피부 재생 연구를 위한 효율적인 쥐 조직 확장 모델 개발

요약

이 연구는 쥐에서 연속적인 조직 확장 모델을 확립하는 실용적이고 효율적인 프로토콜을 제시하여, 피부 재생의 기전 연구와 기술 발전을 촉진합니다.

초록

피부 재생은 다양한 표면 상처의 치유에 필수적이며, 기계적 자극을 통해 촉진될 수 있습니다. 조직 확장은 통제된 기계적 신장을 통해 피부 재생을 가속화하는 널리 사용되는 전략입니다; 그러나 기계적 부하와 피부의 재생 능력 간의 불일치로 인해 임상적 효능이 제한되는 경우가 많습니다. 이 한계를 해결하기 위해 조직 확장에 대한 표준화된 동물 모델 개발이 시급히 필요합니다. 이 연구에서 우리는 스프래그-도울리 쥐에서 조직 확장 모델을 확립하였습니다. 10 mL 조직 확장기를 배측에 이식한 후, 수술 직후 5 mL의 생리식염수를 주입하였습니다. 2주간의 회복 기간 후, 동물들은 주 2회 식염수 주사(한 세션당 10mL)를 받았습니다. 팽창 운동학은 빠른 피부 성장 후 점진적인 감속 경향을 보였다. 후기 단계에서는 피부 괴사, 조직 붕괴, 확장기 노출과 같은 심각한 합병증이 관찰되었습니다. 이 연구는 인간 조직 확장의 생리적·병리학적 과정을 유사하게 모방하는 재현 가능한 전임상 프레임워크를 확립하여, 재생 메커니즘을 조사하고 임상 프로토콜을 최적화할 기초 모델을 제공합니다.

서론

피부는 신체의 첫 번째 방어선 역할을 하여 기계적 보호와 수분 손실을 방지하는 역할을 하며, 온도 조절, 외부 자극 반응, 면역 조절에 중요한 역할을 합니다^. 피부 상처는 임상 실무에서 흔히 발생하며, 외상, 미생물 감염, 화학적 손상, 외과적 절제로 인한^{경우가 많습니다.} 작은 상처는 정상적인 외관으로 치유될 수 있지만, 큰 부상은 일반적으로 심각한 섬유성 흉터를 남기며 조직 기능을 저해하고 심지어 생명을 위협할 수^{있습니다.} 자가전층 피부 이식술은 큰 상처 관리와 흉터 방지에 있어 금본위로 널리 인정받고^{있습니다.} 하지만 충분한 수립 가능한 피부를 확보하는 것은 여전히 중요한 임상적 과제입니다. 그 결과, 혁신적인 피부 재생 기술 개발이 재생 의학과^생체재료 분야에서 중심적인 초점으로 부상했습니다.

노이만이 1957년 청이변 기형을 재건하기 위해 이심리 유양돌기 부위에 폴리에틸렌 풍선을 이식함으로써 조직 확장 원리를 처음 도입한 이^{후, 이} 기술은 크게 발전해 왔습니다. 오늘날 재건 수술에서 가장 널리 채택된 방법 중 하나이며, 광범위한 피부 결손을 치료하는 데 중요한 접근법으로 남아 있습니다. 구체적으로, 조직 확장은 인접한 피부를 모집하고 재생을 자극하여 추가적인 자가 조직을 생성합니다^. 기계적 자극에 의해 형성된 새로 형성된 피부는 외관과 구조 면에서 원래의 피부와 매우 유사하여 임상 적용에 이상적입니다⁸. 그러나 후기 단계에서 하중력의 크기와 피부 성장 속도 간의 불일치로 인해, 채취된 피부의 양은 대규모 상처 덮개를 위한 데 부족하다⁹. 더불어, 조직 확장 기술의 발전은 부최적화된 확장 효과, 심각한 합병증, 불완전한 정량적 평가 지표, 그리고 분자 메커니즘이 부실하게 규명되어 있어 저해받고 있습니다¹⁰. 생체 내 조절 네트워크의 복잡성을 고려할 때, 조직 확장의 적절한 동물 모델은 기계적 자극에 대한 피부 조직의 생리적·병리학적 반응을 충실히 재현하는 데 필수적입니다.

