전사체 시퀀싱: 동맥경화성 플라크에서 허브 병원성 화학물질 확인

요약

본 연구는 RNA 시퀀싱을 이용해 죽상동맥경화성 플라크(AP)와 관련된 염증 인자의 근본 기전을 분석하는 것을 목표로 합니다. 결과는 AP에서 핵심 염증 허브 유전자인 CCL3, CCL4, CXCL1을 확인했습니다. 이 화학계 화학물질은 M0 대식세포 축적을 촉진하고 보호 면역 세포를 억제함으로써 죽상동맥경화를 촉진할 수 있으며, 이를 통해 잠재적 치료 표적을 드러낼 수 있습니다.

초록

동맥경화성 플라크(AP)는 동맥벽의 내피세포와 평활근 세포가 손상된 후 발생하는 염증성 섬유조직 증식 질환으로, 심혈관 및 뇌혈관 혈류 차단의 정도를 다양하게 유발할 수 있습니다. 그러나 염증을 표적으로 하는 효과적인 치료법은 지금까지 대체로 실패했으므로, 추가적인 통찰이 여전히 필요함을 시사합니다. 본 연구는 RNA-시퀀싱(RNA-seq)을 사용하여 염증 인자 관련 전사체 변화를 분석하는 것을 목표로 했습니다. RNA-seq는 AP 환자(n = 11)와 대조군(n = 3)의 샘플에 대해 수행되었습니다. Metascape를 이용해 차별발현 유전자(DEGs)를 확인한 후, R 소프트웨어의 clusterProfiler 패키지를 이용한 KEGG 경로 풍부 분석, CIBERSORT를 통한 면역 침윤 분석, STRING 데이터베이스를 이용한 단백질-단백질 상호작용(PPI) 네트워크가 수행되었습니다. PPI 네트워크 내 허브 유전자는 CytoHubba 플러그인을 사용하여 확인되었습니다. AP 그룹에서는 총 3,713개의 DEGs가 확인되었으며, 이 중 2097개는 상향 조절 유전자, 1616개 유전자는 하향 규제 유전자였습니다. 결과는 DEGs가 주로 면역 및 염증 관련 경로에 풍부함을 보여주었습니다. 염증 관련 인자인 CCL3, CCL4, CXCL1이 AP 병리학적 과정에서 주요 허브 유전자로 간주되었습니다. 면역 침윤 분석 결과 AP에서 독특한 미세 환경이 나타나며, 이는 CD8⁺ T 세포, 활성화된 NK 세포, 휴식 비만세포의 감소와 함께 M0 대식세포의 유의미한 증가가 특징이었습니다. 결론적으로, 이러한 절차적 발견은 CCL3, CCL4, CXCL1의 차이 발현과 AP에서 변화된 면역세포 구성과의 연관성을 설명하며, 이 세 가지 케모카인을 추가 기전 연구의 잠재적 후보로 강조합니다.

서론

심혈관 질환(CVD)은 전 세계적으로 인체 건강에 심각한 위협이 되어^{왔습니다.} 전 세계 인구 고령화 추세가 심화됨에 따라 심혈관 질환(CVD) 발생률도 증가하고 있습니다². 그중 동맥경화성 플라크(AP)는 CVD³의 주요 원인 중 하나입니다. AP는 만성 염증성 질환으로, 동맥 내막에 지질이 점진적으로 축적되고 플라크가 형성되는 것이 특징^입니다. AP는 심혈관 및 뇌혈관 사건의 일반적인 기초이며, 주로 크고 중간 크기의 동맥을 관여하여 허혈과 손상을 유발하고, 심혈관 및 뇌혈관 질환과 사망을 일으키는 주요 원인입니다. 초기 단계에서 명확한 증상이 없기 때문에, AP는 진단 시점에는 보통 진행되어 치^사율이 높습니다. AP 치료는 저체중 신체 활동, 좌식 행동, 흡연, 정신 건강 문제(⁷), 고지방 식단으로 인한 비만 및 제2형 당뇨병과 같은 조절 가능한 요인과 유전자, 연령, 성별 등 조절 불가능한 요인 등 위험 요인에 중점을 둡^니다. 최근 연구들은 대사 증후군, 호모시스테인혈증, 고요산혈증, 췌장 저항성이 죽상동맥경화증의 발생 및 발달에 중요한 위험 요인임을 밝혀냈습니다 ^9,10.

