신생아 마우스에서 혈관선상균의 1차 경계 세포 분리 및 배양

요약

여기서는 마우스 혈관선상에서 원발 주변 세포를 분리, 정제, 배양하는 프로토콜을 제시하며, 달팽이 측벽 질환을 연구하기 위한 산화 스트레스 및 세포 노화의 시험관 내 모델을 구축하는 방법을 제시합니다.

초록

혈관선상선은 내이에서 안경내관전위(EP)를 생성하고 유지하는 핵심 구조이며, 그 기능 장애는 다양한 형태의 청력 손실과 밀접한 관련이 있습니다. 혈관선상은 변연세포, 중간 세포, 기저세포로 구성되며, 이 중 변연세포는 외전혈관의 생성과 유지에 중심적인 역할을 합니다. 따라서 경계 세포의 시험 관 내 1차 배양 모델을 구축하는 것은 선체 혈관의 생물학적 특성과 청력 손실 관련 질환에서의 관여를 연구하는 데 필수적입니다.

본 연구에서는 신생아 마우스의 혈관선상에서 일차 경계 세포를 성공적으로 분리하고 배양하였습니다. 선방 조직은 미세해부로 채취하고, 타입 II 콜라겐제로 소화한 후 차별 플레이트로 정제하여 대부분의 섬유아세포를 제거했으며, 7일째에는 배양된 세포가 80% 이상의 합류율을 달성했다. 면역형광 염색 결과, 사이토케라틴 18(CK18)과 칼륨 전압개폐 채널 Q 하위 구성원 1(KCNQ1)의 안정적인 발현이 확인되어, 경계 세포의 성공적인 분리, 높은 순도, 그리고 생리적 기능 보존이 확인되었습니다.

이 모델을 바탕으로 시험 관 내 산화 스트레스 모델과 세포 노화 모델이 각각 과산화수소(H₂O₂)와 D-갈락토스를 사용해 확립되었습니다. 처리된 세포는 세포 내 활성 산소종(ROS) 수치가 유의미하게 증가하고 노화 관련 β-갈락토시다제(SA-β-gal) 양성성을 보였으며, 이는 1차 경계 세포가 산화 스트레스 및 노화 유발 자극에 매우 민감함을 보였음을 나타낸다. 이 연구는 종합적으로 쥐 1차 경계 세포의 배양 및 모델링을 위한 안정적이고 재현 가능한 시스템을 구축하여, 혈관선 선상선 기능 장애 및 관련 기전을 신뢰할 수 있는 시험 관 내 연구의 플랫폼을 제공합니다.

서론

청각 시스템에서는 달팽이관 내 여러 조직이 협력하여 복잡한 음파를 전기 신호로 변환^합니다. 혈관선상은 내림프의 이온 조성을 조절하고 내측 와우 전위(EP)를 생성하여 달팽이관의 항상성을 유지하고 내외 모세포의 정상적인 기능을 보장합니다. 이 질환은 경계 세포, 중간 세포, 기저 세포의 세 가지 뚜렷한 세포 유형으로 구성되어 있습니다. 주변 세포는 내림프를 직접 마주하는 극성 상피 단일층을 형성하며, 밀착된 접합부로 밀봉되어 있습니다. 경계 세포의 기저외측막은 두 가지 주요 칼륨 수송체인 Na⁺/K⁺-ATPase와 NKCC1로 풍부하게 구성되어 있으며, 이들은 혈관선상에서 나트륨과 칼륨 이온 수송을 조절하는 역할을 합니다. Na⁺/K⁺-ATPase의 기능은 EP ^2,3과 직접적으로 연관되어 있음이 입증되었습니다. KCNQ1/KCNE1 K⁺ 채널은 변두리 세포의 꼭대기막에 위치하며, EP⁴ 형성에 기여하는 추가 K⁺ 확산 전위를 생성합니다. 변두리 세포는 여러 칼륨 관련 단백질로 풍부하며, 달팽이관 내림프에서 칼륨 재활용을 이끄는 핵심 세포 단위 역할을 합니다. 따라서 한계 세포는 EP를 생성하고 유지하는 핵심 세포입니다.

