중화성 항체 역가 측정을 위한 형 간염 E 바이러스 형광 감소 중화 검사

Summary

비세포병리성 양성 가닥 RNA 바이러스인 Hepatitis E 바이러스(HEV)에 대한 표준 바이러스 중화법은 존재하지 않습니다. 여기서는 형광 표지된 바이러스 캡시드 단백질의 정량화를 기반으로 한 형광 감소 중화 검사(FRNT)를 설명하여 항-HEV 항체의 효능을 평가합니다.

Abstract

바이러스 중화 분석법은 해당 바이러스에 대한 항체 또는 여러 항체 혼합물의 중화 가능성을 측정합니다. 이는 바이러스에 대해 개발된 백신 후보와 중화 항체의 효능을 평가하는 데 매우 유용한 기법입니다. 플라크 감소 중화검사(PRNT)는 바이러스 특이적 중화항체의 역가를 평가하는 데 널리 사용되는 방법입니다. 그러나 비세포병증 바이러스의 경우에는 PRNT가 현실적이지 않습니다. E형 간염 바이러스(HEV)는 헤페바이러스과에 속하는 양성 의미의 단일 가닥 RNA 바이러스입니다. 전 세계적으로 급성 바이러스성 간염의 주요 원인입니다. 포유류 세포 배양에서는 세포병리적 효과를 보이지 않습니다. 중국에서는 HEV 백신이 사용 가능합니다. 하지만 전 세계 대부분 지역에서는 HEV에 대한 백신이나 치료용 항체가 구할 수 없습니다. 여러 연구소가 HEV에 대한 백신 후보를 연구하고 있습니다. HEV 백신의 효능을 측정하는 중화 분석법은 연구자들에게 매우 유용한 도구가 될 것입니다. 여기서는 항HEV 항체의 50% 중화 역가(NT₅₀)를 추정하기 위한 형광 감소 중화 검사(FRNT)를 설명합니다. 항HEV ORF2 중화 또는 토끼 IgG 중화 HEV가 Huh7 세포를 감염시키고, 이어서 바이러스 ORF2 단백질의 면역형광 염색이 이루어졌습니다. ImageJ 적용에서 형광 양성 세포가 정량화되었으며, NT₅₀ 은 2.1 x 10³으로 추정되었습니다. 이 방법은 면역 생쥐 혈청, HEV 회수된 개별 혈관, 실험실에서 생산된 항HEV 항체에 존재하는 항-HEV 항체의_NT-50 을 추정하는 데 적용될 수 있습니다.

Introduction

E형 간염 바이러스(HEV)는 헤페바이러스과에 속하는 양성 단가루 RNA 바이러스입니다. ^1,2. 보통 자가 제한성 급성 간염을 유발하지만, 면역억제 환자에게는 만성 간염을 유발할 수 있습니다 ^3,4. 임산부는 폭발성 간부전이 발생할 위험이 높으며, 사망률은 최대 30%까지 증가합니다^5. 세계보건기구(WHO)는 2021년 전 세계적으로 약 1,947만 건의 급성 E형 간염(AHE) 사례와 3,450명의 사망자를 보고했습니다. HEV는 주로 위생 상태가 열악해 오염된 식품과 물을 통해 전파되며, 선진국에서는 산발적인 직업 감염이 생고기나 덜 익은 고기 섭취와 관련이 있습니다^. HEV는 8가지 유전자형으로 분류됩니다. 유전자형 (g) 1-및 g2-HEV는 오직 인간에게만 감염됩니다. g3-및 g4-HEV는 인간, 토끼, 돼지, 멧돼지, 사슴 등 다양한 숙주를 가지고 있습니다. g5와 g6-HEV는 멧돼지에, g7과 g8-HEV는 낙타에 감염시킵니다. 중동에서는 낙타고기와 우유를 섭취한 인체 전파 사례가 단 한 건 보고^{되었습니다.} HEV 감염은 주로 저소득에서 중간소득 국가에서 흔합니다. 남아시아와 동남아시아, 아프리카, 멕시코의 풍토병 지역에서 주로 g1에 의해 발생하고 g2-HEV 감염에 의한 경우는 드물게 발생한 수인성 발병이 보고되었습니다. 유럽과 동아시아의 선진국에서 직업성 산발성 감염 사례는 주로 g3-HEV ^6,7에 의해 발생합니다.