AP의 병인과 관련된 이론은 주로 지질 침투, 염증, 산화 스트레스 반응, 감염, 유전적 요인과 환경적 요인 간의 상호작용 이론을 포함한다^11,12. 그중 염증과 산화 스트레스는 AP의 핵심 병인으로 인식되며,^AP13의 발생부터 발달 및 악화까지 모든 과정에 관여합니다. AP 불안정 플라크의 갑작스러운 손상, 혈소판 활성화 및 혈전증은 심근경색 및 출혈성 뇌졸중의 중요한 병인입니다¹⁴. 지속적인 연구를 통해 AP는 지질뿐만 아니라 많은 염증 세포도 포함하고 있음이 밝혀졌습니다¹⁵. 흡연, 고혈압, 지질 장애, 고인슐린혈증, 고혈당, 높은 요산 및 기타 유해 자극은 백혈구와 내피세포가 용해성 부착 분자와 다양한 사이토카인을 지속적으로 방출하도록 유도하고, 단핵구가 혈관 내피 세포에 부착하도록 촉진합니다. 축적된 케모카인은 단핵구를 내피하 공간으로 이동시키고, 이들은 대식세포로 분화하며, 대식세포는 조직 내 콜레스테롤이 풍부한 산화 저밀도 지단백(LDL)을 식하하여 폼 세포로 변질하고 지질 줄무늬 형성을 시작한다¹⁶. AS의 초기 병리학적 손상, 즉 지질 줄무늬는 주로 대식세포와 T 림프구로 구성되며, 이는 전형적인 염증성 병변입니다¹⁷. 따라서 다양한 염증 세포와 그 산물이 AP¹⁸의 시작과 진행에 관여합니다. 하지만 AP의 염증 현상은 복잡하며, 여러 알려진 요인과 잠재적으로 알려지지 않은 요인들이 얽혀 있습니다. 전통적인 후보 유전자 접근법은 이러한 염증 유발 요인의 전체 스펙트럼을 포착하지 못할 수 있습니다.

이 한계를 해결하기 위해 우리는 편향 없는 고처리량 전사체체법인 RNA-시퀀싱(RNA-seq)을 사용했습니다. 이 접근법은 주요 분자 동기가 미리 정의되지 않은 가설 생성 연구에 특히 적합합니다. 후보 유전자 또는 마이크로어레이 기반 방법과 달리, RNA-seq는 더 넓은 동적 범위, 높은 민감도, 그리고 사전 프로브 설계 없이도 새로운 전사체를 탐지할 수 있는 능력을 제공합니다^19,20. 이러한 특징들은 분자 기저가 아직 완전히 특성화되지 않은 AP에서 염증 관련 신호를 발견하는 데 특히 적합합니다.

본 연구에서는 RNA-seq를 사용하여 AP와 관련된 염증 인자의 기전을 분석하였고, 다양한 알고리즘을 활용한 생물정보학 도구를 사용하여 일련의 DEGs를 선별하였습니다. 이후 농축 분석(WGCNA, KEGG 경로, mcode, GSEA, 허브 유전자 분석), 단백질-단백질 상호작용(PPI) 네트워크 분석이 수행되었습니다. 본 연구 결과는 염증 유발 AP의 분자병리학적 메커니즘에 대한 이해를 높이는 데 기여하며, 새로운 바이오마커 탐색에 중요한 역할을 합니다.

프로토콜

이 연구는 랴오청 인민병원 윤리위원회(승인 번호: 2023014)의 승인을 받았으며, 헬싱키 선언의 원칙을 준수하였습니다. 모든 참가자로부터 사전 동의를 받았습니다. 모든 환자 또는 그 가족이 사전 동의서에 서명했습니다.

