차세대 염기서열 분석 클론성 분석: 다발성 골수종의 미세 잔존 질환 모니터링을 위한 임상적 검증

요약

본 연구에서는 다발성 골수종(MM)을 포함한 림프구성 악성 종양의 미세 잔존 질환(MRD) 검출을 위한 새로운 NGS 기반 BCR/TCR 클론성 분석법(OriMIRACLE LTM)을 평가하였습니다. 세포주와 임상 도말 표본을 사용하여 분석한 결과, 다음과 같은 수치를 나타냈습니다. >90%의 검출률과 유세포 분석과 81.36%의 일치도를 보였습니다. 이 분석법은 높은 민감도를 제공하며, 재발을 예측하고 치료 결정을 지원합니다.

초록

미세 잔류 질환(MRD) 검출은 림프구 악성 종양의 관리에 매우 중요합니다. 본 연구에서는 MRD 검출을 위한 새로운 차세대 염기서열 분석(NGS) 기반 B-세포 수용체(BCR) 및 T-세포 수용체(TCR) 클론성 분석법인 OriMIRACLE LTM을 소개합니다. 우리는 다발성 골수종(MM) 환자의 잔존 도말 표본을 포함한 세포주와 임상 시료를 사용하여 이 분석법을 검증했습니다. BCR/TCR 클론성 분석은 림프구 악성 종양에서 90% 이상의 양성 검출률을 나타냈습니다. MM 환자를 대상으로 한 검증 연구에서는 종양 세포 검출에 있어 다색 유세포 분석(MFC)과 임상 반응 평가 사이에 81.36%(48/59)의 일치율을 보였습니다. 특히, NGS와 MFC 모두에서 MRD 양성으로 판정된 MM 환자의 61.11%(11/18)가 질환 진행 또는 재발을 경험했습니다. NGS로만 MRD가 검출된 환자들은 임상적 완전 관해율이 더 낮게 나타났으며, 초기에는 반응을 보였던 일부 MM 환자들은 치료 중단 후 재발했습니다. 이러한 결과는 이 NGS 기반 분석법이 MM 환자 유래 잔존 도말 시료에서도 림프구 악성 종양의 MRD를 매우 민감하고 특이적으로 검출할 수 있음을 시사합니다. 또한, 이는 MFC 대비 장점을 보여주며 MRD 추적에 가치가 있음을 입증합니다. 결론적으로, 현재의 증거는 NGS가 MFC보다 더 깊은 위험 층화를 가능하게 하므로, 특히 MFC⁻/NGS⁺ 환자에게 있어 MFC를 보완하는 도구로 활용될 수 있음을 뒷받침합니다. 다만, 최적의 개입 임계값은 향후 전향적 연구를 통해 결정되어야 합니다.

서론

다발성 골수종(MM)은 골수 내에서 비정상적인 클론성 형질세포가 증식하는 것을 특징으로 하는 혈액암입니다¹. 중국에서는 2022년에 약 22,450건의 새로운 MM 진단 사례와 17,360건의 관련 사망 사례가 발생했습니다². 지난 10년 동안 MM 치료법의 상당한 발전으로 환자의 중앙 생존 기간이 실질적으로 연장되었습니다. 하지만 대다수의 환자는 결국 재발을 경험하게 됩니다^3,4. 이러한 급격한 증가는 정밀한 관해 모니터링, 조기 재발 예측 및 적시의 치료적 개입에 대한 절실한 필요성을 강조합니다.

임상적 증거를 통해 혈액암에서 미세 잔존 질환(MRD) 상태의 예후적 중요성이 확고히 입증되었습니다^5,6,7. 이러한 중요성을 인식하여, 국제 골수종 작업그룹(IMWG)은 2016년에 MRD 평가를 반응 평가 기준에 통합하였습니다⁸. 현재 골수 MRD 평가 방법에는 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오타이드 중합효소 연쇄 반응(ASO-PCR), 디지털 PCR(dPCR), 다중 파라미터 유세포 분석(MFC) 및 차세대 염기서열 분석(NGS) 분석법이 포함됩니다⁸. ASO-PCR은 민감한 검출이 가능하지만, 환자 특이적 프라이머가 필요하여 시간이 많이 소요되고 표준화가 어렵습니다^9,10. 마찬가지로, dPCR은 대립유전자 특이적 설계로 인해 제약이 있습니다^10,11. MFC는 신속한 세포 수준의 정보를 제공함으로써 MRD 검출에 중요한 역할을 해왔으나¹², 표준화와 재현성 측면에서 어려움이 있습니다.

