Ambystoma mexicanum 모델에서 두개안면 조직 재생 연구를 위한 하악 손상 모델 설계 및 표준화

요약

본 연구의 목적은 두개안면 조직 재생 연구를 위해 Ambystoma mexicanum 에서 완전 횡단적 하악 절단술을 안전하고 재현 가능한 수술법을 표준화하는 것이었습니다.

초록

두개안면 복합체는 인간에서 발달 기형, 외상, 암과 같은 병리로 영향을 받아 영향을 받는 조직 손실을 초래할 수 있는 해부학적 영역입니다. 이로 인해 잃어버린 조직을 재생할 전략을 모색할 필요가 생깁니다. 이로 인해 재생 중인 종에서 손상된 두개안면 구조의 재생 반응을 조율하는 세포 및 분자 메커니즘 연구가 촉진되었으며, Ambystoma mexicanum(A. mexicanum)은 매우 관심 있는 종입니다.

이에 따라 악홀로틀 턱뼈에 재현 가능한 외과적 병변 모델이 설계 및 표준화되어 손상 조직의 재생 반응을 연구하고 인간에서 수행된 것과 유사한 치명적 결함을 시뮬레이션하였다. 따라서 12-15cm 사이의 어린 동물/성체 동물을 0.1% 트리카인으로 20-30분간 마취했다. 이후 하악골의 원위 3분의 1, 즉 교합실과 부교합실 부위를 4인으로 이용한 완전한 횡절제술이 시행되었으며, 이악골과 메켈 연골에 해당하는 골격 구조와 근육, 결합 조직, 신경, 피부 등 연조직을 제거했다. 이후 골 잔여물을 규칙화하고 0.5% 설파메라진을 도포하였다. 조직 반응은 거시적 및 다이어판화 모두에서 평가되었습니다. 모든 시술은 콜롬비아 안티오키아 대학교 동물 실험 위원회의 승인을 받았습니다. 절단된 동물들은 제거된 두개안면 구조를 형태학적, 구조적, 기능적으로 재생할 수 있었음을 보여줍니다.

매우 중요한 점은, 재생 조직 수집이 필요할 때 절단 및 재절단 동물의 100% 생존율을 보장하는 재현 가능한 외과 기법을 제공한다는 것입니다. 따라서 이 수술 설계는 두개안면 구조를 재생할 수 있는 다른 척추동물과의 비교 분석을 수행하고, 향후 재생 반응의 세포 및 분자 기전을 연구하는 데 기본적인 입력을 제공합니다.

서론

조직, 장기, 복잡한 구조를 재생하는 능력은 동물계 ^1,2,3 전반에 걸쳐 널리 기술되어 왔다. 따라서 이들 종이 팔다리와 꼬리 등 부속지 내 다양한 구조의 부상 또는 절단 후 재생 반응을 어떻게 활성화하고 조절할 수 있는지 이해하는 데 관심이 재생 생물학 ^4,5,6,7,8 연구에서 주목받아 왔다.

이 연구와 매우 관련되는, 두개안면 조직 재생 연구는 전 세계적으로 중요한 관심 분야였는데, 이 해부학적 부위는 안면 외상, 두개안면 발달 장애, 감염병, 종양 병리(구^{강암 포함})에 크게 영향을 받기 때문입니다. 종양이 있을 경우, 턱이나 다른 안면 부위의 구조물 또는 넓은 조직 영역을 절제해야 하며, 이는 영향을 받은 부위의 재건 및 수리 촉진 필요성을 생깁니다^{10, 11, 12}. 따라서 최근 수십 년간 인간과 같이 재생 능력이 낮은 종에서 재생 반응을 증진시킬 수 있는 세포 및 분자 메커니즘을 탐구하고 규명할 필요성 때문에 두개안면 조직 재생 연구가 증가했습니다^13,14. 이로 인해 턱과 같은 두개안면 구조를 재생할 수 있는 동물 모델을 사용하여 턱에 작은 병변이나 치명적 결함이 생긴 후 재생 반응에 관여하는 메커니즘을 탐구하고 밝히고 있습니다¹⁵.