HEV 게놈은 7.2 kb 플러스 가닥 RNA로, 5′ 말단에 7-메틸구아닌 캡, 세 개의 개방 판독 프레임(ORF), 그리고 폴리 아데닐화 3' 끝을 포함합니다. ORF1은 비구조 다단백질을 암호화하며, 메틸트랜스퍼라제(Met), Y-도메인, 파팽 유사 시스테인 프로테아제(PCP), V-도메인, 거대 도메인(X-도메인), 헬리케이스(Hel), RNA 의존성 RNA 중합효소(RdRp)로 구성되어 있습니다. ORF2는 바이러스 캡시드 조립을 담당하는 캡시드 단백질을 암호화합니다. ORF3는 바이러스 배출을 돕는 인산화단백질을 암호화하여 바이러스 배출을 돕^습니다. 추가로 개방형 읽기 프레임인 ORF4가 g1-HEV에 존재하며, 이는 ORF1 내에 위치한 내부 리보솜 진입 부위 유사 요소를 사용하여 캡과 독립적인 메커니즘 을 통해 번역됩니다. ORF4 발현은 소포체 스트레스 유발 화합물에 의해 증강됩니다. ORF4는 g1-HEV 복제 복합체 조립¹⁰을 촉진하는 것으로 제안되었습니다.

HEV는 시험관 내에서 효율적으로 복제되지는 않지만, E 간염 환자로부터 분리된 일부 바이러스 균주는 간세포, 폐 세포주, 대장 상피 세포주¹¹에서 성공적으로 전파되었습니다. 하지만 배양된 세포 내에서 바이러스를 강력하게 증식시키기는 어렵습니다. g1-HEV 균주(Sar55 균주)의 감염성 cDNA 클론은 시험관 내 연구에 사용되었으나, 배양 세포에서 g1-HEV 균주를 효율적으로 생산하고 전파하는 데는 아직 성공하지 못했습니다. 일부 g3-및 g4-HEV 균주는 배양된 세포에서 더 잘 성장합니다¹². 그럼에도 불구하고, 시험관 내에서 전사되고 캡이 된 p6 HEV 유전체 RNA를 형질감염한 세포에서 정제된 바이러스만으로는 다중 검사에 충분하지 않습니다. 게다가 모든 세포 배양에서 생성된 HEV 입자는 준 포위층 형태를 띠고 있어 감염성에 영향을 미칩니다. 반면, 오염된 음식과 물에서 발견되는 HEV는 비외막 형태이며 매우 전염성이 강합니다. 환자 대변에 존재하는 HEV는 비포막이며, 자연 감염의 흔한 원인입니다. 따라서 환자 대변에서 정제한 HEV를 사용하면 포유류 세포 배양 시스템에서 효율적인 감염을 보장합니다. 이전 연구들은 환자 대변 정제 g1-HEV가 인간 간종 세포 내 바이러스 복제를 정량하는 데 있어 신뢰성을 입증했습니다(Huh7). -80°C에 저장된 정제 바이러스는 수년간 감염성을 유지하며, 바이러스 복제 횟수를 추정하는 데 여러 독립 연구에서 사용되어 ^{왔습니다.} 이 연구는 환자에게서 얻은 정제된 g1-HEV를 사용하여 HEV 중화 검사법을 설계하였습니다. 바이러스는 정제, 역정, 특성 분석 후 -80°C에 알리코트에 저장되어 중화 분석법에 사용될 예정이다. HEV는 세포병리성이 없기 때문에 전통적인 PRNT 방법은 항HEV 항체의 바이러스 중화 잠재력을 추정하는 데 유용하지 않습니다. HEV에 대한 중화 분석법 개발을 위한 여러 시도가 있었는데, 여기에는 유세포분석 기반 중화 분석법, 세포 상청액에 분비되는 pORF2를 검출하는 항원 ELISA 키트 기반 중화 분석법, 시험관 내 ELISA 기반 결합 분석법, RT-PCR 기반 분석법, 형광 기반 중화 분석^{법 16,17,18,19,20} 등이 포함됩니다. ELISA 기반 분석법은 항체 결합을 간접적으로 감지하여 바이러스의 기능적 중화 효과를 평가하지만, 실제 감염 여부는 측정할 수 없습니다. 유동세포분석 기반 방법은 일반적으로 가짜바이러스를 이용해 감염된 세포의 비율을 측정합니다. RT-PCR 기반 중화법은 FRNT보다 더 복잡하며; 따라서 취급 오류 가능성이 더 높습니다. 반면, 여기서 설명하는 FRNT 방법은 고역가 감염성 바이러스와 영상 기술의 가용성에 의해 제한됩니다. 그럼에도 불구하고 항HEV 항체의 NT₅₀을 측정하는 효율적인 방법이다.

