식물화학적 프로파일링, 가스 크로마토그래피-질량분석법 분석, 그리고 쥐에서 Terminalia mantaly의 생체 내 활성

요약

여기서는 식물화학 분석, 가스 크로마토그래피-질량분석법 특성 분석, 검증된 생체 내 검사법을 통합하여 Terminalia mantaly의 항염증, 진통, 해열 활성을 평가하는 프로토콜을 제시하며, 약용 식물의 약리학적 평가를 위한 재현 가능한 틀을 제공합니다.

초록

염증, 통증, 발열 치료용 합성 약물은 효과적이지만 종종 부작용을 일으키며 식물 유래 치료제에 대한 관심이 높아지고 있습니다. 아프리카 의학에서 전통적으로 사용되던 Terminalia mantaly H. Perrier는 과학적 검증이 제한적입니다. 본 연구는 식물화학적 스크리닝, 페놀 및 플라보노이드 화합물의 정량 분석, 가스 크로마토그래피-질량분석법(GC-MS) 특성 분석, 그리고 생체 내 약리학적 시험을 결합한 통합 실험 프로토콜을 제시하여 T. mantaly의 메탄올 추출물의 치료 잠재력을 평가합니다. 식물화학적 선별 검사를 통해 여러 생물 활성 계열의 존재가 확인되었고, GC–MS 분석 결과 지방산, 식물스테롤, 토코페롤 및 항염증 및 항산화 특성을 가진 기타 생리활성 화합물 등 20가지 성분이 확인되었습니다. 쥐를 대상으로 한 생체 내 약리학적 평가는 카라기난 유발 발부종 모델에서 용량 의존적 항염증 활성, 꼬리 침수 검사에서 통증 철단 잠복기의 유의미한 연장, 효모 유발 발열증 감소를 보여주었습니다. 더 높은 용량에서는 디클로페낙, 파라세타몰 같은 표준 약물과 유사한 효과를 보였습니다. 급성 독성 및 세포독성 평가 결과, 시험 용량 범위 내에서 유리한 안전성 프로필이 나타났습니다. 이 발견들은 T . mantaly 의 민족 의학적 사용을 입증하고, 식물화학적 조성과 약리학적 활성을 연결하는 재현 가능한 실험 틀을 제시합니다. 프로토콜은 약용 식물을 연구하는 연구자들에게 실질적인 방법론적 참고를 제공하며, 염증성 및 열성 질환 관리를 위한 식물유래 약물 개발을 지원합니다.

서론

염증, 통증, 발열은 서로 연결된 병리 과정으로, 급성 및 만성 질환의 기저가 됩니다. 비스테로이드 항염증제, 코르티코스테로이드, 파라세타몰과 같은 합성 약물이 여전히 치료의 주축이지만, 장기 사용 시 위장 자극, 신장 합병증, 간 독성 및 기타 부작용과 연관되는 경우가 많습니다¹. 이러한 한계는 염증 및 열성 질환 관리를 위한 더 안전하고 지속 가능한 대안으로서 약용 식물에 대한 관심이 높아지게 만들었습니다. 천연 제품은 다양한 생리활성 분자로 잘 알려져 있으며, 이들 중 다수는 현대 신약 개발의 주도가 됩니다. 이 맥락에서 콤브레타과(Combretaceae)에 속하는 T. mantaly는 아프리카 전통 시스템에서 감염, 위장 질환, 염증성 질환 치료에 민족 의학적으로 사용되어 주목받고 있습니다 ^2,3. 전통적인 중요성에도 불구하고, 그 치료 잠재력을 입증하는 체계적인 약리학적 연구는 여전히 제한적입니다. 특히, 식물화학 스크리닝, 생체 내 생물학적 평가, GC–MS와 같은 첨단 화학적 프로파일링 방법을 통합한 포괄적인 연구가 부족합니다. 이 격차를 해소하는 것은 민속적 응용을 과학적으로 입증하고 의약^{품 사용 가능한} 선도 화합물을 식별하는 데 매우 중요합니다. 본 연구에서는 T. mantaly의 메탄올 추출물을 상세한 식물화학적 및 약리학적 평가를 거쳤습니다. 예비 분석에서 페놀릭, 플라보노이드, 탄닌, 사포닌, 테르페노이드 등 주요 대사산물의 존재가 확인되었으며, 이들 모두는 항염증, 진통, 항산화 효과에 기여하는 것으로 알려져 있습니다⁵. 정량적 분석법 결과 추출물에는 페놀 및 플라보노이드 화합물이 상당량 포함되어 있어 기준 기준과 유사한 수준으로 강한 항산화 잠재력을 시사했습니다.