환자와 샘플

이 연구는 2023년 1월부터 2023년 12월까지 중국 산둥성 랴오청 인민병원 혈관신경외과에서 경동맥 내막 절제술을 받은 중증 경동맥 협착증 환자 11명을 후향적으로 분석하였습니다. 이 환자들은 AP 그룹으로 등록되었습니다. 경동맥 협착증 진단은 CTA 또는 뇌혈관조영술과 같은 영상 데이터를 기반으로 했습니다. AP 그룹의 포함 기준은 다음과 같았습니다: (1) 50세에서 80세 사이의 연령; (2) 컴퓨터 단층촬영 혈관조영술/디지털 감산 혈관조영술로 두개내 내경동맥 협착이 확인됨≥70%; (3) 발병 전 수정된 랭킨 척도 점수 ≤ 1; (4) 환자 또는 그 법적 대리인으로부터 받은 사전 동의. 제외 기준은 다음과 같았습니다: (1) 염증성 또는 면역 질환; (2) 정신 질환의 존재; (3) 악성 종양의 존재; (4) 임신, 수유 또는 출산 잠재력. 같은 기간 동안 같은 병원에서 장기 기증을 받은 중증 외상성 뇌손상 환자들이 대조군으로 선정되었습니다(NA; 정상 대조군, n = 3). 두 그룹의 피험자들은 연령, 성별, 체질량지수(BMI)를 기준으로 매칭하여 교란 요인을 제거하였습니다. 대조군의 포함 기준은 다음과 같았습니다: (1) 50세에서 80세 사이의 연령; (2) 관상동맥 질환, 경동맥 협착증 또는 기타 전신 혈관 질환 병력 없음; (3) 환자의 법적 대리인으로부터 받은 사전 동의. 경동맥 내막 및 플라크 샘플은 경동맥내막 절제 수술 중 AP 그룹에서, 대조군은 장기 기증 후 대조군에서 채취하였습니다. 혈관 및 플라크 조직은 이후 검사를 위해 액체 질소 탱크에 보관되었습니다. AP 환자의 기초 특성은 표 1에 나타났습니다.

샘플 준비

전체 RNA 추출은 제조사 지침에 따라 TRIzol 시약을 사용해 추출되었습니다. RNA 농도와 순도는 Nanodrop ND-2000 분광광도계를 사용해 260 nm와 280 nm에서 평가하였으며(A260/A280 비율은 1.8과 2.0 사이) RNA 무결성은 100V에서 2% 아가로스 겔 전기영동으로 30분간 평가하였으며, RNA 무결성 값(RIN)은 Agilent 2100 바이오분석기를 사용해 얻었으며(후속 분석에는 RIN ≥ 7.0 샘플을 사용함). 모든 샘플 취급 및 RNA 추출 절차는 별도의 명시가 없는 한 상온에서 수행되었습니다. 폐기물 TRIzol 시약은 기관의 유해 화학 폐기물 지침에 따라 처리되었습니다.

RNA 시퀀싱

DNase I 처리 후 총 RNA를 올리고 D (T) 자기 구슬로 mRNA를 농축한 후 94°C에서 5분간 짧은 조각으로 분해하였습니다. 생성된 mRNA 조각들은 템플릿 역할을 했으며, 무작위 올리고뉴클레오타이드가 프라이머로 사용되었습니다. 첫 번째 가닥 cDNA는 42°C에서 M-MuLV 역전사효소 시스템을 통해 50분간 합성한 후, RNase H 매개 RNA 가닥 분해가 이루어졌습니다. 두 번째 가닥 합성은 DNA 중합효소 I 시스템 내에서 dNTP를 사용하여 수행되었습니다. 이중 가닥 cDNA는 정제되고 끝부분을 수리한 뒤, 어댑터 연결을 용이하게 하기 위해 'A' 오버행으로 꼬리를 맞췄습니다. AMPure XP 비즈를 사용해 250-300 bp 크기의 cDNA 조각을 선별하고, PCR을 통해 증폭했습니다. 그 후 증폭된 산물을 정제하여 최종 라이브러리를 생성했습니다. 라이브러리 시퀀싱은 Illumina HiSeq 플랫폼에서 쌍쪽 150 bp 읽기 길이로 수행되었습니다. 데이터 품질 관리(QC)를 위해 어댑터 서열이나 저품질 베이스가 포함된 원시 데이터는 사내 스크립트를 사용해 필터링했습니다. 기기에서 발생할 수 있는 시퀀싱 오류로 인해, 데이터 품질을 평가하기 위해 시퀀싱 오류율 분포를 분석했습니다(오류율 < 1%는 허용 가능한 것으로 간주됨). 또한 GC 콘텐츠 분포도 결정되었습니다. 모든 시퀀싱 절차는 별도의 언급이 없는 한 상온에서 수행되었습니다. 유해 화학물질(예: DNase I 완충제)이 포함된 시약은 기관 생물안전 지침에 따라 폐기되었습니다.

품질 관리 임계값과 문제 해결

RIN ≥ 7.0과 조각 크기 250–300 bp의 라이브러리만 사용되었습니다. 샘플당 최소 1,400만 건의 원시 리드가 필요했고, Q30 ≥ 98%가 요구되었습니다. 낮은 라이브러리 수율은 PCR 사이클을 18회로 늘려 해결했으나, 중복률을 15% 이하로 유지하기 위해 15사이클을 선호했습니다.

