Method Article

중화성 항체 역가 측정을 위한 형 간염 E 바이러스 형광 감소 중화 검사

DOI:

10.3791/69892

⸱

May 22nd, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Virology Laboratory, Centre for Virus Research, Therapeutics and Vaccines, Translational Health Science and Technology Institute, 2Department of Gastroenterology, All India Institute of Medical Sciences, New Delhi

In This Article

Summary

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비세포병리성 양성 가닥 RNA 바이러스인 Hepatitis E 바이러스(HEV)에 대한 표준 바이러스 중화법은 존재하지 않습니다. 여기서는 형광 표지된 바이러스 캡시드 단백질의 정량화를 기반으로 한 형광 감소 중화 검사(FRNT)를 설명하여 항-HEV 항체의 효능을 평가합니다.

Abstract

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바이러스 중화 분석법은 해당 바이러스에 대한 항체 또는 여러 항체 혼합물의 중화 가능성을 측정합니다. 이는 바이러스에 대해 개발된 백신 후보와 중화 항체의 효능을 평가하는 데 매우 유용한 기법입니다. 플라크 감소 중화검사(PRNT)는 바이러스 특이적 중화항체의 역가를 평가하는 데 널리 사용되는 방법입니다. 그러나 비세포병증 바이러스의 경우에는 PRNT가 현실적이지 않습니다. E형 간염 바이러스(HEV)는 헤페바이러스과에 속하는 양성 의미의 단일 가닥 RNA 바이러스입니다. 전 세계적으로 급성 바이러스성 간염의 주요 원인입니다. 포유류 세포 배양에서는 세포병리적 효과를 보이지 않습니다. 중국에서는 HEV 백신이 사용 가능합니다. 하지만 전 세계 대부분 지역에서는 HEV에 대한 백신이나 치료용 항체가 구할 수 없습니다. 여러 연구소가 HEV에 대한 백신 후보를 연구하고 있습니다. HEV 백신의 효능을 측정하는 중화 분석법은 연구자들에게 매우 유용한 도구가 될 것입니다. 여기서는 항HEV 항체의 50% 중화 역가(NT50)를 추정하기 위한 형광 감소 중화 검사(FRNT)를 설명합니다. 항HEV ORF2 중화 또는 토끼 IgG 중화 HEV가 Huh7 세포를 감염시키고, 이어서 바이러스 ORF2 단백질의 면역형광 염색이 이루어졌습니다. ImageJ 적용에서 형광 양성 세포가 정량화되었으며, NT50 은 2.1 x 103으로 추정되었습니다. 이 방법은 면역 생쥐 혈청, HEV 회수된 개별 혈관, 실험실에서 생산된 항HEV 항체에 존재하는 항-HEV 항체의NT-50 을 추정하는 데 적용될 수 있습니다.

Introduction

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E형 간염 바이러스(HEV)는 헤페바이러스과에 속하는 양성 단가루 RNA 바이러스입니다. 1,2. 보통 자가 제한성 급성 간염을 유발하지만, 면역억제 환자에게는 만성 간염을 유발할 수 있습니다 3,4. 임산부는 폭발성 간부전이 발생할 위험이 높으며, 사망률은 최대 30%까지 증가합니다5. 세계보건기구(WHO)는 2021년 전 세계적으로 약 1,947만 건의 급성 E형 간염(AHE) 사례와 3,450명의 사망자를 보고했습니다. HEV는 주로 위생 상태가 열악해 오염된 식품과 물을 통해 전파되며, 선진국에서는 산발적인 직업 감염이 생고기나 덜 익은 고기 섭취와 관련이 있습니다. HEV는 8가지 유전자형으로 분류됩니다. 유전자형 (g) 1-및 g2-HEV는 오직 인간에게만 감염됩니다. g3-및 g4-HEV는 인간, 토끼, 돼지, 멧돼지, 사슴 등 다양한 숙주를 가지고 있습니다. g5와 g....

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Protocol

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기관윤리위원회(IEC)는 뉴델리 AIIMS 소화기내과에 입원한 HEV 감염 환자의 대변 샘플 채취 승인을 받았습니다. 연구에 참여한 환자들로부터 사전 동의를 받았습니다. 시약과 사용 장비의 세부 사항은 재료표에 기재되어 있습니다.

1. 바이러스 분리 및 정량화

  1. 동의 하에 HEV 감염 환자의 대변 샘플을 채취하여 바이러스 정제를 진행하세요.
  2. 대변 샘플을 Dulbecco의 인산염 완충 생리염수(DPBS)에 최종 농도(w/v) 10%로 재현탁하고, 7800 x g 원심분리기를 4°C에서 1시간 동안 보관합니다.
    참고: HEV 대변 샘플을 다룰 때는 장갑을 착용하고, 작업 후에는 작업 공간을 70% 에탄올로 청소하세요(모든 과정을 바이오세이프 캐비닛 안에서 수행하세요).
  3. 상정액을 수집하여 0.45 μm 필터를 통과시킵니다.
  4. 바이러스 상원액에 0.4 M NaCl로 조제한 8%PEG6000을 첨가하고 0°C에서 16시간 배양합니다.
  5. 샘플을 18,000 x g 에서 4 °C에서 30분간 원심분리합니다.