현재 생체 내 연구에서는 쥐(쥐 및 쥐)와 돼지 모델이 주된 선택지입니다^. 마우스 등쪽 또는 두피 확장 모델은 조작이 간편해 널리 사용됩니다; 그러나 피부가 너무 얇아 장기간 또는 지속적인 팽창을 견디지 못한다¹². 쥐 등쪽 확장 모델은 광범위한 피하 공간 덕분에 연속 확장에 적합하지만, 확장을 종료하는 확정적인 프로토콜이 없어 임상적 적용이 제한됩니다^13,14. 돼지 피부는 인간 피부와 가장 높은 상동성을 공유하지만, 탄력이 낮아 기계적 신장 반응이 지연되며, 과정 중 깊은 진정이 필요해 실험적 조작이 훨씬 더 어렵^습니다. 따라서 임상 과정을 모방하는 적절한 연속 확장 모델을 개발하는 것은 여전히 과학적 도전 과제로 남아 있습니다.

이 연구의 목적은 쥐의 연속적인 피부 확장에 대한 모델을 개발하는 것이었습니다. 간단히 10mL 실리콘 확장제가 Sprague-Dawley(SD) 쥐의 등쪽 부위에 삽입되었고, 수술 직후 5mL의 식염수를 주입했습니다. 2주간의 회복 기간 후, 10 mL의 식리식염수를 주 2회 투여하여 누적 부피가 155 mL에 도달했을 때 피부 생성이 유의미하게 감소하여 재생 능력의 고갈을 시사하였다. 재생 기능 저하는 피부 재생 능력의 치명적 저하를 의미하며, 세포 수준에서 증식 능력 감소와 세포외기질 붕괴가 특징입니다^. 거시적으로 보면, 이는 피부 질의 현저한 악화로 나타나며, 피부 얇아짐, 허혈, 그리고 줄무늬 팽창으로 나타나며, 괴사와 조직 분해로 진행될 가능성이 있습니다^. 기술적 단순성 외에도, 이 전임상 모델은 연속적인 피부 확장을 성공적으로 재현하여 연구자들이 특정 연구 목표에 맞춘 다양한 확장 단계를 조사할 수 있게 합니다. 이 모델링 방법은 유전자 변형 쥐에도 적용할 수 있어 주요 유전자 기능을 밝히고 그 기전을 밝혀내는 데 도움을 줍니다. 더불어, 등쪽 피부의 넓은 표면적은 자가 통제 연구 설계를 용이하게 하여 동일한 동물 내에서 실험적 치료와 대조군 치료를 모두 적용할 수 있게 합니다¹⁸. 이 모델은 조직 확장에 관여하는 특정 메커니즘을 조사하는 데 유용한 도구를 제공하며, 현재의 기술적 한계를 극복하는 데 기여합니다.

프로토콜

모든 동물 시술은 상하이 제9인민병원 윤리위원회(번호: SH9H-2025-A1673-1)에서 국립보건원(NIH) 실험동물 관리 및 사용 가이드에 따라 진행되었습니다.

1. 준비

1. 연구 전 7일 동안 모든 SD 쥐를 적응시키세요. SD 쥐를 12시간 빛, 12시간 어둠 주기가 있는 동물 시설에 두세요. 실험 내내 표준 밀/콩 기반 식단과 자유 롭게 물을 제공하세요.
2. 실험용으로 10mL 반원 조직 확장기를 설계하는데(그림 1A), 팽창성 풍선, 주입 포트, 결합 카테터로 구성되어 있습니다. 확장기를 전자빔 조사(25 kGy)로 멸균하세요. 수술 전에 각 확장기의 안전성을 반드시 확인하세요. 주입구를 통해 10mL의 식염수를 주입한 후 결합 카테터의 개통과 팽창을 관찰하여 누수가 없음을 확인하세요.
   참고: 미리 주입한 생리식염수를 빼세요.