동물 모델이 사용된 이유는 평가된 약리학적 반응이 염증, 신경, 체온 조절 경로가 통합되어 있어 시험관 내에서 재현할 수 없기 때문입니다. 생체 내 검사는 생체 활성에 대한 명확한 약리학적 증거를 제공했습니다. 항염증(카라기난에 의해 유발되는 발바닥 부종), 진통(꼬리 침지), 그리고 발열(효모에 의해 유발된 발열) 특성이 쥐에서 시험되었으며, 고용량 디클로페낙 나트륨과 유사한 용량 의존적 항염증 활성을 보여주었습니다. 마찬가지로, 추출물은 쥐에서 꼬리 침수 잠시 시간을 증가시켜 진통 효과를 확인시켰고, 효모 유발 발열증 모델은 파라세타몰⁶과 거의 동일한 뚜렷한 해열 효과를 보였다. GC–MS 분석을 통한 화학적 프로파일링은 그 생물활성 조성에 대한 더 깊은 통찰을 제공했습니다. 총 20종의 화합물이 확인되었으며, 여기에는 3,5-디하이드록시-6-메틸-2,3-디하이드로-4H-피란-4-원, 리놀산, γ-시토스테롤, 스쿠알렌, 비타민 E 등이 포함된다. 이 화합물들은 항산화, 항염증, 심장 보호 특성으로 잘 입증되어 있으며, 관찰된 약리학적 효과를 뒷받침합니다 ^7,8. 중요하게도, 독성 평가 결과는 세포독성 효과가 거의 없음을 보여주어 시험 용량에서의 안전성을 강조했습니다. 종합해 본 연구는 T. mantaly의 의학적 가치에 대한 식물화학적 및 약리학적 증거를 모두 제공함으로써 중요한 격차를 해소합니다. 이 연구 결과는 이 기술의 전통적인 응용을 뒷받침할 뿐만 아니라, 염증 및 관련 질환에 대한 새로운 치료법 개발을 위한 납 화합물의 자연 공급원으로서의 잠재력을 강조합니다. 본 연구에서 사용된 실험 모델은 주로 급성 염증 및 통각 반응을 반영하여 만성 치료 효능에 대한 직접적인 지표보다는 예비 약리학적 증거를 제공합니다.

프로토콜

모든 동물 실험은 실험동물 관리 및 사용에 관한 국제 지침에 따라 수행되었으며, OECD 권고사항을 준수하였습니다. 연구 프로토콜은 물탄에 위치한 바하우딘 자카리야 대학교의 동물 관리 및 이용 위원회(IACUC)에서 승인되었습니다. (승인 번호: 3 /UREC/2025). 동물 고통을 최소화하고 동물 수를 줄이기 위한 모든 노력이 이루어졌습니다.

1. T. mantaly 전메탄올 추출물(TMWM) 제제

1. T . mantaly의 신선한 줄기, 뿌리, 잎을 채취하고, 식물 재료의 진위를 확인한 뒤, 공인된 표본관에 바우처 표본을 기탁하세요.
   참고: 이 연구에 사용된 식물 재료는 2023년 11월 12일 멀탄 매티탈 로드의 펀자브 묘목장에서 채취되었습니다. 채집 장소의 지리 좌표는 북위 30.2236도, 동경 71.4755°입니다. 이 식물은 분류학자인 Prof. Dr. 자파르 울라 자파르, 바하우딘 자카리야 대학교 식물학 교수, 그리고 바우처 표본(www.theplantlist.org/tpl1.1/record/kew-2434420)이 바하우딘 자카리야 대학교 식물표본관에 기탁되었다. 식물은 적절한 환경 조건 하에 자연 서식지에서 채집되었으며, 채집 장소는 사진으로 기록되었습니다.
2. 식물 재료를 수돗물로 씻은 후 증류수로 오염 물질을 제거한 후, 25–30°C에서 7–10일간 그늘 건조하여 일정한 무게를 달성합니다.
3. 건조된 재료를 거친 가루로 갈고 분석 저울을 사용해 500g을 무게로 측정합니다. 가루를 깨끗한 유리 용기에 옮기고 메탄올 2.5L를 넣으세요.
4. 혼합물을 실온에서 72시간 동안 마세르하며, 6–8시간마다 간헐적으로 흔들게 하세요. Whatman No.1 필터 페이퍼를 걸러보세요.
5. 로터리 증발기를 사용해 39°C에서 저압 상태로 여과물을 농축한 후, 건조된 추출물을 실온에서 밀폐 용기에 보관하여 사용 후 보관합니다.
   주의: 메탄올은 독성이 있고 가연성입니다. 장갑과 보호 안경을 착용한 채 연기구 내부에서 취급을 수행하세요. 용매 폐기물은 기관의 화학 안전 지침에 따라 처리됩니다.
   참고: 건조된 추출물은 추가 분석을 위해 밀폐된 용기에 실온에서 몇 주간 보관할 수 있습니다.