Protocol

기관윤리위원회(IEC)는 뉴델리 AIIMS 소화기내과에 입원한 HEV 감염 환자의 대변 샘플 채취 승인을 받았습니다. 연구에 참여한 환자들로부터 사전 동의를 받았습니다. 시약과 사용 장비의 세부 사항은 재료표에 기재되어 있습니다.

1. 바이러스 분리 및 정량화

1. 동의 하에 HEV 감염 환자의 대변 샘플을 채취하여 바이러스 정제를 진행하세요.
2. 대변 샘플을 Dulbecco의 인산염 완충 생리염수(DPBS)에 최종 농도(w/v) 10%로 재현탁하고, 7800 x g 원심분리기를 4°C에서 1시간 동안 보관합니다.
   참고: HEV 대변 샘플을 다룰 때는 장갑을 착용하고, 작업 후에는 작업 공간을 70% 에탄올로 청소하세요(모든 과정을 바이오세이프 캐비닛 안에서 수행하세요).
3. 상정액을 수집하여 0.45 μm 필터를 통과시킵니다.
4. 바이러스 상원액에 0.4 M NaCl로 조제한 8%PEG6000을 첨가하고 0°C에서 16시간 배양합니다.
5. 샘플을 18,000 x g 에서 4 °C에서 30분간 원심분리합니다.
6. 상청액을 제거하고 펠릿을 40mL Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)에 재현탁합니다.
7. 30 kDa 멤브레인 카트리지를 사용해 접선 유동 여과(TFF)를 사용하여 현탁액을 5 mL 부피로 농축합니다. 바이오세이프티 캐비닛 내부의 0.2 μm 필터를 통해 필터링한 후 알리코트를 만들어 -80 °C에서 보관합니다. 하나의 알리코트를 사용해 총 RNA를 분리하고 RT-qPCR을 수행하세요.
8. pSK-HEV2 플라스미드[g1-HEV 감염성 클론의 cDNA 포함 bBluscript 벡터(Genbank ID: AF444002.1]) (10배 연속 희석 시 1ng에서 0.000001 ng DNA/반응) 다중 희석을 사용하여 바이러스 RNA 정량 표준을 그립니다.
9. x축에 pSK-HEV2 DNA 양을, Y축에 해당 Ct 값을 표시해 그래프를 그립니다. 표준 플롯에서 바이러스 RNA 농도를 추정합니다.
10. 표준 플롯에서 HEV 유전체 RNA 수준을 정량화하고, 다음 공식으로 바이러스의 유전체 복제 수를 계산합니다: 복제 수 = ng*(수/몰) / 염기수 *(ng/g)*(g/몰 염기).