2. 수술 전 및 수술 중 동물 관리

1. 수컷 SD 쥐, 6-8주 생, 체중 240-260g을 입양합니다.
2. SD 쥐를 이소플루란 흡입으로 마취합니다. 쥐를 유도실에 넣고 5% 이소플루란을 3리터/분의 유량으로 마취를 유도합니다. 수술 중에는 2% 이소플루란을 1.5 L/min 유량으로 마취를 유지하세요.
3. 마취된 SD 쥐를 수술 중 따뜻함을 유지하기 위해 면사 패드 위에 올려놓고, 마취 후 회복 후 약 20분간 가열된 패드(약 28 °C)에 올려 저체온증을 예방하세요.
4. 발가락 꼬집기 철회 반사를 사용해 마취의 깊이를 평가하세요.
   참고: 마취된 SD 쥐의 호흡 수와 패턴, 체온, 발가락 피부 색깔을 모니터링하세요.

3. 조직 확장기 이식

1. SD 쥐의 등쪽 피부를 이발깎기로 면도하세요. 피부색, 질감, 병변 유무를 평가하여 확장 적합성을 판단하세요.
2. 등 중앙에 가로 점선을 그려 절개 위치를 표시하세요. 면도한 부위를 75% 알코올로 소독하고 멸균 개구부 드레이프로 덮으세요.
3. 1mL 주사기와 직경 30G(0.31 mm) 바늘을 사용해 표시된 선을 따라 자연식염수를 피하에 투여한 후, 메스를 이용해 수평 절개를 수행합니다. 절개 부위 위아래 등쪽 근막을 따라 피하 조직을 광범위하게 해부합니다. 모기 겸자를 이용해 팽창 풍선과 주입구를 수용할 수 있을 만큼 큰 주머니를 만드세요. 확장 풍선의 하부를 절개 부위에서 3-5cm 떨어진 곳에 위치시키고, 꼭대기는 피부층을 향하게 하고 베이스플레이트는 근육 위에 놓이게 합니다. 또한, 결합 카테터와 주입 포트 접합부 양쪽 근막을 봉합하여 포트를 안정화하세요. 풍선과 주입 포트의 위치를 조정하여 연결 튜브에 날카로운 굴곡이나 꼬임이 없도록 하세요(그림 1B).
   참고: 생리식염수 주사는 피부 절개와 해부학적 평면 식별을 용이하게 합니다. 주입 포트를 부드러운 면이 피부층을 향하도록 방향을 맞추어 후속 용액 주입을 가능하게 하세요.
4. 절개 부위는 중단된 4-0 봉합사로 봉합합니다. 그 후 25G(0.5 mm) 두피 바늘로 5mL 식염수를 주입하세요.
   참고: 봉합 바늘 끝으로 확장기를 찌르지 않도록 절개 부위를 조심스럽게 봉합하세요. 두피 바늘을 주입구에 수직으로 삽입한 후 수직으로 빼세요.
5. SD 쥐가 마취에서 회복할 시간을 주고, 개별 우리에 넣으세요.