2. 총 페놀 함량 추정 (Folin–Ciocalteu 방법)

1. 갈릭산 스톡 용액(100 μg/mL)을 100 mL 메탄올에 녹여 100 μg/mL 간 연속 희석액을 준비합니다.
2. 10 mg 추출물을 10 mL 메탄올에 녹여 1 mg/mL 용액을 얻습니다. 각 표준 또는 샘플 각각 0.5 mL를 시험관에 옮깁니다.
3. 2.5mL Folin–Ciocalteu 시약을 물에 1:1로 희석한 후, 7.5% 탄산나트륨 용액 2.0mL를 추가합니다. 혼합하여 25± 2°C에서 30분간 배양합니다.
4. 765nm 시약에서 흡광도를 시약 블랭크에 대비하여 측정하고, 추출물당 갈릭산 환산량으로 총 페놀 함량을 계산합니다.

3. 총 플라보노이드 함량 추정 (염화알루미늄법)

1. 루틴을 메탄올에 용해시켜 루틴 스톡 용액(1000 μg/mL)을 준비한 후, 10–80 μg/mL 범위의 연속 희석액을 준비합니다.
2. 표준 또는 추출액 0.5mL를 시험관에 옮기고, 메탄올 1.5mL, 10% 염화알루미늄(AlCl₃) 용액 0.1mL, 1M 아세테이트 칼륨 용액 0.1mL, 증류수 2.8mL를 추가합니다.
3. 실온에서 30분간 배양하고 415nm 거리에서 흡수도를 측정하세요. 추출물⁹ 당 루틴 당량으로 결과를 표현하세요.

4. 가스 크로마토그래피-질량분석법(GC–MS) 분석

1. 10 mg 추출물을 1 mL HPLC 등급 메탄올에 녹인 후 0.22 μm 주사기 필터를 거쳐 GC 바이알에 담습니다.
2. Agilent 7890B GC와 HP-5MS 모세관 컬럼(30m × 0.25mm × 0.25μm)이 장착된 5977A MS를 사용하여 분석을 수행합니다. 분당 1.0 mL, 인젝터 온도는 250 °C로 헬륨을 운반 가스로 사용하세요.
3. 이온 소스 온도는 230°C, 쿼드러폴 온도는 150°C로 유지하세요. 오븐을 60°C(2분 대기)에서 180°C, 분당 10°C, 그리고 280°C, 분당 5°C로 프로그래밍하고 최종 대기 시간은 10분입니다.
4. 필터링된 추출물을 1μL을 분할 모드(10:1)로 주입하고 40–600 m/z 범위의 크로마토그램을 기록합니다. 샘플 주입 전에 용매 블랭크를 돌리세요.
5. NIST 질량 스펙트럼 라이브러리와 스펙트럼을 비교하여 화합물을 식별하고, 보존 시간과 피크 면적 정규화를 사용하여 동일성을 확인합니다.

5. 항염증 작용(카라기난 유발 발부종)

1. 체중 180–220g의 건강한 백색증 위스타 쥐를 사용해 7일간 적응하세요. 실험 전에 하룻밤 동안 단식한 동물들을 자유롭게 물에 접근할 수 있게 하세요.
2. 동물을 무작위로 다섯 그룹으로 나누어 나누어 주세요(한 그룹당 n = 5개). 조종군에 생식식염수 투여; 치료군에 경구로 100, 200, 300 mg/kg을 투여; 그리고 표준 그룹에는 디클로페낙 나트륨(40 mg/kg, 피하 투여)을 투여합니다.
3. 1시간 후, 신선하게 준비한 1% 카라기난 0.1mL를 오른쪽 뒷발의 족저하부에 주입합니다.
4. 디지털 버니어 캘리퍼스를 사용해 0, 1, 2, 3, 4h에서 발 두께를 측정하고 기준선 대비 증가량을 계산하세요.
5. 대조군과 비교하여 부종 억제 비율을 결정합니다¹⁰.
   주의: 카라기난 가루는 자극을 일으킬 수 있습니다. 흡입과 피부 접촉을 피하고, 기관의 생물안전 절차에 따라 생물학적 폐기물을 처리하십시오.