2. Huh7 세포의 g1-HEV 감염

1. Huh7 세포가 들어 있는 T75 플라스크를 가져가세요. 현미경으로 세포가 하나로 연결되어 있고 건강한지 확인하세요.
2. 흡입기로 매질을 제거하세요(생물안전 캐비닛의 모든 단계를 수행). 10mL DPBS를 넣고 휘저으며 제거하세요.
3. 0.05% 트립신 용액 1mL를 추가하여 표면에 고르게 발라지도록 합니다.
4. CO2 인큐베이터 안에서 30–60초 동안 배양하여 세포가 90% 분리될 때까지 보관합니다.
5. 5mL의 완전한 배지를 추가하여 T75 전체 표면에 고르게 펴고, 여러 번 피펫을 사용해 응집체 없는 균일한 단일 세포 집단을 만듭니다.
6. 세포 현탁액을 50mL 원뿔형 튜브로 옮기고, 200 x g 에서 실온에서 5분간 원심분리합니다.
7. 바이오세이프티 캐비닛 내부의 원뿔형 튜브에서 배양지를 흡인하세요.
8. 튜브에 5mL의 완전한 배지를 추가하고, 부드럽게 피펫팅하여 세포를 균일하게 현탁합니다.
9. 10 μL 세포 현탁액을 세포 카운터 슬라이드 위에 올려 놓으세요. 세포를 4사분면으로 세고, 평균/mL를 계산하세요.
10. 씨앗 0.5 x 10 6개의 6 세포/웰을 2 mL DMEM(10% FBS 보분)에 넣었습니다.
11. 다음 날, 배지를 제거하고 1 mL DPBS에 세척한 후, 50 μL g1-HEV 바이러스(정제된 g1-HEV 4 유전체 복사본 4.5 × 10개)를 1 mL 무혈청 배지(SFM)에 첨가합니다.
12. 세포를 5%_CO2 인큐베이터에서 37°C에서 1시간 배양합니다.
13. 세포를 500 μL DPBS로 세척한 후, 2mL의 완전 배지(DMEM에 2% FBS를 보충)를 추가합니다.
14. 세포를 37°C의 5%_CO2 인큐베이터에서 72시간 배양합니다.
15. 하류 분석으로 진행하세요.

3. RT-qPCR 분석법

1. 6-웰 플레이트에서 배지를 제거하고(2.15단계), 세포를 1 mL DPBS로 세척합니다.
2. 6웰 플레이트에 1mL TRI 시약을 직접 첨가하여 세포를 용해합니다. 용해액을 여러 번 위아래로 피펫팅한 후 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
   참고: TRI 시약은 흡입, 삼키거나 피부에 닿으면 독성이 있습니다. 시약을 사용할 때는 보호용 장갑을 착용하고, 흡입 증기를 피하세요. 가능하면 화학 후드 안에서 사용하세요. 모든 플라스틱 제품은 RNAse 프리 등급이어야 합니다.
3. 샘플을 실온에서 5분간 배양하세요. 0.2mL 클로로포름을 추가하고 튜브를 단단히 밀봉한 후 10–15초간 소용돌이를 돌립니다(클로로포름은 유해하고 독성이 있으니 적절한 개인 보호 장비로 다루세요). 2–3분 동안 부양하세요.
4. 샘플을 12,000 × g, 4 °C에서 15분간 원심분리합니다. 수용상을 새로운 1.5 mL 마이크로 원심분리관으로 옮깁니다. 수상에 이소프로판올 0.5mL를 넣고, 튜브를 몇 번 뒤집어 잘 섞으세요.
5. 상온에서 10분간 부화하세요.
6. 원심분리기에서 12,000 × g, 4 °C에서 10분간 원심분리기. 상원액은 버리세요.
7. 펠릿을 75% 에탄올 1mL에 재현탁합니다. 원심분리기에서 7500 g × 4 °C에서 5분간 원심분리기. 상원액은 버리세요.
8. RNA 펠릿을 5분에서 10분 정도 자연 건조하세요.
9. 펠릿을 50 μL 무핵효소수(NFW)에 재현탁하고, 55 °C에서 10분간 배양한 뒤, 손으로 두드려 혼합하고, 분광광도계로 RNA 농도를 측정합니다.
10. 다음 프라이머를 사용하여 TaqMan 프로브 기반 1단계 RT-qPCR을 수행합니다:
    g1-HEV FP: 5′TATACTCGAGGGTGCCGATCGGTCCC3′;
    g1-HEV RP: 5′TATACCATGGCATCTGGCAGCAAGCTCAG3′;
    g1-HEV 프로브: 5′[FAM] TTGACGCCTGGGAGGGGAATCACC [BHQ1]3′; 리보뉴클레아제 P (RP) FP: 5′AGATTTGGACCTGCGAGCG3′;
    RP RP: 5피트 GAGCGGCTGTCTCCACAAGT3';
    RP 프로브: 5′[FAM]TTCTGACCTGAAGGCTCTGGCG[BHQ1]3′.
11. 2^−ΔΔCT 방법을 사용하여 g1-HEV RNA의 상대적 정량화를 계산합니다.