4. 연속 팽창 과정

1. 확장기를 가진 SD 쥐가 2주간 회복할 수 있도록 하여 절개 부위의 완전한 치유를 보장합니다. 피부 변화를 시각화하기 쉽게 하기 위해 확장 부위에 2.5 × 2.5cm 점선 박스를 표시하세요(그림 2A).
2. 2.2단계부터 2.4단계까지 설명된 방법으로 SD 쥐를 마취합니다. 관찰을 돕기 위해 확장 구역을 깎아내세요. 피부 확장이 감염, 부활증 또는 괴사로 복잡해질 경우 즉시 확장 수술을 중단하세요.
   참고: 빠른 모발 성장에 맞춰 최소 주 1회 이상 확장된 부위를 면도하세요.
3. 주입구 주변 부위를 면도하고 75% 알코올로 소독하세요. 포트를 고정한 후 25G 두피 바늘로 천천히 10mL 생리식염수를 주입하세요. 무균 거즈로 주입 지점을 2분간 눌러 지혈을 확인하세요.
4. SD 쥐가 마취에서 회복할 시간을 주고, 20분간 가열된 패드 위에 올려놓은 후 개별 우리로 옮기세요.
5. 주 2회 생리식염수 주사하세요. 추적 관찰 중 확장기 누출, 연결 관의 굴절, 확장기 노출, 피부 오혈증, 괴사, 감염, 붕괴 등 확장 관련 합병증을 모니터링합니다(그림 2E). 식염수 주입 시 저항이 발생할 경우 카테터 꼬임 가능성을 조사합니다. 확장 풍선이 부드러워지면 확장기 누출이 의심됩니다. 국소적인 오진증은 관류 기능 저하의 신호로, 피부 어두운 색은 괴사로 식별하세요. 국소적으로 뚜렷한 발적, 부기, 국소 피부 온도 상승을 관찰하여 감염 의심. 치유되지 않는 상처를 피부 손상으로 분류하고 확장기 노출 가능성을 확인하세요.
   참고: 각 주사 전후로 팽창한 피부를 점검하여 부작용을 조기에 발견할 수 있도록 하세요. 확장 장치 누출, 피부 손상 또는 괴사, 확장기 노출 등 심각한 합병증이 발생하면 즉시 확장 수술을 중단하여 생존 가능한 피부를 최대한 살릴 수 있습니다.

5. 확장 면적 측정 및 재생 피부 채취

1. 고정밀 3D 스캐너로 팽창 면적을 측정하세요. 확장기 위 피부를 스캔함으로써 스캔된 영역의 표면적이 자동으로 계산됩니다(그림 2B).
   참고: 각 주사 전에 마취된 SD 쥐에 대해 스캔을 실시하세요.
2. 디지털 카메라로 팽창한 피부를 촬영하세요; 점선 상자로 표시된 면적을 측정하고 무게를 재고, 표면적(그림 2C)과 질량(그림 2D)의 변화를 기록합니다.
3. 실험 종료 시 과도한 이산화탄소에 노출시켜 SD 쥐를 안락사시키세요.
   참고: 본 연구에서는 임상 실무에서 전체 확장 과정을 재현하기 위해 종말 부피를 총 주입량 155mL로 정의하십시오.
4. 사후 부위 시, 팽창한 피부와 인접한 정상 피부 모두에 샘플 부위를 표시하세요. 확장기에서 전체 부피의 절반을 흡인한 후, 주입구 위의 피부를 가위로 수평으로 절개합니다. 확장기와 팽창된 피부 사이의 평면을 모기 겸자를 사용해 광범위하게 해부하여 확장기를 완전하고 온전하게 제거할 수 있도록 하세요. 가위로 피부 샘플을 절제하고 조직을 반으로 나누세요. 4% 파라포름알데히드 용액에 고정하고 조직학적 염색 과정을 거치세요.
   참고: 확장기 제거 전에 샘플링 관심 영역을 구분하여 피부 후퇴로 인한 오식별을 방지하고, 국소 치료 부위를 정확히 식별할 수 있도록 합니다(그림 3A).
5. 수집된 동물 사체는 노란색 의료 폐기물 봉투에 따로 보관하세요. 사용한 확장기, 주사기, 거즈는 노란색 의료 폐기물 봉투에 폐기하세요. 칼날, 바늘, 기타 날카로운 도구를 지정된 날카로운 용기에 버리세요.
   참고: 본 연구의 모든 폐기물 처리는 상하이 제9인민병원 실험동물센터의 관리 규정을 준수합니다.