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Results

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Huh7 세포의 g1-HEV 감염과 바이러스 특성 분석

g1-HEV는 일련의 단계를 거쳐 대변 샘플에서 분리되었으며, 이는 그림 1A에 나타난 것입니다. 정제된 g1-HEV의 유전체 복제 수는 RT-qPCR로 추정되었고, 이후 -80 °C에서 저장되었습니다. 바이러스 감염과 복제를 확인하기 위해, Huh7 세포는 정제된 g1-HEV 스톡의 1.8 ×4 유전체 복제 상당량 1.8 4 유전체 상당량으로 72시간 동안 감염시킨 후 RT-qPCR과 IFA를 시행하였다. 감염된 세포에서 모조 감염 세포에 비해 g1-HEV RNA의 유의미한 수준이 검출되었습니다(그림 2A). 마찬가지로, 항-ORF2 항체를 사용한 IFA는 감염된 Huh7 세포에서 ORF2 발현을 확인했습니.......

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Discussion

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FRNT는 항체의 중화 가능성을 추정하기 위한 면역염색 기반 방법입니다. 뎅기열바이러스(DENV), 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스-2(SARS-CoV-2), 일본 뇌염 바이러스(JEV)를 포함한 여러 바이러스에 대한 항체 NT50 값을 추정하는 데 사용되었습니다23,24,25. 이 방법에서는 바이러스를 테스트 항체(또는 세라)와 함께 배양한 후, 혼합물로 배양된 세포를 감염시킵니다. 감염된 세포는 바이러스 복제가 검출될 수 있도록 상당한 시간 동안 배양됩니다. 마지막으로, 세포는 바이러스 특이적 항체로 면역염색됩니다; 감염된 세포의 비율을 정량화하여 병행 처리된 항체-바이러스 감염 샘플과 비교합니다. 테스트 항체가 바이러스를 중화시키면 감염된 세포 비율이 감소하여 테스트 항체의 중.......

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Disclosures

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저자들은 상충하는 이해관계가 없다고 선언한다.

Acknowledgements

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이 연구는 인도 정부 생명공학부 산하 생명공학 산업 연구 지원 위원회의 보조금으로 부분적으로 지원되었으며, MS, S, BN에 수여되었습니다. MS 실험실의 연구는 Translational Health Science and Technology Institute의 핵심 보조금으로 지원받고 있습니다. SA는 인도 정부 인도 의학 연구 위원회가 지원하는 프로젝트 연구 과학자 직책의 지원을 받고 있습니다. UB는 인도 정부 생명공학부의 선임 연구 펠로우십의 지원을 받고 있습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL 마이크로퓨지 튜브악시겐MCT-150-C
12웰 세포 배양 접시코닝3512
37도 인큐베이터 셰이커써모 사이언티픽50163013
4′,6-디아미디노-2-페닐린돌앱캠AB104139다피
50mL 원심분리기 튜브팔콘352070
6웰 세포 배양 접시코닝 3516
알렉사 가루 594 2차 IgG 항체써모 사이언티픽A-11012
항-ORF2 항체GenscriptNAGenscript에서 맞춤 합성하고 우리 실험실에서 특성화14
항토끼 IgG 항체GenscriptNA
소 혈청 알부민히메디아MB083BSA
공초점 현미경올림포스FV3000
DMEM, 고혈당히메디아AL007A
태아 소 혈청GIBCO16000-044FBS
이미지J 1.54gImageJ.org (웨인 라스밴드 및 기고자, NIH, 미국)
일반 염소 혈청히메디아RM-10701
파라포름알데히드히메디아GRN3660PFA
인산염 완충 식염수 pH 7.4히메디아TL1006PBS
폴리에틸렌글리콜 6000시그마81255PEG6000
SOLIScript 1-step 프로브 키트솔리스 바이오다인08-57-00250
TRI 시약분자 연구 센터TR118
트라이튼 X100시그마X100
트립신-EDTAGIBCO25300-54

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Smith, D. B., et al. International Committee on Taxonomy of Viruses Hepeviridae Study Group. Consensus proposals for classification of the family Hepeviridae. J Gen Virol. 95 (Pt 10), 2223-2232 (2014).
  2. Nan, Y., Zhang, Y. J. Molecular biology and infection of hepatitis E virus. Fron....

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