DEG 선별

우리는 다양한 샘플 간 유전자 발현 수준 분포를 평가했습니다. 유전자 발현 수준의 표본 간 상관관계를 사용하여 실험적 신뢰도와 표본 선정의 적절성을 검증하였습니다. 주성분 분석(PCA)을 적용하여 그룹 간 차이와 그룹 내 재현성을 평가하였다. DEG는 Metascape 온라인 데이터베이스(http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)를 사용하여 확인되었습니다. DEG는 |log₂(fold change) | > 1과 p.-값은 0.05< 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다. 모든 생물정보학적 분석은 별도의 명시가 없는 한 기본 매개변수를 사용하여 수행되었습니다. 중간 재현성 검사점으로서, 샘플이 배치가 아닌 그룹별로 군집화되어 있음을 확인하기 위해 PCA 플롯이 생성되었습니다.

교토 유전자 및 유전체 백과사전(KEGG) 풍부화 분석

KEGG(http://www.genome.jp/) 분석은 생물학적 조절 경로를 발견하기 위한 유전자 기능을 체계적으로 평가하는 방법입니다. 이 논문은 처음으로 org.Hs.eg 에서 공식 심볼 변환 유전자 ID(버전 3.12.0)를 얻었습니다. KEGG 경로 분석은 R 소프트웨어(버전 4.2.0)의 clusterProfiler 패키지를 사용하여 수행되었습니다. p. < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다. 중간 결과는 유전자 개수와 조정된 p-값을 포함한 풍부 경로의 순위 목록 생성이었습니다.

PPI 네트워크 분석

PPI 네트워크와 화면 키 유전자를 구성하기 위해 STRING 데이터베이스(버전 11.0, https://string-db.org/)가 사용되었습니다. 복합 점수가 0.9를 초과하는 상호작용만이 통계적으로 유의한 것으로 유지되었습니다. 네트워크는 분자 상호작용 네트워크 탐구를 위해 설계된 오픈 소스 생물정보학 도구인 Cytoscape(버전 3.10.1)를 사용하여 시각화 및 분석되었습니다. PPI 네트워크 내 허브 유전자는 CytoHubba 플러그인(버전 0.1)을 사용하여 확인되었습니다.

허브 유전자

상위 20개의 주요 유전자는 CytoHubba 플러그인에 의해 선정되었습니다. 빨간색은 유전자 수치가 높다는 뜻입니다. Metascape 온라인 데이터베이스(버전 3.5, http://metascape.org/gp/index)에서 허브 유전자에 대한 생물정보학적 분석은 20개의 허브 유전자를 분석하기 위해 진행되었습니다. 유전자 풍부화는 다음 온톨로지 클래스에서 확인되었습니다: WGCNA, PCA, mcode, GSEA. 게놈 내 모든 유전자는 풍부 배경 역할을 합니다. p. < 0.05, 최소 수치 3, 농축계수 1.5> 항목을 선별하였습니다.

통계 분석 방법

SPSS 25.0 통계 소프트웨어를 사용해 데이터를 분석했습니다. 집계 데이터는 빈도 또는 백분율로 표현되었고, 그룹 간 비교는 카이제곱 검정으로 검증되었습니다. 측정 데이터는 정규분포의 평균± 표준편차와 일치했으며, 그룹 간 비교에는 T 검정이 사용되었습니다. p. < 0.05는 유의미한 차이로 간주되었습니다.

결과

죽상동맥경화성 플라크의 차별 유전자에 대한 RNA-seq 데이터 분석

라이브러리 준비에는 RIN ≥ 7.0 샘플만 사용되었습니다. 14개 샘플(AP 11개, 대조군 3개)이 이 임계값을 넘었습니다. 모든 샘플은 한 번에 시퀀싱되었으며; 따라서 배치 효과 조정은 필요하지 않았습니다. 샘플당 평균 1,680만 건의 원시 리드가 생성되었으며; 품질 필터링 후, 1,650만 개의 깨끗한 리드(98%)가 유지되었으며, 91%는 인간 참조 게놈(HG38)에 고유하게 매핑되었습니다. DEGs 분석에서는 동맥경화성 플라크 환자와 건강한 대조군에서 2097개의 상향 조절 유전자와 1616개의 하향 조절 유전자가 존재함을 보여주었습니다(|log2FC| >1, P <0.05). 상위 20개의 상향 및 하향 조절 차별 발현 유전자의 히트맵은 그림 1B에 나타났습니다. 전사체 RNAseq 시퀀싱 결과 샘플 상관관계가 밝혀졌습니다(그림 1C). 공동 발현 유전자 모듈과 표현형 간의 상관관계는 WGCNA에 의해 분석되었습니다(그림 1D). PCA 분석 결과, NA 그룹과 AP 그룹 간에 유의미한 차이가 있음을 보여주었습니다(P .< 0.05) (그림 1E).