6. 피부 조직학적 착색

1. 피부 샘플을 파라핀에 박아 5μm 단위로 잘라 접착 슬라이드에 부착합니다.
2. 피부 두께를 평가하기 위해 헤마톡실린과 에오신 염색(HE 염색)을 사용하고(그림 3B,C), 콜라겐 침착을 평가하기 위해 마손 삼색 염색(그림 3D,E)을 사용하세요. 전체 슬라이드 스캐너로 섹션을 스캔하고 ImageJ 버전 1.54 소프트웨어로 분석하세요.
3. 혈관 형성을 평가하기 위해 CD31 면역형광 염색을 사용하세요. 1차 항체를 도포하고 4°C에서 하룻밤 인큐베이팅한 후, FITC 결합된 2차 항체를 사용한 후 형광 현미경으로 검사합니다(그림 3F, G).
4. GraphPad Prism 버전 10.0 소프트웨어를 사용해 정량적 데이터를 분석하고, 결과를 평균 표준편차(SD)± 제시합니다. Student의 t-검정을 사용하여 통계적 유의성을 *p < 0.05로 정의하는 통계적 비교를 수행합니다.

결과

본 연구에서는 연속 조직 확장 모델에 대한 표준 프로토콜을 확립하였습니다. 확장기의 안전성이 확인된 후(그림 1A), SD 쥐의 등쪽 부위에 피하 수술로 이식되었습니다. 팽창하는 표면은 피부 쪽으로 위치해 있었다. 확장기 변위를 방지하기 위해 카테터와 주입 포트 사이의 연결 지점이 근막에 고정되었습니다(그림 1B). 주 2회 식염수 주사 후에는 점진적인 피부 확장 과정이 기록되었습니다(그림 2A). 주사 용량이 증가함에 따라 확장된 피부는 점선 상자 내 영역이 커지고 피부가 점진적으로 얇아지는 것으로 입증되었습니다. 모든 SD 쥐에서 확장된 면적과 표시된 표면적 변화 모두 피부 재생이 2상 패턴을 보였으며, 초기 급속 단계 이후 이후 느려지는 과정을 확인했습니다(그림 2B,C). 표시된 ...

토론

조직 확장은 질감과 색상 면에서 건강한 피부와 매우 유사한 추가 피부를 생성하는 널리 사용되는 기법으로 부상했습니다¹⁹. 흉터 복원, 유방 재건, 체표면종양 절제 후 재건 등 다양한 임상 조건에 적용되어 왔습니다²⁰. 그러나 장기적인 조직 확장은 여전히 중요한 과제로 남아 있는데, 이는 주로 피부^{재생 능력의} 고갈로 때문이다. 적합한 동물 모델의 부재는 기저 메커니즘 탐구를 방해했습니다. 따라서 우리는 임상적 장기 조직 확장과 매우 유사하고 높은 안정성과 재현성을 입증하는 연속 조직 확장 모델을 확립하였습니다.

C57BL/6 마우스와 SD 쥐는 조직 확장 연구에서 흔히 사용되는 동물 모델입니다. 쥐와 쥐의 피부 특성이^{유사하기 때}문에, 쥐는 피부 조직이 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
CD31 항체	앱캠 상하이 트레이딩 주식회사	ab182981	IHC 염색
전자빔 조사 기기	통웨이신다 테크놀로지(장쑤) 유니버릭 주식회사. Ltd	고에너지 전자 가속기 (10 MeV, 24 kW)	불임 수술
FITC 접합 2차 항체	프로틴테크 그룹 주식회사	SA0003-2	IHC 염색
Graghpad Prism 소프트웨어	그래프패드 소프트웨어	버전 10.0	통계 분석
헤마톡실린 및 이오신 염색 키트	비요타임 바이오텍 주식회사	C0105S	조직학적 염색
고정밀 3D 스캐너	샤이닝 3D	EinScan Pro 2X V2	면적 측정 및 nbsp;
이미지 J 소프트웨어	국립보건원(NIH)	버전 1.54	통계 분석
마송의 트리크롬 스테인 키트	비요타임 바이오텍 주식회사	C0189S	조직학적 염색
조직 확장기	상하이 위너 성형외과 제품 주식회사.	해당 없음	특수 커스터마이징