4. 면역형광 검사(IFA)

1. 앞서 설명한 대로 Huh7 셀을 분리합니다.
2. 현미경용 유리 커버슬립을 12웰 플레이트에 넣고, 1mL 완전 배지(DMEM에 10% FBS 보조)에 0.2 ×⁶ 셀/우물 10개를 시딩합니다.
3. 정제된 g1-HEV 1.8×¹⁰ 4개의 유전체 복사본을 500 μL SFM에 감염시킵니다. 세포를 5%_CO2 인큐베이터에서 37°C에서 1시간 배양합니다.
4. 세포를 500 μL DPBS로 세 번 세척합니다.
5. 완전 배지 2mL(DMEM에 2% FBS 보조)를 추가하세요.
6. 세포를 5%_CO2 인큐베이터, 37 °C에서 72시간 배양합니다.
7. 세포를 500 μL DPBS로 세 번 세척하고, 각 세척 사이에 실온에서 5분간 배양합니다.
8. 세포에 500 μL 4% PFA(파라포름알데히드)를 첨가하고 상온에서 20분간 배양합니다.
   참고: 4% PFA는 흡입 시 해롭고, 피부와 눈 자극을 유발하며, 알레르기성 피부 반응을 일으킬 수 있습니다. 안전을 위해 시약을 사용할 때는 보호장갑과 안구 보호구를 착용하고 증기를 흡입하지 않도록 하세요.
9. 세포를 500 μL DPBS로 세 번, 각각 5분씩 세척한 후 DPBS에서 30분간 배양합니다.
10. 세포에 250 μL 차단액(5% 일반 염소 혈청, 0.5% BSA, 0.3% Triton X-100 in DPBS)을 추가하고 실온(RT)에서 1시간 배양합니다.
11. 차단액을 제거하고 500 μL DPBS로 한 번 세척한 후, 250 μL 1차 항체(DPBS, 0.3% Triton X-100, 5% BSA, 0.5% 일반 염소 혈청, 항-ORF2 항체 또는 토끼 IgG 1:500 희석)로 4°C에서 배양합니다.
12. 세포를 500 μL DPBS로 세 번, 각각 5분씩 세척하세요.
13. 세포를 2차 항체(DPBS, 0.3% Triton X-100, 5% BSA, 0.5% 일반 염소 혈청, 염소 항변제 Alexa fluor 594 1:1000 희석)로 1시간 동안 RT 시에서 배양합니다.
14. 세포를 DPBS로 세 번씩 각각 5분씩 세척하세요. 유리 슬라이드에 DAPI(4′,6-디아미디노-2-페닐린돌) 용액이 포함된 Prolong 금 안티페이드 시약 10 μL를 첨가합니다. 커버슬립을 포함하는 셀을 유리 슬라이드에 DAPI 용액을 향하게 하여 기포를 피하세요.
15. 커버슬립을 네일 페인트로 밀봉하세요.
16. 60배 대물렌즈를 가진 공초점 현미경에서 형광 이미지를 획득하세요.
17. 형광 신호 시각화 및 획득을 위해 현미경을 설정하세요.
18. 먼저, 슬라이드에서 모의 세포(감염되지 않은 세포)에 해당하는 핵을 60배 배율로 초점을 맞추세요. 역치 전압과 레이저를 조정하여 배경 형광 신호가 보이지 않도록 하세요. 대조군 항체(토끼 IgG) 염색된 슬라이드를 확인하고 배경 형광 신호가 보이지 않는지 확인하세요.
19. 위 매개변수를 변경하지 않고 HEV 감염 세포의 슬라이드를 시각화할 수 있습니다. 1028 x 1028 픽셀 크기의 이미지를 획득하세요.