6. 진통제 활동 (꼬리 침수 테스트)

1. 12시간 빛과 어둠 주기 하에 음식과 물을 자유롭게 섭취하는 적응된 알비노 위스타 쥐를 사용하세요.
2. 동물을 다섯 그룹으로 나누어 (n = 5). 대조군에게는 증류수를 투여하고, 치료군에는 100, 200, 300 mg/kg의 경구 추출물을 투여하며, 표준 그룹에는 파라세타몰(20 mg/kg)을 투여합니다.
3. 수조는 55± 1 °C로 유지하세요. 말위 꼬리의 1–2cm 깊이를 잠기고 15초 컷오프 시간을 사용해 기초 철수 잠복 시간을 기록합니다.
4. 치료 후 30분, 60분, 90분, 120분마다 같은 부분의 꼬리를 물에 담가도록 반복하세요.
5. 지연 증가율을 계산하고 결과를 SD± 평균 값으로 표현하세요.

7. 발열 활성

1. 적응한 쥐를 사용해 윤활된 디지털 체온계로 정상 직장 체온을 기록하세요.
2. 증류수에 20% 양조용 효모 현탁액을 준비하고 10 mL/kg로 피하 주입하여 발열증을 유도합니다.
3. 18시간 후에는 직장 온도를 다시 측정하고, 최소 0.5 °C 상승이 보이지 않는 동물은 제외합니다.
4. 열병 쥐를 무작위로 다섯 그룹으로 나누어 (한 그룹당 n = 5개). 대조군에는 자연 식염수를 투여하고, 치료군에는 100, 200, 300 mg/kg의 식물 추출물을 경구로 투여하며, 표준 그룹에는 파라세타몰(150 mg/kg)을 투여합니다.
5. 치료 후 0, 1, 2, 3시간에 직장 체온을 측정하고 기준선¹¹과 비교해 감소 현상을 계산합니다.
   주의: 양조효모 현탁액은 생물학적 재료이므로 표준 생물안전 수칙을 준수하여 취급해야 합니다. 사용하지 않는 현탁 및 오염된 물질은 생물학적 폐기물로 폐기하세요.
   참고: 효모 주사 후에는 동물을 우리로 돌려보내고 온도 측정 전까지 표준 조건에서 유지할 수 있습니다.

8. 급성 독성 연구

1. 경제협력개발기구(OECD) 지침 423호에 따라 건강한 알비노 위스타 쥐(성별, 체중 180–220g)를 사용하여 연구를 수행하십시오.
2. 동물을 하룻밤 동안 단속시켜 투여 후 무작위로 그룹으로 나눕니다(n=5마리씩).
3. 치료 동물에게는 5g/kg의 추출물을 단일 경구 투여하고, 대조군에게는 증류수(1mL/kg)를 투여합니다.
4. 투여 후 처음 4시간 동안은 동물을 연속적으로 관찰하고, 첫 24시간 동안은 주기적으로, 그리고 14일간 매일 관찰하세요.
   참고: 관찰 기준에는 피부 및 털 상태, 눈과 점막, 호흡 패턴, 침 분비, 떨림, 경련, 운동 활동, 일반적인 행동 반응 변화가 포함됩니다.
5. 0일차, 7일차, 14일차에 독성, 사망률, 체중의 임상 징후를 기록하세요.
6. 생존율과 관찰된 행동 또는 신체적 변화를 바탕으로 안전성을 평가한다¹².
   참고: 행동 점수 측정에는 자세, 보행, 활동 수준, 그루밍 행동, 외부 자극에 대한 반응, 무기력이나 과잉활동 징후의 모니터링이 포함됩니다.