NGS는 환자 맞춤형 프라이머의 필요성을 없애주는 재현성 높고 매우 민감한 접근 방식을 제공합니다. 이를 통해 혈액암에서 고유한 면역글로불린 재배열을 신뢰성 있게 식별하고 정량화할 수 있습니다¹³. 미국 식품의약국(FDA)은 급성 림프구성 백혈병(ALL), 다발성 골수종(MM) 및 만성 림프구성 백혈병(CLL) 환자의 MRD 검사를 위해 Adaptive Biotechnologies의 ClonoSEQ를 승인했습니다^14,15,16. 현재 수많은 국제 임상 가이드라인에서 NGS를 MRD 모니터링을 위한 권장 방법으로 포함하고 있습니다. 중국의 다발성 골수종 진단 및 치료 가이드라인(2020년 개정판) 또한 차세대 유세포 분석(NGF) 및 NGS와 같은 방법을 이용한 MM 환자의 MRD 평가를 지지하고 있습니다¹⁷.

저희가 알기로는, 비용과 시간의 제약으로 인해 실제 임상 현장에서 림프구성 혈액암의 MRD 검출을 위해 NGS 기술이 우선적으로 사용되지는 않습니다. MFC 결과가 음성일 경우, MRD를 검출하기 위해 추가적인 골수 흡인이 필요한 경우가 많습니다. 이러한 추가 시술은 환자에게 상당한 신체적, 심리적 부담을 줄 수 있으며, 이는 잠재적으로 광범위한 임상 적용을 제한하는 요인이 될 수 있습니다.

본 연구에서는 NGS 기반의 B 세포 또는 T 세포 수용체(BCR/TCR) 클론성 분석법(OriMIRACLE LTM)을 개발하고 특성을 분석하며 그 성능을 검증하였습니다. 본 연구의 주요 목적은 잔여 도말 표본을 사용할 때에도 림프종의 MRD를 추적하기 위한 이 분석법의 민감도와 특이도를 검증하는 것이었습니다. 이 방법은 통상적인 진단 후 남은 잔여 골수 도말 표본을 직접 활용할 수 있어, 도말 표본이 가진 본질적인 한계를 극복할 수 있습니다. 도말 표본 내의 DNA가 고정, 염색 및 장기 보관으로 인해 단편화되었거나 극소량만 존재하거나 일부 분해된 경우라도, 최적화된 핵산 추출 및 멀티플렉스 PCR 증폭을 통해 신뢰할 수 있는 면역 레퍼토리 프로필을 얻을 수 있습니다. 이를 통해 10⁻⁵에서 10⁻⁶의 민감도로 고감도 클론 추적이 가능하며, 이는 기존의 유세포 분석 기반 MRD의 하한 검출 한계를 뛰어넘는 수준입니다. 본 연구는 NGS 기반의 BCR/TCR 클론성 평가가 MM 환자의 MRD 추적을 강화하고 치료 결정을 내리는 데 기여함으로써, 임상 현장의 현재 한계점을 해결할 수 있는 가능성을 제시합니다.

프로토콜

본 연구는 헬싱키 선언의 원칙에 따라 수행되었으며, Gannan Medical University 제1부속병원 윤리위원회의 승인을 받았습니다(윤리 승인 번호: 22SC-2023011201). 연구 참여에 앞서 모든 참여자로부터 서면 동의서를 작성받았습니다.

시료 선정
ALL, MM, CLL 및 림프종을 포함한 다양한 혈액암으로 진단받은 환자 40명으로부터 임상 시료를 얻었습니다. 또한, 만성 골수성 백혈병 환자로부터 만성기 및 급성기 쌍을 이룬 시료를 수집하였습니다. 시료는 2016년 12월부터 2022년 8월 사이에 중국 Jiangxi의 Gannan Medical University 제1부속병원에서 수집하였습니다. 해당 검체들은 골수 흡인물(BMA) 또는 말초혈액에서 유래되었습니다. 네 가지 림프성 악성 종양 세포주인 B-ALL 세포주 REH 및 NALM6, T-ALL 세포주 Jurkat, 림프종 세포주 H9를 사용하였으며, 모두 American Type Culture Collection(ATCC; Manassas, VA)에서 조달하였습니다.

분석적 검증 연구를 위해, 새로 진단되었거나 재발한 MM 환자 30명으로부터 치료 전후에 수집된 쌍을 이룬 임상 잔여 골수 도말 표본의 일부가 포함되었습니다. 해당 시점의 BMA 샘플을 대상으로 4색 유세포 분석기를 사용하여 MFC 분석을 수행하였습니다.

시료는 6가지 서로 다른 4색 항체 조합(희석 비율은 제조사 지침에 따름)으로 염색하였다: CD38/CD56/CD45/CD19, CD38/CD138/CD45/CD34, CD38/CD117/CD45/CD33, CD38/CD22/CD45/CD20, CD38/CD9/CD45/HLA-DR 및 K/L/CD45/CD38. 염색은 4 °C의 암소에서 30분 동안 수행하였으며, 이어서 PBS로 두 번 세척하였다(4 °C에서 500 × g로 5분간 원심분리). 면역혈액학 실험실에서 골수의 MFC-MRD 양성은 현재 10^-4 (10,000개 세포 중 1개 세포)의 임계값을 사용하여 정의한다. 유세포 분석 획득 품질은 전방 산란광/측방 산란광을 시각화하고 튜브당 최소 10,000개의 CD45⁺ 이벤트가 확인됨으로써 검증하였다.