차별 유전자의 KEGG 풍부 분석

R 소프트웨어의 clusterProfiler 패키지(버전 4.2.0)를 이용한 KEGG 경로 농축 분석은 질병군 내 상향조절 및 하향 조절된 차별 발현 유전자에 대해 별도로 수행되었다(그림 2A,B). 결과는 이 유전자들이 조혈세포 계통, 류마티스 관절염, 국소 부착, 인테그린 신호전달, 화학민 신호 전달 경로 등 면역 및 염증과 관련된 경로에서 유의하게 풍부함을 보였음을 보여주었습니다.

GSEA 분석

GSEA 분석 결과, 실험군의 핵심 유전자는 주로 상부에서 풍부해져 상향 조절 경향이 나타났습니다(그림 3A). 대조군의 핵심 유전자는 주로 하부에서 농축되어 감소 경향을 보였다(그림 3B). 요약하자면, 염증 유전자는 실험군(ASA)에서 상향 조절되었고, 대조군(NA)에서는 하향 조절되었습니다.

PPI 네트워크 분석

STRING 데이터베이스(버전 11.0)를 사용해 분석한 PPI 네트워크에서는 동일한 클러스터 ID를 공유하는 노드들이 서로 가까이 배치되는 경향이 있습니다. 그림 4A에서 볼 수 있듯이, 이 군집화 결과는 해당 유전자들이 주로 세포 활성화, 염증 반응, 세포 활성화 조절에 관여함을 보여주었습니다. 그림 4B 는 p-값으로 색칠한 동일한 네트워크를 보여주었으며, 유전자가 더 많은 클러스터가 더 중요한 p-값을 보인다.

허브 유전자 식별 및 면역 세포 침투 분석

DEG는 m코드 분석을 위해 선정되었으며, 분석 결과는 주로 아세틸콜린 수용체와 관련된 것으로 나타났습니다(그림 5 및 표 2). Cytoscape의 CytoHubba 플러그인을 이용한 허브 유전자 분석은 면역과 염증과 관련된 상위 20개의 허브 유전자를 확인했습니다(그림 6A, 왼쪽 패널). 상위 10개의 허브 유전자는 CXCR4, CCL4, CCL3, CCL20, CXCL1, CCL5, CXCL8, CD4, CCR2, CCR5로 구성되었습니다(그림 6A, 오른쪽 패널). 허브 유전자와 올링크 염증 패널 92 유전자의 교차 결과, CXCL1, CCL20, TNF, CCL3, CCL4 등 5개의 공통 유전자가 발견되었습니다(그림 6B). CIBERSORT 분석 결과, 질병군과 건강한 대조군 간 면역세포 침투에서 유의미한 차이가 나타났습니다. 대조군과 비교했을 때, 질병군은 M0 대식세포의 비율이 유의하게 높았다(p < 0.05)(그림 6C). 반대로, 질병군에서는 CD8 T 세포, 활성화된 NK 세포, 대부분의 휴식 세포 비율이 유의하게 낮았다(전체 그룹 기준 p. < 0.05)(그림 6C).

허브 유전자의 기능 분석

메타스케이프 데이터베이스를 이용해 허브 유전자의 생물학적 기능을 추가로 분석한 결과, 이 유전자들이 주로 사이토카인 매개 신호 전달 경로와 칼슘 매개 신호 전달과 관련되어 있음을 밝혀냈습니다(그림 7A 및 표 3). 세포 유형 서명을 이용해 허브 유전자의 전사 조절 인자를 풍부하게 하였으며, 허브 유전자는 주로 가오 대장 24W C11 판네스 유사 세포, cui 발달 중인 심장 C8 대식세포, 그리고 중뇌 신경형 hmgl과 관련이 있음을 보여주었다(그림 7B). DisGeNET 데이터베이스의 질병 풍부화 분석은 허브 유전자가 피부 병변, 엡스타인-바르 바이러스 감염, 진드기-뇌염과 연관되어 있음을 보여주었다(그림 7C). PaGenBase 데이터베이스의 조직 특성 풍부화 분석 결과, 허브 유전자는 주로 비장, 혈액, 폐에서 풍부하게 유지되고 있음을 보여주었습니다(그림 7D). 또한 TRRUST 데이터베이스 분석 결과, RELA와 NFKB1이 허브 유전자를 조절하는 주요 전사 인자임이 밝혀졌습니다(그림 7E).