하악 절단에 관한 이전 연구들은 서로 다른 종이 이 구조를 재생하는 능력을 도전하는 다양한 외과적 접근법의 설계를 강조했다¹⁶. 제브라피시의 경우, 턱의 원위 3분의 1과 턱 측면 접근로에서의 횡절 절단을 통해 절단된 마디가 형태학적·조직학적으로 복원되는 재생 반응이 나타났다 ^17,18. 반면, Notophthalmus viridescens와 같은 양서류 분야의 선구적 연구들은 혀와 인두와 같은 구조를 포함하는 하악 횡단 절단 후 상아골, 근육 조직, 치아 등 잃어버린 조직이 재생될 수 있음을 보여주었다. 그러나 혀 구조와 인두기는 재생할 수 없다^19,20. 그럼에도 불구하고, 같은 종에서 혀와 인두가 절단면에 포함되지 않을 때, 모든 재생 조직은 절단된 조직의 형태와 구조를 재현한다^21,22. 또한, Cynops pyrrhogaster 종에서 절단면에 혀가 포함되지 않는 횡절 절단은 절단된 하악 구조의 재생 반응을 보인다²³. 다른 연구들은 Ambystoma maculatum, Desmognathus fuscus, Plethodon cinereus, Eurycea bislineata, Ambystoma opacum 등 종에서 하악골 근위 3분의 1의 완전 횡절과 하악의 외측 후퇴가 손상 조직에서 재생 반응을 촉진한다는 것을 보여줍니다^24,25. 이는 양서류에서 절단 평면에 관련된 조직의 설계와 범위에 따라 재생 반응의 성공률이 달라질 수 있음을 보여줍니다.

반면, 재생 반응의 기전을 연구하는 데 참고 된 양서류 모델 종 중 하나는 요로데레 양서류 A. mexicanum^26,27이다. 이전 보고서들은 이 모델이 구강바닥의 연조직, 치아뼈, 메켈 연골, 근육 및 치아 구조^28,29,30,31 등 두개안면 구조를 재생할 수 있는 뛰어난 모델임을 입증했다. 이 결과는 구강바닥에 대한 펀치 손상, 치아와 치아뼈 일부의 치아 절제술, 그리고 하^{악뼈 일부}의 측면 절단을 포함하는 광범위한 접근법 등 다양한 외과적 접근법에서 비롯^{되었습니다. 그러나} 현재까지, 좌우 반골의 원위 부위, 치아골, 메켈 연골, 완전한 하악 결합, 양측 치과 근육 조직을 동시에 포함하는 치명적인 결손을 만드는 완전한 횡방향 수술법은 기술되지 않았습니다.

따라서 본 논문은 절단된 조직의 재생 반응을 100% 생존율로 모니터링할 수 있도록 A . 멕시카눔의 완면 횡절단 과정을 단계별로 기술적으로 설명합니다. 또한, 이 절단 수술 방법에 대한 세부 정보가 부족함에, 이 수술 가이드는 이 수술적 접근법과 이 유형의 외과적 접근법에 노출된 다른 종의 형태학, 조직, 세포, 분자 수준에서 비교 분석을 계획하는 연구자들이 이 수술법의 재현성을 보장하고자 하며, 하악골 측면 절단 등 다른 접근법도 포함됩니다. 궁극적으로 이 연구는 이러한 구조의 재생 반응을 촉진하는 미래 분자를 규명하는 기초를 제공하며, 두개안면 조직 재생 의학에 잠재적 응용이 될 수 있습니다.

프로토콜

이 프로젝트에 사용된 모델 생물은 멕시코 소치밀코 고유종인 도롱뇽 A. 멕시카눔입니다. 이 동물 집단은 2014년 켄터키 대학교 앰비스토마 유전적 자원 센터에서 부모 도롱뇽을 수입하여 법적으로 설립되었으며, 현재 32마리의 부모와 200마리 이상의 어린 동물을 보유하고 있습니다. 모든 절차는 2023년 3월 27일 법률 제151호에 따라 안티오키아 대학교 동물 실험 윤리 위원회(UdeA)의 승인을 받았으며, 이는 1989년 법률 84장, 1993년 콜롬비아 보건부 결의안 8430 5장 등 동물 실험에 관한 국가 및 국제 윤리 기준을 고려^{한 것입니다.}

1. 동물 취급

참고: 이 프로토콜을 표준화하기 위해 길이 약 12에서 15cm 사이의 야생 표현형을 가진 동물을 사용했습니다. 하지만 소형 동물과 다른 표현형을 가진 동물도 제외되지 않습니다.