5. 형광 감소 중화 시험(FRNT)

1. Huh7 세포의 바이러스 중화 및 감염
   1. 앞서 설명한 대로 Huh7 셀을 분리합니다. 커버슬립을 12웰 플레이트에 넣고 1mL 완전 배지(DMEM + 10% FBS)에 0.2× 10개의⁶ 셀/웰을 시딩합니다.
   2. 다음 날, 항체(항-ORF2 및 토끼 IgG)를 SFM에서 10배 연속 희석하여 25 μg/mL 시작 농도를 1:10 단계에서 1:10 5 희석까지 준비합니다. 최종 희석 부피는 100 μL이어야 합니다.
   3. 각 항체 희석액에 정제된 g1-HEV에 해당하는 1.8 x 10 4^{개의 유전체} 복사본을 추가합니다.
   4. 항체와 바이러스 혼합물을 5%_CO2 인큐베이터, 37°C에서 1시간 배양하세요.
   5. 전날 씨앗된 Huh7 세포가 포함된 12웰 플레이트를 제거하고 500 μL DPBS로 세포를 세척합니다.
   6. 항체-바이러스 혼합물을 세포에 첨가하고 플레이트를 37°C에서 5%_CO2 인큐베이터에 1시간 동안 넣습니다.
   7. 세포를 500 μL DPBS로 세척하세요.
   8. DMEM + 2% FBS 배지를 세포에 첨가하고, 37°C에서 5%_CO2 인큐베이터에서 72시간 배양합니다.
   9. 4절(4.7단계 이후)에서 언급한 대로 IFA를 수행하세요.
   10. 10배 대물렌즈를 사용해 1028 x 1028 픽셀의 5개의 무작위 필드의 형광 이미지를 획득합니다.
   11. 이미지를 JPEG/TIFF 형식으로 저장하세요. 아래에 설명된 ImageJ 분석을 사용하여 형광 반점을 정량화합니다.
   12. ImageJ에서 이미지를 분석하려면 RGB 이미지를 8비트 이미지로 변환하세요. 이미지를 클릭> 8비트 > 입력하세요.
   13. 이미지의 임계값을 조정하세요. 이미지를 클릭> 임계값을 조정>. 하한 임계값은 40, 상한 임계값은 255로 선택하세요.
   14. 카운트를 하려면 분석> 입자 분석(Analyze)을 선택하세요. 결과 표시, 결과 명확, 요약, 가장자리 제외, 복합 ROI를 선택하세요. 관리자에 추가를 해제하고, 구멍을 포함시키고, 오버레이하세요. 확인 버튼을 누르면 형광 점이 표시됩니다.
2. NT₅₀ 추정치
   1. 다음 공식을 사용하여 각 희석의 % 중화율을 계산합니다:
      % 중화= 100-[(희석된 ORF2 양성 세포)⁄(바이러스 대조군의 ORF2 양성 세포)) X 100]
   2. 다음 공식으로 NT₅₀ 을 계산하세요:
      로그₁₀(NT₅₀) = 로그₁₀D1+(50-N1 ⁄ N2-N1) X (로그₁₀D2-로그₁₀D1)
      여기서 D1 = 희석 시 중화율 비율이 50 미만임
      D2 = 희석 시 중화율 비율이 50을 초과함
      N1= 50 이하 중화율 %
      N2= 50 이상의 중화율 %
   3. 로그₁₀ NT₅₀ 의 안티로그 계산은 공식을 사용한다:
      신약₅₀= 10^{로그₁₀ (신약₅₀)}
   4. 모든 필드의 (평균±SD) 그래프를 그립니다.