데이터 가용성:

처리된 카운트 매트릭스는 보조 파일(보충 파일 1과 보충 파일 2)로 제공됩니다. 기타 모든 데이터는 기사에 완전히 제시되어 있습니다. 원시 시퀀싱 데이터는 교신저자로부터 합리적인 요청 시 제공됩니다.

그림 1: DEGs 분석. (A) 건강한 플라크 및 동맥경화성 플라크, 유전자 화산 지도 차이, 상향 조절 2097, 하향 조절 1616 (|log2FC| > 1, P .< 0.05). (B) 상위 20개 유전자의 상향 및 하향 발현 유전자의 히트맵 작성. (C) 표본 상관관계 분석. (민주당)공동 발현 유전자 모듈과 표현형 간의 상관관계는 WGCNA에 의해 분석되었습니다. (E) PCA 분석 (NA 그룹은 AP 그룹과 유의하게 차이가 있음). 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 2: KEGG 분석. KEGG 경로 풍부화 분석은 질병군 내에서 상향 조절(A)와 하향조절(B) 차등 발현 유전자에 대해 별도로 수행되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 3: GSEA 분석. (A) GSEA 분석 결과, 실험군의 핵심 유전자는 주로 상부에서 풍부해져 상향 조절 경향이 나타났습니다. (B) 대조군에서는 핵심 유전자가 주로 하부에서 풍부해졌고 감소 추세를 보였다. 결론적으로, 염증 유전자는 실험군(AP)에서 상향 조절되었고, 대조군(NA)에서는 하향 조절되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 4: PPI 네트워크 다이어그램. (A) 클러스터 ID로 색칠됨. 같은 클러스터 ID를 공유하는 노드들이 보통 서로 가까이 위치해 있습니다. (b) 유전자가 더 많은 항목이 더 중요한 P값을 가진 P-값으로 색칠하는 방법. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 5: DEGs의 mcode 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하세요.

그림 6: 허브 유전자 분석. (A) Cytoscape의 CytoHubba 플러그인을 통해 도수 계산법으로 얻은 상위 20개 허브 유전자(왼쪽 패널)와 상위 10개 허브 유전자(오른쪽 패널)로, 주로 면역과 염증과 관련이 있습니다. (B) 허브 유전자와 올링크 염증 패널의 교차 92개 유전자에서 5개의 교차 유전자가 확인되었습니다. (C) CIBERSORT 알고리즘을 사용하여 AP와 NA 그룹 간 22개 면역세포 하위 집합의 침윤 풍부도를 비교하였습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 7: 허브 유전자의 생물정보학 분석. (A) Metascape 데이터베이스를 이용한 허브 유전자의 기능적 주석. (B)세포 유형 서명을 기반으로 허브 유전자와 관련된 전사 조절자의 농축 분석. (C) DisGeNET 데이터베이스를 이용한 허브 유전자의 질병 풍부 분석 (민주당) PaGenBase 데이터베이스를 통해 확인된 허브 유전자의 조직 특이적 발현 패턴. (E) TRRUST 데이터베이스를 이용해 분석한 허브 유전자의 전사 조절 네트워크. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

MCODE	가세요	설명	로그10(P)
MCODE_1	R-HSA-629597	칼슘 투과성이 높은 니코틴 아세틸콜린 수용체	-10.7
MCODE_1	R-HSA-622323	시냅스 전 니코틴 아세틸콜린 수용체	-10.3
MCODE_1	R-HSA-629594	칼슘 투과성이 높은 시냅스 후 니코틴계 아세틸콜린 수용체	-10.3
MCODE_2	R-HSA-1296346	탠덤 기공 도메인 칼륨 채널	-10.3
MCODE_2	가세요:0030322	막 전위 안정화	-9.8
MCODE_2	R-HSA-5576886	4단계 - 휴식막 전위	-9.7

표 1: AP 환자의 기초 특성

MCODE	가세요	설명	로그10(P)
MCODE_1	가세요:0030322	칼슘 투과성이 높은 니코틴 아세틸콜린 수용체	-19.9
MCODE_1	R-HSA-5576886	시냅스 전 니코틴 아세틸콜린 수용체	-19.6
MCODE_1	R-HSA-1296346	칼슘 투과성이 높은 시냅스 후 니코틴계 아세틸콜린 수용체	-16.7

표 2: DEGs의 MCODE 농축 분석.