9. 통계 분석

1. 모든 실험 데이터를 수집하여 결과를 평균 ± 표준편차로 표현하고, 그룹당 n = 5마리의 동물을 포함합니다.
2. 데이터를 GraphPad Prism 소프트웨어에 열 형식으로 입력하세요.
3. 비교 분석을 적용하기 전에 Shapiro–Wilk 검정을 사용하여 데이터 정규성을 평가하세요.
4. GraphPad 프리sm 소프트웨어를 사용하여 다음을 선택하여 통계 분석을 수행하세요: Tukey 다중 비교→ 일원 ANOVA 분석→ 분석하기.
5. 분산의 일방향 분석을 수행한 후 Tukey의 사후 다중 비교 검정을 사용하여 그룹 간 통계적 유의성을 판단합니다.
6. p < 0.05에서 통계적으로 유의미한 차이를 고려하라.

결과

본 연구에서 기술된 실험적 접근법은 T . mantaly의 메탄올 추출물의 식물화학적 조성과 약리학적 활성을 평가할 수 있는 재현 가능한 시험관 및 생체 내 데이터를 생성하였습니다. 모든 실험 측정은 복제 방식으로 수행되었으며, 결과는 평균 ± 표준편차(SD)로 제시됩니다. 그룹 간 통계적 유의성은 일방향 ANOVA와 Tukey의 사후 검정을 통해 산출되었으며, p < 0.05는 유의한 것으로 간주되었습니다.

Folin–Ciocalteu 및 염화알루미늄 분석법을 이용한 총 페놀 및 플라보노이드 함량 추정은 반복 측정 전반에 걸쳐 일관된 흡광도를 얻었으며, 갈산과 루틴 표준에 대해 적절한 선형성을 보인 보정 곡선이 나타났습니다(그림 1 및 그림 2). 추출물의 총 페놀 함량은 추출물당 1.084 ± 0.445 mg 갈릭산 환...

토론

본 연구에서는 식물화학적 특성화와 확립된 생체 내 약리학적 모델을 결합하여 T. mantaly의 메탄올 추출물의 항염증, 진통, 해열 잠재력을 평가하였습니다. 사용되는 실험 모델은 천연 제품 연구에 널리 사용되며, 생물학적 활성의 예비 평가를 위한 실용적인 틀을 제공합니다.

화합물의 재현 가능한 보존 시간은 추출물의 화학적 복잡성을 뒷받침하며, 추가 목표 연구의 기초를 제공합니다. 이 성분들은 식물 추출물 내 항염증 및 항산화 작용과 자주 연관되어 있습니다. 예를 들어, 리놀레산과 같은 지방산은 염증 매개체 방출과 산화 경로를 조절하는 것으로 알려져 있으며, γ-시토스테롤과 같은 식물스테롤은 프로스타글란딘 합성과 염증 신호 전달을 억제하는 것으로 보고되었습니다. 비타민 E를 포함한 토코페롤은 항산화 및 세포막 안정화 효과를 제공하여 염증 반응 시 조직을 보호할 수 있습니다 13,14,15.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
알비노 위스타 쥐	기관 동물 보관소	해당 없음	실험 동물
염화알루미늄	시그마-올드리치	237051	플라보노이드 분석법
브루어' S 효모	시그마-올드리치	YSC2	발열증 유도
카라기난	시그마-올드리치	C1013	발 부종 유도
원심분리기	에펜도르프	5810R	샘플 처리
디클로페낙 나트륨	시그마-올드리치	D6899	항염증 기준
디지털 직장 체온계	옴론	MC-246	직장 온도 측정
디지털 버니어 캘리퍼	미투토요	500-196-30	발바닥 두께 측정
증류수	사내	해당 없음	용매
폴린&대쉬; Ciocalteu 시약	시그마-올드리치	F9252	페놀 분석법
갈릭산	시그마-올드리치	G7384	페놀 표준
GC–MS 시스템	애질런트 테크놀로지스	7890B– 5977A	식물화학적 프로파일링
그래프패드 프리즘	그래프패드 소프트웨어	버전 8.0	통계 분석 소프트웨어
메탄올 (HPLC 등급)	머크	106009	추출 용매
구강 관측 바늘	인스테크	FTP-20-38	경구 투여
파라세타몰	시그마-올드리치	P0300000	진통제 및 해열 표준
아세트산 칼륨	머크	104820	플라보노이드 분석법
회전 증발기	Bü 치	R-200	추출물 농도
루틴	시그마-올드리치	R5143	플라보노이드 표준
탄산나트륨	머크	106392	페놀 분석법
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