1. 주둥이에서 꼬리까지 길이 약 12-15cm의 일부 아홀로틀.
2. 아홀로틀을 개별적으로 개별적으로 옮길 수 있을 만큼 큰 용기에 넣으세요. 이상적으로는 투명하고 직사각형이어야 합니다.
3. 시술 전, 동물을 20% 홀트프레터 용액에서 19°C에서 21°C 사이의 온도로 유지하고 밝음-어둠 주기를 진행합니다(12:12).
   참고: 가능하면 시술 24시간 전에는 동물에게 과식을 피하세요. 이는 구토 발작을 예방하기 위함입니다.

2. 하악 말위 3분의 1부의 완전 횡단 절단

1. 동물을 위한 마취 준비 및 수술 전
   1. 0.1% 트리카인 메탄설포네이트 마취액을 준비합니다: 트리카인 메탄설포네이트 1g, 100 μL 1M 에틸렌디아미네테트라아세트산(EDTA), pH 7.5, 0.5% 페놀 레드 50 μL 혼합, 40% 홀트프레터 용액으로 최대 1L을 만듭니다. pH를 NaOH로 7.5로 조절합니다.
   2. 모든 멸균 미세수술 기구(가위, 겸자, 핀셋, 7A 주걱, 1.5mL 튜브, 덴티미터, 파스퇴르 피펫, 페트리 접시, 플라스틱 트레이)를 준비하여 나중에 수술할 동물을 배치하세요.
   3. 작업 공간을 70% 방부 알코올로 청소하고, 직사광선을 수술 부위에 적절히 조절하고 위치시키세요.
2. 아네스테지아
   1. 아홀로틀을 0.1% 메탄설폰산 마취액 약 500mL가 담긴 용기에 20-30분간 넣어 깊은 마취를 보장합니다.
      참고: 동물이 마취액에 완전히 잠겨 있는지 확인하세요.
   2. 아가미 움직임과 촉각 자극에 대한 반응이 완전히 없는지 확인하여 전신 마취의 징후를 확인하세요.
      참고: 마취 후 입체 현미경으로 수술 전 사진을 촬영하세요.
3. 턱뼈의 완전 횡절 수술
   참고: 절단은 네 손 기법, 즉 두 명의 외과의사를 사용하여 가능한 한 신중하고 신속하게 시행해야 합니다.
   1. 동물을 조심스럽게 플라스틱 쟁반 위에 엎드려 눕히세요.
   2. 턱 바깥 가장자리에서 이 구조의 근위부, 턱/결합 부위에서 약 2.5mm 떨어진 곳을 칼리퍼(근관치과측정기)로 측정합니다(그림 1A).
      참고: 캘리퍼로 측정할 때 동물의 피부(구강 외)를 따라 측정합니다.
   3. 빨간 밀랍 연필로 절단면의 궤적과 수술 결함의 범위를 표시하세요.
   4. 아홀로틀을 조심스럽게 들어 올려 한 손으로 단단히 잡아 동물이 조작자의 손아귀에서 미끄러지지 않도록 하세요.
      참고: 이 작업은 한 명의 수술자(조작자 1)가 수행해야 하며, 다른 수술자(조작자 2)는 수술 기구를 다루고 절개를 하는 책임을 집니다.
   5. 직사광선을 아홀로틀의 머리 부위, 특히 수술할 해부학적 부위에 비추세요.
   6. 다른 손으로는 7A 주걱의 둥글고 넓은 면을 사용해 혀를 입바닥과 수술할 턱 부위에서 분리합니다. (그림 1B).
      참고: 혀가 윗턱에 약간 겹쳐져 있는지 확인하세요.
   7. 먼저(조작자 2) 외과용 겸자로 턱 바깥 가장자리에서 피부와 단단한 조직(치골과 메켈 연골)을 따라 초기 절개를 합니다(그림 1C).
      참고: 조직을 절단하고 조작할 때 더 잘 제어할 수 있도록 기구가 충분히 연마되어 있는지 확인하세요.
   8. 가늘한 수술용 가위로 횡방향으로 절개하여 절개가 첫 번째 절개 부위에서 반대쪽까지 턱 전체 너비를 가로질러 턱의 원위 조직이 완전히 제거되도록 하며, 계획된 절단면(완전 횡방향 절단)을 따라갑니다(그림 1D).
      참고: 턱이 더 튼튼한 큰 악홀로틀의 경우, 골격 구조를 더 깔끔하고 덜 충격적으로 절단하기 위해 집자로 절단면을 마무리하는 것이 권장됩니다(그림 1E).
   9. 남은 연조직이 즉시 후퇴하는 것을 관찰하세요(그림 1F).
   10. 절단된 조직을 해부용 겸자로 채취하여 필요한 용액과 함께 1.5mL 튜브에 담그고, 시행할 절차에 따라 합니다: 고정 및 이후 조직기술법 또는 면역형광을 위한 4% 파라포름알데히드(PFA), 이후 RNA, DNA, 단백질 추출을 위한 트리졸 또는 RNA 추출 등 다양한 기법을 사용합니다(그림 1F).
       참고: 이 조직은 조직학적 관점에서 재생된 조직과 비교하기 위한 비재생 대조군, 기저 유전자 발현, 또는 최종 조직 분화 마커 검출에 사용될 수 있습니다.
   11. 악솔로틀을 페트리 접시에 넣고 입체현미경으로 관찰한 뒤, 노출된 뼈와 연골 조직 가장자리를 겸자로 재조정합니다.
   12. 아홀로틀을 조심스럽게 플라스틱 트레이에 넣고 0.5% 설파메라진 항생제 목욕을 12시간 동안 하세요.