NGS 기반 클론성 분석을 통한 클론성 검출 및 MRD 추적
제조사의 지침에 따라 해당 키트를 사용하여 BMA, 말초혈액 또는 잔류 도말 전체(200 µL의 PBS에 재현탁) 200 µL에서 gDNA를 추출하였다. 최소 gDNA 농도 20 ng/µL 및 총 수율 ≥ 1 µg이 요구되었다. A260/A280 비율 1.8–2.0을 확인하였다. 이 분석법은 프라이머를 이용한 로커스 특이적 멀티플렉스 PCR로 gDNA를 증폭한 후, 시료 식별을 위해 증폭된 수용체 서열에 반응 특이적 인덱스 바코드를 추가한다. 바코드가 지정된 증폭 DNA를 풀링하여 시퀀싱 라이브러리를 준비하며, 이를 Illumina 플랫폼을 이용해 NGS로 분석한다. 최종 라이브러리 크기 350–450 bp 및 농도 ≥ 5 nM을 Bioanalyzer로 확인하였다. 시퀀싱 데이터는 맞춤형 생정보학 파이프라인과 엄격한 품질 관리 조치를 통해 처리된다. 리드는 각 시료의 재배열된 BCR 또는 TCR에 할당되며 클론성 수용체 서열로 집계된다. 이후 이 서열들의 질환 관련 가능성과 후속 추적 적합성을 평가한다. 적합한 서열로 간주되려면 해당 로커스의 모든 BCR 서열 중 최소 10%를 구성해야 하며 충분한 고유성을 보여야 한다. MRD 추적을 위해 서열을 평가할 때, ImMunoGeneTics (IMGT) 데이터베이스(http://www.imgt.org)와 같은 포괄적인 B 또는 T 세포 레퍼토리 데이터베이스와 비교하여 고유성을 결정한다. 이 데이터베이스 내의 서열 빈도를 사용하여 구별 가능성을 평가한다. 적절한 질환 관련 서열이 식별되면, 이를 후속 시료와 비교하여 MRD를 모니터링한다. 서열 일치 항목이 발견되면 MRD 양성(+)으로, 일치 항목이 검출되지 않으면 MRD 음성(-)으로 분류한다. 모니터링되는 각 서열의 농도를 정량화하여 시료 수준에서 합의된 악성 세포 및 총 유핵 세포 수를 계산한다. 이 수치들 간의 비율은 시료 내 종양 세포 빈도의 추정치를 제공하여 질병의 진행 또는 관해에 대한 귀중한 통찰을 제공한다. 최소 50개의 지지 리드가 검출되고 진단 시 총 BCR/TCR 레퍼토리의 ≥10%를 차지하는 클론성 서열을 추적에 유효한 것으로 간주하였다.

모든 인체 유래 시료는 개인 보호 장구(PPE)를 착용한 상태에서 2등급 생물안전작업대(BSC) 내에서 생물학적 위험 물질로 취급하였습니다. 오염된 소모품은 폐기 전 고압증기멸균(121 °C, 20 min)하였으며, 액체 폐기물은 10% 표백제로 처리하였습니다.

정밀도 및 민감도 연구
검출 한계(LOD)는 건강한 기증자의 말초혈액 gDNA를 배경으로 임상 샘플과 세포주를 사용하여 결정하였습니다. 검출의 선형성을 확립하기 위해, 세포주 gDNA를 정상 gDNA에 첨가하여 여러 자릿수에 걸친 클론 빈도 범위를 생성하였습니다. 구체적으로, 악성 세포를 10개부터 시작하여 10배 연속 희석을 통해 10, 100, 1,000, 10,000개의 세포를 첨가하였습니다. LOD는 적합된 probit 곡선이 95% 검출 확률에 도달하는 시점의 예상 악성 입력 세포 수로 계산하였습니다. 관찰된 빈도와 예상 빈도 사이의 일관성은 선형 회귀 분석을 통해 분석하였습니다. 이러한 파라미터들은 후속 평가 연구에서 샘플 수준의 MRD 추정을 위한 견고한 기초를 제공합니다. 이 수정된 버전은 명확성과 간결함을 개선하면서 학술적 어조를 유지합니다. 또한 과학적 용어의 적절한 사용을 보장하며 생명 과학 및 의학 분야의 학술적 글쓰기 관례를 준수합니다.

통계 분석
양측 p < 0.05를 통계적으로 유의미한 것으로 간주하였다. 선형성은 GraphPad Prism의 Pearson 상관 계수(r)를 사용하여 평가하고 계산하였다. 통계 분석은 R 언어(버전 3.6.1)로 수행되었다. 무진행 생존 기간(PFS)의 계산은 환자가 완전 반응(CR), 부분 반응(PR) 또는 매우 좋은 부분 반응(VGPR)을 달성한 시점부터 시작하여, 질병 진행(PD)이 발생하거나 모든 원인으로 인한 사망이 일어날 때까지로 정의하였다. 생존 분석에는 Kaplan-Meier 곡선을 사용하였으며, 하위 그룹 간의 생존 차이를 비교하기 위해 log-rank 검정을 사용하였다. Cox 분석은 단변량 및 다변량 분석을 모두 사용하여 수행되었다.

