. Levy, S., Shoham, T. Protein-protein interactions in the tetraspanin web. Physiology. 20, 218-224 (2005).
  40. Rubinstein, E., et al. CD9, CD63, CD81, and CD82 are components of a surface tetraspan network connected to HLA-DR and VLA integrins. Eur J Immunol. 26 (11), 2657-2665 (1996).
  41. Schmidt, S. C., Massenberg, A., Homsi, Y., Sons, D., Lang, T. Microscopic clusters feature the composition of biochemical tetraspanin-assemblies and constitute building-blocks of tetraspanin enriched domains. Sci Rep. 14 (1), 2093(2024).
  42. Zuidscherwoude, M., et al. The tetraspanin web revisited by super-resolution microscopy. Sci Rep. 5, 12201(2015).
  43. Comparative performance analysis of K-means and DBSCAN clustering algorithms on various platforms. Shahriar, N., Akib Al Faisal, S. M., Pinjor, M. M., Sharif Zobayer Rafi, M. A., Rahman Sarkar, A. Proceedings of the 22nd International Conference on Computer and Information Technology (ICCIT), , 1-6 (2019).
  44. Hahsler, M., Piekenbrock, M., Doran, D. dbscan: Fast Density-Based Clustering with R. J Stat Softw. 91 (1), 1-30 (2019).
  45. Pedregosa, F., et al. Machine Learning with PyTorch and Scikit-Learn: Develop machine learning and deep learning models with Python. J Mach Learn Res. 12, 2825-2830 (2011).
  46. Buchwalow, I., Samoilova, V., Boecker, W., Tiemann, M. Non-specific binding of antibodies in immunohistochemistry: fallacies and facts. Sci Rep. 1, 28(2011).
  47. Bond, C., Santiago-Ruiz, A. N., Tang, Q., Lakadamyali, M. Technological advances in super-resolution microscopy to study cellular processes. Mol Cell. 82 (2), 315-332 (2022).
  48. Garcia-Parajo, M. F., Cambi, A., Torreno-Pina, J. A., Thompson, N., Jacobson, K. Nanoclustering as a dominant feature of plasma membrane organization. J Cell Sci. 127 (23), 4995-5005 (2014).
  49. Tan, H. L., Bungert-Plümke, S., Kortzak, D., Fahlke, C., Stölting, G. Determination of oligomeric states of proteins via dual-color colocalization with single molecule localization microscopy. eLife. 11, e76631(2022).
  50. Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy. Nat Methods. 8 (7), 527-528 (2011).
  51. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
  52. Shivanandan, A., Deschout, H., Scarselli, M., Radenovic, A. Challenges in quantitative single molecule localization microscopy. FEBS Lett. 588 (19), 3595-3602 (2014).
  53. Endesfelder, U., Heilemann, M. Art and artifacts in single-molecule localization microscopy: beyond attractive images. Nat Methods. 11 (3), 235-238 (2014).
  54. Lambert, T. J., Waters, J. C. Navigating challenges in the application of superresolution microscopy. J Cell Biol. 216 (1), 53-63 (2017).
  55. Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. Quantitative photo activated localization microscopy: unraveling the effects of photoblinking. PloS One. 6 (7), e22678(2011).
  56. Jungmann, R., et al. Quantitative super-resolution imaging with qPAINT. Nat Methods. 13 (5), 439-442 (2016).
  57. Unterauer, E. M., Jungmann, R. Quantitative Imaging With DNA-PAINT for Applications in Synaptic Neuroscience. Front Synaptic Neurosci. 13, 798267(2021).
  58. Stein, J., Stehr, F., Jungmann, R., Schwille, P. Calibration-free counting of low molecular copy numbers in single DNA-PAINT localization clusters. Biophys Rep. 1 (2), 100032(2021).
  59. Youn, Y., et al. Quantitative DNA-PAINT imaging of AMPA receptors in live neurons. Cell Rep Methods. 3 (2), 100408(2023).
  60. Yin, H., Flynn, A. D. Drugging Membrane Protein Interactions. Annu Rev Biomed Eng. 18, 51-76 (2016).
  61. Jin, S., et al. Emerging new therapeutic antibody derivatives for cancer treatment. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 39(2022).
  62. To'a Salazar, G., Huang, Z., Zhang, N., Zhang, X. -G., An, Z. Antibody therapies targeting complex membrane proteins. Engineering. 7 (11), 1541-1551 (2021).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

태그

세포막초고해상도 현미경CD81 단백질밀도 기반 클러스터링항체 결합드리프트 보정치료용 항체
단일 항체 표지를 이용한 막 단백질의 단분자 위치 현미경
문의하기
도서관에 추천하기

개인정보 처리방침

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.