3. A. mexicanum 수술 후 회복

1. 수술 후에는 40% 홀트프레터 용액이 담긴 투명 플라스틱 용기에 아홀로틀을 넣고, 아가미 움직임, 교정 반사, 촉각 자극 반응 등 전신 마취 회복 징후를 관찰합니다. 완전 회복에는 약 30-60분이 소요됩니다.
   참고: 40% 홀트프레터 용액은 약 4°C에서 8°C 사이의 온도에서 차갑게 보관하세요.
2. 차가운 40% 홀트프레터 용액은 최소 8일 동안 24시간마다 교체하세요.
   참고: 처음 48시간은 동물 회복에 가장 중요한 시기이므로 매일 관찰해야 합니다.
3. 시술 후 24-48시간 후에는 잡기 쉽고 동물에게 덜 충격을 주는 부드러운 질감의 먹이를 먹이세요.
   참고: 수술 후 처음 24시간 동안은 아홀로틀에게 먹이를 주지 마세요.

4. 영상 획득 및 재생 반응 모니터링

참고: 최근 수술한 동물을 장시간 만지는 것을 피하기 위해 모든 사진은 가능한 한 빨리 촬영해야 합니다.

1. 동물이 완전히 마취되면, 조심스럽게 들어 올려 입체현미경과 페트리 접시에 담긴 디지털 카메라로 가져가 절단 전후 영상을 촬영하세요.
   참고: 입체현미경을 사전에 70% 알코올로 세척하고 소독하세요.
2. 턱 부분을 더 잘 관찰하기 위해 아홀로틀 머리를 비추는 입사광을 사용하세요.
3. 한 손으로 아홀로틀의 몸을 단단히 잡아 이미지 획득 영역에서 미끄러지지 않도록 하세요.
   참고: 실제 크기 변형을 방지하기 위해 수성 매체에서 사진 촬영을 피하세요; 액체가 없는 페트리 접시를 사용하세요. 가끔 홀트프레터 용액 40%로 아홀로틀을 가볍게 적셔주세요.
4. 턱 부위를 제대로 파악하고 적절히 집중하세요.
   참고: 시술 후 며칠(추적 관찰) 동안은 초기 단계에서 조직 재생이 매우 미묘하고 경우에 따라 거의 감지되지 않을 정도로 적절한 집중이 필요하다는 점을 염두에 두세요.
5. 프로그램 도구(대비, 밝기, 노출, 게인, 화이트 밸런스 등)를 조정하여 이미지 획득 매개변수를 최적화하세요.
6. 입체현미경(0.7배)으로 이미지를 획득하여 구조의 재생을 측정하고 모니터링합니다.
7. 재생 기간이 끝난 후, 재생된 조직은 이전에 보고된 프로토콜³⁴에 따라 알시안 블루와 알리자린 레드로 염색되었다.