결과

클론성 검출의 처리 능력, 선형성 및 정밀도
BCR/TCR 클론성 분석은 두 차례의 멀티플렉스 PCR 후 NGS를 통해 수행되었습니다 (그림 1). BCR 클론성 분석은 개별 반응 또는 조정된 단일 혼합 반응을 사용하여 IGH (VH-DH-JH 또는 DH-JH), IGK (Vκ-Jκ, Vκ-Kde, intronRSS-Kde) 및 IGL (Vλ-Jλ) 재배열뿐만 아니라 BCL1-IGH 및 BCL2-IGH 전위를 식별할 수 있었습니다. TCR 클론성 분석은 TCRB (Vβ-Dβ-Jβ) 및 TCRG (Vγ –Jγ) 재배열을 검출할 수 있었습니다. B-세포 림프종 악성 종양의 BCR 클론성 검출률은 93.94%였으며, T-세포 림프종 악성 종양의 TCR 클론성 검출률은 90.91%였습니다 (표 1).

세포주 테스트 결과에 기반하여, 여러 자릿수에 걸친 광범위한 샘플 입력값(0.2 µg, 2 µg, 20 µg)에서 선형성이 입증되었습니다. 선형성을 확립하기 위해, 정상 gDNA에 악성 세포를 10배 연속 희석(10, 100, 1,000, 10,000개 세포)하여 첨가하였습니다. 1에서 10^-6까지의 클론 빈도에서 추정 기울기가 0.93–1.06으로 나타나 선형성이 관찰되었습니다(그림 2A). BCR 및 TCR 클론성 분석 모두에서 LOD는 1~2개의 악성 세포인 것으로 추정되었습니다(그림 2B). 또한, BCR/TCR 클론성 분석을 통해 조직 샘플(BMA) 및 일치하는 말초혈액을 사용하여 림프종의 클론성을 검출할 수 있었습니다(부록 표 1).

MRD 검출 검증에 사용된 환자 및 시료
MRD 검출 검증에는 총 29명의 MM 환자가 포함되었으며, 시료 손상으로 인해 환자 1명은 제외되었습니다. 연구 대상 군은 남성 65.52%(19/29), 여성 34.48%(10/29)로 구성되었으며, 연령 중앙값은 65세(범위 33–82세)였습니다(표 2). 코호트 중 IMWG 기준¹⁸에 따라 고위험군 31.03%(9/29), 표준 위험군 24.14%(7/29), 저위험군 37.93%(11/29)로 분류되었습니다. 개정 다발성 골수종 국제 병기 분류 체계(R-ISS) 병기 I, II, III 단계는 각각 환자의 10.34%(3/29), 48.28%(14/29), 20.69%(6/29)를 차지하였습니다¹⁹.

NGS 및 MFC 분석의 비교
OriMIRACLE LTM 및 MFC 분석의 정량적 정확도를 평가하기 위해 직접적인 쌍별 비교를 수행하였습니다. 결과적으로 테스트 범위 전반, 특히 10⁻⁴ 이상의 MRD 빈도에서 유사한 정량적 정확도를 보였으며, 피어슨 R 값은 0.73이었습니다 (그림 3). 29명의 MM 환자로부터 얻은 59개의 샘플에서 MFC와 NGS 분석 모두 종양 세포를 검출하였으며, 일치도는 81.36%(48/59)에 달했습니다. 이러한 일치도는 방법 간의 진정한 일치라기보다 여러 시점에 걸쳐 검출 가능한 종양 세포가 존재했음을 반영합니다. 샘플 중 62.07%(18/29)는 NGS와 MFC 분석 모두에서 MRD+로 판정되었고, 1명의 환자는 두 방법 모두에서 MRD−로 판정되었으며, 11명의 환자는 NGS에서는 MRD+였으나 MFC에서는 MRD−로 판정되었습니다. 검출 결과가 일치하지 않은 환자 중 3명은 검출 빈도가 10^-4 미만이었고, 8명은 10^-2–10^-4 범위 내의 검출 빈도를 보였습니다 (그림 3). 잔여 골수 도말 샘플로부터 가능한 한 많은 DNA를 얻기 위해 DNA 추출을 수행하였습니다. 치료 전 클론성 검출을 위해 평균 91.95 ng(최대 100.0 ng)의 DNA 입력값이 테스트되었습니다. 이후 MRD 테스트를 위해 평균 1623.39 ng(범위 50.1–17400.0 ng)의 DNA가 추출되었습니다 (부록 표 2). 이를 통해 NGS는 잔여 샘플이 부족한 경우에도 MRD를 검출할 수 있는 반면, MFC는 일부 사례에서 MRD 검출에 실패한다는 점이 밝혀졌습니다.