MCODE	가세요	설명	로그10(P)
MCODE_1	R-HSA-629597	칼슘 투과성이 높은 니코틴 아세틸콜린 수용체	-10.7
MCODE_1	R-HSA-622323	시냅스 전 니코틴 아세틸콜린 수용체	-10.3
MCODE_1	R-HSA-629594	칼슘 투과성이 높은 시냅스 후 니코틴계 아세틸콜린 수용체	-10.3
MCODE_2	R-HSA-1296346	탠덤 기공 도메인 칼륨 채널	-10.3
MCODE_2	가세요:0030322	막 전위 안정화	-9.8
MCODE_2	R-HSA-5576886	4단계 - 휴식막 전위	-9.7

표 3: 허브 유전자의 MCODE 풍부 분석.

보조 파일 1: 대조군 (n=3) 유전자 발현.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충 파일 2: 환자 (n=10) 핵심 표 유전자.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

토론

AP 연구가 지속적으로 심화됨에 따라 AP에서 새로운 사이토카인이 지속적으로 검출되고 있으며, 염증은 AS^21,22의 발생과 발달에 중요한 요인이 되었습니다. 알부민의 활성화는 내피세포와 혈관 내막기질 간의 연결을 끊고 내피세포가 혈관 막막에서 벗어나도록 촉진할 수 있습니다. 유도성 혈관 내막 손상^23,24. 염증은 LDL-C의 산화적 변형을 유도하고, 이 수정된 LDL-C는 동맥 내막 내에서 염증 과정을 일으켜 AP 형성을 가속화합니다²⁵. 불안정한 플라크는 결국 파열되어^{내부 및 외부} 원인을 모두 사용할 때 ACS를 유발할 수 있습니다. 플라크 파열 동안 대식세포, 혈관 평활근 세포(VSMC), 림프구는 백혈구 인터루킨-1(IL-1), IL-6, 혈관간 유착인자 1, 세포간 유착인자 1과 같은 염증 인자를 분비합니다. 동시에 단핵구와 과립구에 작용하는 수용체인 백혈구 인테그린(CD11b/CD18)의 발현이^27,28 증가합니다. 그러나 AP 형성에 이르는 염증의 분자적 기전은 아직 더 탐구되어야 합니다.

염증에 의해 발생하는 AP의 발생 및 발병은 다요인 작용, 다중 유전자 변화, 다단계 질환의 복잡한 과정이며, 특히 많은 유전자의 비정상 발현과 밀접하게 연관되어 있습니다. 이 연구에서 RNA-Seq 및 생물정보학 분석을 통해 건강한 대조 조직과 AP 사이에서 DEGs 화산 플롯에서 2097개의 상향 조절 유전자와 1616개의 하향 조절 유전자가 나타났습니다. DEG에 대한 추가 KEGG 농축 분석 결과, DEGs는 주로 면역 및 염증 관련 경로에 농축되어 있음이 밝혀졌습니다. 허브 유전자 분석은 CXCR4, CCL4, CCL3, CCL20, CXCL1, CCL5, CXCL8, CD4, CCR2, CCR5로 구성되는 상위 10개의 허브 유전자를 확인했습니다. 허브 유전자와 올링크 염증 패널 92 유전자의 교차 결과, CXCL1, CCL20, TNF, CCL3, CCL4 등 5개의 공통 유전자가 발견되었습니다. 이 결과는 염증 관련 인자인 CCL3, CCL4, CXCL1이 AP의 병리학적 과정에서 중요한 역할을 할 수 있음을 시사합니다. 면역 침윤 분석 결과, 플라크 내 CD8⁺ T 세포, 활성화된 NK 세포, 그리고 휴식 중인 비만세포가 감소하는 특징으로 나타나는 독특한 미세 환경이 드러났습니다.