Results

Huh7 세포의 g1-HEV 감염과 바이러스 특성 분석

g1-HEV는 일련의 단계를 거쳐 대변 샘플에서 분리되었으며, 이는 그림 1A에 나타난 것입니다. 정제된 g1-HEV의 유전체 복제 수는 RT-qPCR로 추정되었고, 이후 -80 °C에서 저장되었습니다. 바이러스 감염과 복제를 확인하기 위해, Huh7 세포는 정제된 g1-HEV 스톡의 1.8 ×⁴ 유전체 복제 상당량 1.8 4 유전체 상당량으로 72시간 동안 감염시킨 후 RT-qPCR과 IFA를 시행하였다. 감염된 세포에서 모조 감염 세포에 비해 g1-HEV RNA의 유의미한 수준이 검출되었습니다(그림 2A). 마찬가지로, 항-ORF2 항체를 사용한 IFA는 감염된 Huh7 세포에서 ORF2 발현을 확인했습니...

Discussion

FRNT는 항체의 중화 가능성을 추정하기 위한 면역염색 기반 방법입니다. 뎅기열바이러스(DENV), 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스-2(SARS-CoV-2), 일본 뇌염 바이러스(JEV)를 포함한 여러 바이러스에 대한 항체 NT₅₀ 값을 추정하는 데 사용되었습니다23,24,25. 이 방법에서는 바이러스를 테스트 항체(또는 세라)와 함께 배양한 후, 혼합물로 배양된 세포를 감염시킵니다. 감염된 세포는 바이러스 복제가 검출될 수 있도록 상당한 시간 동안 배양됩니다. 마지막으로, 세포는 바이러스 특이적 항체로 면역염색됩니다; 감염된 세포의 비율을 정량화하여 병행 처리된 항체-바이러스 감염 샘플과 비교합니다. 테스트 항체가 바이러스를 중화시키면 감염된 세포 비율이 감소하여 테스트 항체의 중...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL 마이크로퓨지 튜브	Axygen	MCT-150-C
12웰 세포 배양 접시	Corning	3512
37도 인큐베이터 셰이커	Thermo Scientific	50163013
4′,6-다이아미디노-2-페닐인돌	Abcam	AB104139	DAPI
50mL 원심분리기 튜브	Falcon	352070
6웰 세포 배양 접시	Corning	3516
알렉사 플루어 594 이차 IgG 항체	Thermo Scientific	A-11012
Anti-ORF2 항체	Genscript	NA	Genscript에서 주문 합성하여 우리 연구실에서 특성화14
항토끼 IgG 항체	Genscript	NA
소 혈청 알부민	HIMEDIA	MB083	BSA
공초점 현미경	Olympus	FV3000
DMEM, 고 포도당	HIMEDIA	AL007A
태아 소 혈청	GIBCO	16000-044	FBS
ImageJ 1.54g	ImageJ.org (Wayne Rasband 및 기여자, NIH, 미국)
정상 염소 혈청	HIMEDIA	RM-10701
파라포르말데히드	HIMEDIA	GRN3660	PFA
인산 완충 식염수 pH 7.4	HIMEDIA	TL1006	PBS
폴리에틸렌글리콜 6000	SIGMA	81255	PEG6000
SOLIScript 1-step Probe Kit	SOLIS BIODYNE	08-57-00250
TRI 시약	Molecular Research Centre	TR118
트리톤 X100	SIGMA	X100
트립신-EDTA	GIBCO	25300-54