리드 간격에 대한 NGS 분석 기반 MRD 검출의 임상적 타당성
모든 MM 환자의 기저 상태에서 클론 서열이 검출되었으며, 이어서 MRD 평가를 수행하였다(그림 4). 18명의 환자가 NGS 및 MFC 검출을 통해 MRD+인 것으로 확인되었다. MFC와 NGS 모두에서 MRD+로 판정된 환자 중 61.11%(11/18)가 이후 PD 또는 재발을 경험하였다. 환자의 38.89%(7/18)는 연구 기간 동안 안정성 질환(SD) 또는 PR을 달성하였다. NGS에서는 MRD+였으나 MFC에서는 MRD−로 확인된 환자 중 36.36%(4/11)는 가장 최근의 임상 평가에서 임상적 CR을 달성하지 못했다(보충 표 2). 또한, 임상적 반응이 CR이었던 모든 환자 중 37.50%(3/8)의 환자가 치료 중단 후 재발을 경험하였다. 우리는 또한 PFS 결과와 관련된 주요 임상적 특징 및 MFC 결과를 탐색하였다(보충 그림 1). PFS에 대한 단변량 및 다변량 분석 결과, 이들은 유의미한 관련이 없는 것으로 나타났다. 본 연구에서 MFC를 통해 얻은 MRD 결과만으로 분석했을 때 PFS에 유의미한 차이는 관찰되지 않았다.

데이터 가용성
환자 개인정보 보호 제한 및 기관 정책으로 인해, 원시 데이터는 공개되지 않습니다. 수집된 데이터의 요약본은 보충 파일 1에 제공됩니다.

그림 1: BCR/TCR 클론성 분석은 멀티플렉스 PCR 후 NGS를 통해 수행되었다. 1차 PCR에서는 로커스 특이적 프라이머와 샘플 특이적 인덱스를 사용하여 재배열된 면역 수용체 유전자의 CDR3 영역을 증폭시켰으며, 2차 PCR 과정에서 NGS 어댑터를 추가하였다. 이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 다양한 클론 빈도 범위에서 정상 gDNA에 세포주 gDNA를 스파이킹하여 클론성 검출의 선형성을 평가하였다. (A) BCR 및 TCR 클론성 분석의 선형성. (B) 임상 시료 및 건강한 공여자 말초혈액 gDNA에 스파이킹된 세포주를 사용하여 추정한 검출 한계(LOD). 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: MFC와 NGS MRD 분석 간의 MRD 빈도 측정값에 대한 쌍별 비교. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: MM 환자의 MRD 동태 및 환자의 서로 다른 임상 상태. 이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

시료 유형		번호	질환 유형	우세 클로노타입
세포주	REH	1	B-ALL	IGH, IGK
	NALM6	2	B-ALL	IGH, IGK
	Jurkat	3	T-ALL	TCRB, TCRG
	H9	4	림프종	TCRB, TCRG
임상 B-세포 림프구성 악성종양		5	B-ALL	IGH
		6	B-ALL	IGL
		7	B-ALL	IGH
		8	B-ALL	검출되지 않음
		9	CLL	IGH, IGK
		10	CLL	IGH, IGK
		11	CP-CML	IGH
		12	BP-CML	IGH
		13	MM	IGK
		14	MM	IGH, IGK
		15	MM	IGK
		16	MM	IGH
		17	MM	IGH
		18	MM	IGK
		19	MM	IGH
		20	MM	IGH, IGK
		21	MM	IGH, IGK
		22	MM	IGH
		23	림프종	IGH, IGK
		24	림프종	IGH, IGK, IGL
		25	림프종	IGH, IGK, IGL
		26	림프종	IGH, IGK, IGL
		27	림프종	IGH
		28	림프종	IGH
		29	림프종	IGH, IGK, IGL
		30	림프종	IGH, IGK
		31	림프종	IGH, IGK
		32	림프종	IGH, IGK, IGL
		33	림프종	IGK
		34	림프종	IGH
		35	림프종	검출되지 않음
임상 T-세포 림프구성 악성종양		36	림프종	TCGR
		37	림프종	TCRB, TCRG
		38	림프종	TCRB, TCRG
		39	림프종	TCRB, TCRG
		40	림프종	TCRB, TCRG
		41	림프종	TCRB, TCRG
		42	림프종	TCRB, TCRG
		43	림프종	TCRB, TCRG
		44	림프종	검출되지 않음

표 1: 4가지 세포주 및 40가지 임상 시료에서 BCR/TCR 클론성 분석을 이용한 클론성 검출.B-ALL: B-세포 급성 림프구성 백혈병; T-ALL: T-세포 급성 림프구성 백혈병; CP-CML: 만성기 만성 골수성 백혈병; BP-CML: 급성기 만성 골수성 백혈병; CLL: 만성 림프구성 백혈병; MM: 다발성 골수종.