결과

A. mexicanum²⁹와 같은 종에서 두개안면 구조의 절단 후 재생 반응 연구의 중요성과 관련성을 고려할 때, 조직의 재생 반응을 평가할 뿐만 아니라 수술 중인 동물의 낮은 사망률 또는 0%를 제공하는 안전하고 재현 가능한 수술 기법이 필요합니다. 따라서 본 연구는 A. mexicanum에서 두 개의 반측 부위 중 가장 먼 부위(양측 심피실 및 부교막 영역 포함)를 제거하는 완전한 횡절 절단을 포함하는 성공적인 외과적 접근법의 표준화를 제시합니다.

완전 횡하악 절단의 표준화를 위해 크기와 체중이 유사한 야생형 동물 37마리를 사용했습니다(그림 2A). 절단 수술 후 방법과 각 권고사항에 명시된 지침을 따르면, 처음으로 수술을 받은 동물들의 생존율은 100%였습니다(

토론

본 논문은 A. mexicanum 동물 모델에서 하악 횡절제술을 성공적으로 수행한 수술적 접근법과, 이러한 구조의 재생 반응을 모니터링하고 이 재생 과정을 조절하는 요인의 잠재적 규명을 위해 이 수술적 모델을 재현하기 위해 필요한 여러 권고사항을 제시합니다.

본 연구에서는 A. 멕시카늄의 하악골 원위 3분의 1에 대해 피부, 진피, 이악골, 치아, 메켈 연골, 근육(후방하악간근, 전하악간근, 상하설근 포함)과 관련된 완전 횡절 수술이 시행되었습니다. 마찬가지로, 근본적인 차이가 있음에도 불구하고 이 종에 대해서도 다른 외과적 접근법이 시행되었습니다. 크레이머 등이 외측 하악 절단술의 외과적 설계를 수행한 연구들도 그^{예입니다.} 이 연구에서 절단은 하악 결합의 내측 부위에서 시작되었으며, 메켈 연골, 주변 뼈(이악골), 표피, 느슨한...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Axolotl (Ambystoma mexicanum)	Ambystoma Genetic Stock Center	N/A	15-18 cm 및 16 g - 22 g 야생형
염화 칼슘 이수화물	덕산	1098	CaCl2 2H2O
디지털 카메라 MotiCAM 5	MotiCAM	https://www.motic.com/upload/File/201407/2014071115335993.pdf
EDTA - 나트륨 염, 이수화물	Biobasic	EB0185	C10H14N2O8Na2 . H2O
유리 페트리 접시	어떤 제조사	N/A	보로실리케이트 유리
황산 마그네슘 7수화물	ITW Reagents	131404.1211	MgSO4 7H2O
미세 외과 도구	N/A	N/A	포스펙스, 클램프, 7A 주걱, 데미터 및 가위
파스퇴르 피펫	어떤 제조사	N/A	저밀도 폴리에틸렌
염화 칼륨	덕산	372	KCl
빨간 왁스 연필	어떤 제조사	N/A
염화 나트륨	메르크	K48297604 717	NaCl
소프트웨어 Motic Images Plus-버전 2.0	Motic	https://www.motic.com/As_Support_Download/d42.html
입체 현미경	올림푸스 SZX16	N/A
설파메라진 나트륨 염	시그마- 알드리히	S0800	4-아미노-N-(4-메틸-2-피리미딘일) 벤젠설폰아미드
트리카인 메탄설포네이트	시그마- 알드리히	E10521	에틸 3-아미노벤조에이트 메탄설포네이트
1.5 mL 튜브	액시젠	MCT150C	순수 폴리프로필렌