M0 대식세포는 산화된 LDL을 쉽게 내화하고 폼 세포로 분화할 수 있는 미정적 풀을 나타내며, 이는 초기 죽상선 형성의 대표적인 사건입니다²⁹. 질병군에서 관찰된 M0 대식세포 비율이 높다는 것은 플라크 미세환경 내에 이러한 전구세포가 축적되었음을 시사합니다. 주로 활성화된 대식세포와 T 세포에 의해 생성되는 CCL4는 NFκB 신호 경로를 통해 대식세포 활성화를 지속시키고, 부착 분자의 발현을 촉진하며, 기질 금속단백분해효소-2 및 -9를 유도하여 M0 대식세포가 죽상동맥 유발 상태로 전환되도록 돕고 플라크 안정성을 직접적으로 저해합니다³⁰. CD8⁺ T 세포 비율 감소는 CCL3 매개 죽로군 보호 T세포 소집합의 억제를 반영할 수 있습니다. Komissarov 등은 T세포가 주로 CCR5-CCL3 축³¹을 통해 인간 동맥경화성 플라크로의 이동이 일어난다는 것을 입증했습니다. 더욱이 Döring 등은 CCL17이 CCR8을 통해 신호를 보내 CCL3 발현을 유도하고, 이는 조절 T 세포 분화를 억제하는 비정규적 ^{경로를 밝혀} 냈습니다; CD4⁺ T 세포에서 CCL3의 유전적 소작은 FoxP3⁺ Treg 수치를 증가시키고 동맥경화를 제한한 반면, CCL3 투여는 질병을 악화시키고 Treg 분화를 억제했습니다. 이 변화는 동맥경 보호 CD8⁺ 조절 T 세포를 감소시키고 병원성 효과 T 세포를 촉진하여 우리 분석에서 관찰된 CD8⁺ T 세포 비율의 순감소를 초래할 가능성이 큽니다. 활성화된 NK 세포와 휴식 중인 비만세포의 감소는 이 개체군의 절대적인 손실보다는 활성화 상태의 변화를 반영하는 것으로 보입니다. Bonaccorsi 등³³ 은 증상이 있는 경동맥 플라크가 NK 세포 침윤과 IFN-γ 생성을 증가시켜, NK 세포 활성화가 임상 플라크 불안정성과 직접적으로 연결된다고 보고했습니다. 비만세포의 경우, Wezel 등은 활성화된 비만세포에서 방출된 화학물질, 특히 CXCL1이 CXCL1/CXCR2 축을 통해 호중구 모집을 유도하여 진행 중인 염증 반응을 악화시키고 플라크 진행과 불안정화를 촉진^{한다는 것을 입증} 했습니다. 따라서 활성화된 NK 세포와 휴식 중인 비만세포의 비율 감소는 진정한 수치적 고갈보다는 염증성 플라크 환경 내에서 활성화, 탈과립 또는 고갈을 반영하는 것으로 보입니다.

이 연구에는 몇 가지 한계가 있습니다. 첫째, 이 연구는 전사체 시퀀싱에만 기반하고 있으며, 표본 크기가 적어 한계가 있습니다. 제한된 표본 크기 외에도, RNA-seq 프로토콜의 여러 기술적 한계점도 주목해야 합니다. 대량 RNA-seq는 세포 간의 이질성을 가립니다; CCL3, CCL4, CXCL1의 세포 유형 특이적 발현을 해결하기 위해서는 단일 세포 접근법이 필요합니다. 계산 면역 해합성(CIBERSORT)은 추정치만 제공하며 직접적인 측정은 제공하지 않습니다. RNA 풍부도는 항상 단백질 수치와 상관관계가 있는 것은 아닙니다; 직교 검증이 필요합니다. 향후 연구에서는 단세포 전사체학, 더 크고 독립적인 코호트, 직교 단백질 검증을 통해 이러한 한계를 해결해야 합니다.

결론적으로, 본 연구 결과는 AP의 병태생리학적 과정에서 염증 인자가 중요한 역할을 함을 강조하였습니다. 더 나아가, 우리는 CCL3, CCL4, CXCL1 허브 유전자를 확인하여, M0 대식세포 축적을 촉진하고, 보호하는 T세포 소집합을 억제하며, NK 세포와 비만세포의 활성화 상태를 변화시켜 죽상동맥경화를 촉진하는 협동 화학신경망을 형성할 수 있습니다. 전반적으로 이 발견들은 세 가지 화학민주가 플라크 면역 미세환경의 중요한 조절자이자 잠재적 치료 표적임을 강조합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
트리졸	인비트로젠	15596026CN	RNA 추출
나노드롭 ND-2000 분광광도계	써모피셔 사이언티브	ND2000	RNA 농도 검출
애질런트 2100 바이오분석기	애질런트	G2939BA	RNA 품질 관리
일루미나 하이세익 TM 2000	일루미나	하이세쿼 2000	전사체 시퀀싱
올리고 D (T) 자기 구슬	뉴잉글랜드 바이오랩스	S1550S	RNA 농축