특성	전체 (N = 29)
연령 중앙값, 세(범위)	65 (33-82)
성별, n (%)
남성	19 (65.52)
여성	10 (34.48)
중쇄 유형, n (%)
IgG	14 (48.28)
IgA	7 (24.14)
IgE	1 (3.45)
경쇄 유형, n (%)
k	19 (65.52)
λ	8 (27.59)
세포유전학적 이상, n (%)
del17p	2 (6.90)
del13q14	9 (31.03)
1q21 gain/amp	12 (41.38)
t (4;14)	2 (6.90)
이상 없음	9 (31.03)
ISS 단계, n (%)
I	4 (13.79)
II	13 (44.83)
III	12 (41.38)
R-ISS 단계, n (%)
I	3 (10.34)
II	14 (48.28)
III	6 (20.69)
누락	6 (20.69)
IMWG, n (%)
고위험	9 (31.03)
표준 위험	7 (24.14)
저위험	11 (37.93)
누락	2 (6.90)

표 2: 본 연구에 등록된 29명의 MM 환자의 기저 특성. k: kappa; λ: Lambda; DS: Durie-Salmon; ISS: 국제 병기 시스템; R-ISS: 개정 국제 병기 시스템; IMWG: 국제 골수종 작업 그룹

보충 그림 1: 임상적 특성 및 MFC 결과에 기반한 생존 분석. (A) PFS의 단변량 및 다변량 분석. (B) MFC 결과에 따른 Kaplan-Meier 곡선. (C) NGS 결과에 따른 Kaplan-Meier 곡선. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 1: 조직 샘플 및 일치하는 말초 혈액에서 BCR/TCR 클론성 분석을 이용한 림프종의 클론성 검출.NHL: 비호지킨 림프종; HGBL: 고등급 B세포 림프종; FL: 여포성 림프종; DLBCL: 미만성 거대 B세포 림프종; ITLPD-GI: 위장관의 불활성 T-림프증식성 질환. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 2: MFC 및 NGS 분석 기반의 MRD 검출 결과. ND: 검출되지 않음; 부분 반응: PR; 완전 반응: CR; 안정 병변: SD; 매우 좋은 부분 반응: VGPR. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 자료 1: 본 연구에서 수집된 원시 데이터 요약 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

최근 몇 년 동안 림프종성 악성 종양의 임상 결과가 크게 개선되었으며, 이에 따라 생존 종말점을 더 조기에 예측하고 새로운 치료법의 평가를 가속화할 수 있는 대체 마커에 대한 연구가 촉진되었습니다²⁰. 8,098명의 환자를 포함한 종합적인 메타 분석을 통해 MM 환자의 장기 생존율을 높이는 데 있어 MRD 음성 판정의 강력한 예후적 가치가 재확인되었습니다²¹. 또한, BCR 및 TCR 클론성 재배열이 핵심적인 진단 및 MRD 추적 마커로 등장하여 림프계 악성 종양의 치료 결정을 안내하고 있습니다²².

충분한 DNA 샘플을 사용할 수 있는 경우, MFC 및 PCR 기반 분석보다 NGS 기반 BCR/TCR 클론성 평가의 우수성을 뒷받침하는 증거가 늘어나고 있습니다. NGS는 더 높은 민감도와 더 간편한 표준화를 제공하며^{10,23,24,25,26}, 유지 요법 시작 시 PFS 및 전체 생존율 모두에 대한 강력한 예후 인자로 확인되었습니다²⁷.
본 연구에서 우리는 림프종성 악성 종양의 BCR 및 TCR 클론성 모두에 대해 90% 이상의 양성 검출률을 보이는 NGS 기반 분석법을 개발하였습니다. 이 분석법의 LOD는 BCR 및 TCR 클론성 분석 모두에서 1~2개의 악성 세포 사이로 추정되며, 이는 1.903개의 악성 세포 LOD를 가진 clonoSEQ 분석법의 높은 민감도와 유사한 수준입니다¹⁶. 우리는 1에서 10^-6 사이의 클론 빈도에서 0.93에서 1.06 범위의 추정 기울기를 가진 선형성을 관찰하였으며, 이는 관찰된 클론 빈도와 예상 클론 빈도 사이에 강한 비례 관계가 있음을 나타냅니다. 표준화된 검출 방법의 확립과 실험실 검증을 완료한 후, 우리는 이 분석법이 임상적 MRD 모니터링에 적합한지 확인하기 위해 임상 검증을 수행하였습니다.

본 연구에서는 NGS 기반 분석법과 MFC 사이에 81.36%(48/59)의 일치도를 확인하였습니다. 두 방법 모두 새로 진단되었거나 재발한 사례의 종양 세포를 식별하는 데 있어 100%의 민감도를 보였습니다. 치료 후 모니터링의 경우, MFC로 평가한 MRD 상태와 PFS 사이에 유의미한 상관관계가 발견되지 않았으며, 이는 제한된 표본 크기 때문인 것으로 보입니다. 이에 따라 모든 사례에 대해 종합적인 분석을 수행하였습니다.

두 방법 모두에서 MRD 양성으로 판명된 18명의 환자 중, MRD 결과는 임상 반응 평가와 일치했습니다. 이들 중 9명의 환자는 PD 또는 재발을 겪었으며, 4명은 SD, 4명은 PR을 달성했고, 1명은 사망했습니다. 이는 두 방법 모두에서 MRD 양성으로 테스트된 환자의 경우, 거의 예외 없이 PD 또는 재발이 관찰됨을 시사합니다. 이러한 데이터는 NGS 및 MFC 분석 모두에서 MRD 양성이 나타나는 것이 주로 이들 환자의 제한된 효능 또는 불량한 예후를 반영한다는 점을 시사합니다. NGS에서는 MRD 양성으로 나왔으나 MFC에서는 MRD 음성으로 판명된 11명의 환자 중 36.36%가 CR을 달성하지 못했습니다. 이러한 결과는 잔류 검체가 제한적인 상황에서도 10^-2에서 10^-6 범위의 빈도로 MRD를 검출할 수 있는 NGS의 역량을 강조하는 반면, MFC는 일부 사례에서 MRD를 검출하지 못했음을 보여줍니다. 이는 MRD 검출에 있어 MFC 대비 NGS의 더 높은 민감도와 특이도를 더욱 뒷받침합니다.

이전 연구들에 따르면 MFC로 평가한 MRD 상태가 MM 환자의 PFS 및 전체 생존율의 강력한 예측 인자임이 입증되었으며, 이는 자가 조혈모세포 이식 후 치료 결정 및 예후 평가를 위한 MRD 모니터링의 중요성을 강조합니다²⁸. 본 결과는 NGS 분석의 중요성을 더욱 부각시키는데, MFC로는 MRD 음성이었으나 NGS로는 MRD 양성으로 판정된 두 가지 사례(환자 11 및 14)가 그 예입니다. 이러한 사례에서 치료를 중단할 경우 재발 위험이 높아질 수 있다는 점에 유의해야 하며, 이는 MRD 결과가 불일치할 때 치료 반응에 대한 신중한 평가가 필요함을 시사합니다.

본 연구는 기존의 NGS 및 MFC 방법이 신선한 골수 흡인물이나 냉동 세포에 의존하던 한계를 극복하였으며, 루틴 진단 후 남은 잔여 염색 골수 도말 표본이 고감도 MRD 검출을 위한 신뢰할 수 있는 시작 재료로 사용될 수 있음을 최초로 체계적으로 검증하였습니다. 이는 다음과 같은 임상적 및 방법론적 공백을 직접적으로 해결합니다: (1) 특히 고령 환자나 샘플 채취가 어려운 환자에게서 MRD 모니터링을 위해 다량의 골수액을 추출해야 하는 필요성을 배제합니다; (2) 보관된 도말 표본의 회고적 분석을 가능하게 하여, 기존 병리 자원을 활용해 과거 코호트에서 MRD 기반의 예후 근거를 수립할 수 있게 합니다; (3) 10^-5-10^-6의 검출 감도로 기존의 MFC(통상적으로 10^-4-10^-5)보다 훨씬 우수하며, MFC에서 샘플 품질 문제로 인해 발생하는 위음성을 방지하여 임상 실무에 DNA 기반의 추적 가능한 MRD 평가 도구를 제공합니다.

분석의 성공과 신뢰성을 확보하기 위해 몇 가지 중요한 단계가 확인되었습니다. 적절한 gDNA 수율을 얻기 위해서는 잔류 도말물을 부드럽게 긁어낸 후 즉시 버퍼를 처리하는 것이 필수적이었습니다. 대립유전자 탈락(allele dropout)이나 편향된 증폭을 방지하기 위해 정확한 입력 DNA 양(반응당 100 ng, ±10% 이내)이 요구되었습니다. 바코드가 지정된 생성물을 등몰량으로 풀링(2 nM)함으로써 균일한 시퀀싱 깊이를 구현하였으며, 생물정보학적 임계값(진단 시 클론 빈도 ≥10% 및 추적 시 미스매치 ≤5%)을 일관되게 적용하여 위양성 MRD 판정을 방지했습니다. 또한, 일반적인 실험 문제를 해결하기 위해 표준 프로토콜에 몇 가지 수정 사항을 도입했습니다. 최종 라이브러리 농도가 5 nM 미만인 경우, 과증폭 편향을 피하기 위해 2~4 사이클을 추가한 2차 PCR을 신중하게 수행했습니다. 과도한 미스매치(>5%)로 인해 클론 추적에 실패한 샘플의 경우, 참조 IMGT 데이터베이스를 업데이트하고 탐색적 분석을 위해 미스매치 허용 범위를 일시적으로 8%로 완화하였으나, 임상 보고를 위한 표준 컷오프 값은 5%로 유지했습니다. 샘플당 시퀀싱 깊이가 50,000 reads 미만으로 떨어진 경우에는 PCR 단계를 반복하지 않고 다시 풀링하여 재시퀀싱을 수행했습니다.

종합적으로, 이번 실제 임상 검증을 통해 잔여 골수 도말 검체들이 다양한 치료 환경 전반에서 일관되고 신뢰할 수 있는 검사 결과를 산출한다는 점이 입증되었습니다. NGS 대신 골수 생검과 MFC가 일상적으로 수행되는 경제적 취약 지역의 경우, 초기 결과가 음성일 때 추가적인 분자 생물학적 평가를 위해 NGS를 고려할 수 있음을 본 결과가 시사합니다. 이러한 상황에서 잔여 검체를 활용하는 것은 반복적인 골수 흡인 검사의 필요성을 없애 환자의 부담을 줄여주므로 적절한 방법입니다.

진행 중인 실세계 연구(real-world study)를 통해 추가 분석을 위한 표본 크기를 확대하고자 하나, 몇 가지 한계점이 있음을 인정합니다. 환자 10의 두 번째 MRD 검출에서 관찰된 바와 같이, 특히 추출된 DNA 함량이 불충분할 때 위음성이 발생할 수 있습니다. 또한, NGS로 검출되는 클론의 비율은 세포 정량화의 영향을 받으며, 이는 잠재적으로 MRD 세포 비율의 과대평가로 이어질 수 있습니다. 본 검증은 주로 골수 샘플에 집중되었습니다. 그러나 NGS-MRD의 장기적인 중요성은 치료 후 여러 차례의 추적 관찰에 있으며, 이 경우 말초혈액이 더 적합할 수 있습니다. 말초혈액 샘플에 대한 검증은 아직 수행되지 않았습니다. 제한적인 임상 검증 샘플 수, 무작위 환자 등록 및 본 실세계 연구의 다양한 치료 접근 방식으로 인해 연속적인 MRD 샘플을 수집하는 데 어려움이 있었습니다. 결과적으로, 본 연구는 후속 진행과 관련된 초기 MRD 반응의 유의성을 평가하는 데 집중하였으며, 지속적인 MRD 상태가 장기 결과에 미치는 영향은 입증하지 못했습니다. 또한, NGF는 비교 분석에 포함되지 않았습니다. NGS와 기존 MFC를 체계적으로 비교하였으나, IMWG 권장 MRD 방법의 두 가지 중 하나인 NGF(다른 하나는 NGS)를 함께 분석했다면 분석 성능에 대한 추가적인 통찰을 제공했을 것입니다. 더욱이 표본 크기가 상대적으로 작고(n = 40), 코호트가 다양한 혈액암을 포함하여 이질적입니다. 향후 NGF를 포함하고 다발성 골수종과 같은 단일 악성 종양에 집중한 다기관 대규모 연구를 통해 본 결론을 확인하고 확장할 필요가 있습니다.

NGS 기반의 BCR/TCR 클론성 분석법의 성능을 철저히 특성화하고 검증함으로써, 우리는 이 방법이 다발성 골수종(MM) 환자의 잔류 골수 도말 시료에서 MRD를 정량화하고 모니터링하는 데 있어 매우 민감하고 정확하며 실용적인 방법으로서 잠재력이 있음을 입증하였습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Anti-CD19	Abcam	AB134114	제조사 지침에 따른 희석
Anti-CD20	Abcam	AB64088	제조사 지침에 따른 희석
Anti-CD22	Abcam	AB32123	제조사 지침에 따른 희석
Anti-CD33	Abcam	AB134115	제조사 지침에 따른 희석
Anti-CD34	Abcam	AB81289	제조사 지침에 따른 희석
Anti-CD38	Abcam	AB183326	제조사 지침에 따른 희석
Anti-CD45	Abcam	AB40763	제조사 지침에 따른 희석
Anti-CD56	Abcam	AB75813	제조사 지침에 따른 희석
Anti-CD9	Abcam	AB2215	제조사 지침에 따른 희석
Anti-HLA-DR	Abcam	AB20181	제조사 지침에 따른 희석
GraphPad Prism	GraphPad	https://www.graphpad.com/
Illumina NovaSeq 6000	Illumina	NovaSeq 6000	https://www.illumina.com/systems/sequencing-platforms/novaseq.html
ImMunoGeneTics (IMGT) 데이터베이스	ImMunoGeneTics (IMGT) 데이터베이스	http://www.imgt.org/
림프성 악성 종양 세포주	ATCC	https://www.atcc.org/	B-ALL 세포주 REH 및 NALM6, T-ALL 세포주 Jurkat, 림프종 세포주 H9 (DSMZ)
다중 파라미터 유세포 분석법	BECKMAN COULTER	CytoFLEX
OriMIRACLE LTM 분석	Origimed Co., Ltd., 상하이, 중국
R 언어	R Foundation for Statistical Computing	버전 3.6.1