혈관선상선(SV)은 감각신경성 난청(SNHL)과 관련된 여러 장애의 발병 기전에서 중요한 역할을 하는 것으로 입증되었으며, 여기에는 연령 관련 청력 손실(ARHL), 소음성 난청(NIHL), 유전성 난청(HHL), 약물 유발 난청(DIHL) 등이 포함됩니다. 또한, 자가면역 내이 질환(AIED), 자가염증성 내이 질환(AID), 메니에르병(MD)과 같은 여러 다른 청력 장애들도 원인학적으로 구별되지만, 최근 연구들에서 SV가 그 근본적인 병원 기전과 관련되어 있음이 밝혀졌습니다 ^5,6. 따라서 청력 손실의 발병 기전을 조사하기 위한 신뢰할 수 있는 세포 모델을 구축하는 것이 필수적입니다. 연구들은 주변 세포 밀도 감소가 쥐 수명 전반에 걸쳐 EP를 강력히 예측하는 요인임을 보여주었으며, 혈관선상의 위축은 ARHL ^7,8에서 초기 특징적 병변을 나타낸다. 경계 세포의 시험관 내 배양은 ARHL의 발병 기전 연구와 잠재적 치료 표적 탐색에 신뢰할 수 있는 모델을 제공할 수 있습니다. ARHL 외에도, 최근 연구들은 혈관선상과 다른 청각 장애 사이에 높은 상관관계와 잠재적 관계가 있음을 보여주었으며, 이는 시험관 내 변두세포 모델이 더 넓은 용도로 적용될 수 있음을 시사합니다 ^5,9,10.

본 연구는 신생아 쥐 달팽이관에서 혈관선상을 해부하고 배양하는 프로토콜을 설명하며, 이후 경계 세포를 차별판을 이용해 정제하여 혈관선상선체 관련 병리학 연구에 신뢰할 수 있는 세포 모델을 제공합니다.

프로토콜

신생아 쥐 새끼들(P0-3)은 Biont에서 제공했습니다. 모든 실험 절차는 미국 국립보건원(NIH 출판, 2011년 개정)에서 발표하고 우한대학교 인민병원 동물 윤리 위원회의 승인을 받은 실험동물 관리 및 사용 지침을 준수하였다(WDRM202400019).

1. 멸균 및 재료 준비

1. 미세 해리 겸자 두 쌍, 표준 겸자 한 쌍, 수술용 가위 한 쌍, 미세 해리 가위 한 쌍을 포함한 해부 도구를 준비하세요. 모든 도구를 오토클레이브로 멸균한 후 60°C 오븐에서 4시간 건조하세요.
2. 제조사 지침에 따라 상피세포 배지-동물(EpiCM-a 배지) 100mL를 준비하세요. 기저 배지에 태아 소 혈청(FBS), 상피세포 성장 보조제(EpiCGS-a), 페니실린/스트렙토마이신 용액을 첨가하여 최종 농도인 2% FBS, 1% EpiCGS-a, 1% 페니실린/스트렙토마이신 농도를 얻습니다.
3. 입체현미경 스테이지와 하우징을 75% 에탄올로 소독하세요. 그 후 오토클레이드 해부 도구와 소독된 현미경을 생물학적 안전 캐비닛에 넣습니다. 해부 절차를 시작하기 전에 모든 물건을 30분간 UV빛에 노출시켜 완전히 멸균되도록 하세요.

2. 청각 상피 수집을 위한 해리 및 측두골 격리

1. 신생아 쥐 새끼(P0-3)는 4% 이소플루란 마취 후 안락사시키고, 75% 에탄올로 소독하며, 얼음 위에서 참수를 시행합니다. 필요하다면 윤리적으로 승인된 다른 방법을 사용하세요.
2. 머리를 고정하고, 미세해리 가위로 시상봉합선을 따라 두피를 벌린 뒤, 두피를 양쪽으로 분리하고 절제합니다.
3. 미세 해리 가위를 사용해 신생아 쥐의 머리를 중앙선을 따라 반으로 절단합니다. 겸자로 뇌 조직을 제거하여 측두골을 노출시킵니다(그림 1A).
4. 두개골 기저부의 양측 측두골을 관찰하고, 불필요한 다른 뼈는 제거하며, 달팽이관이 포함된 측두골 조직을 유지하세요(그림 1B).
5. 측두골 하나를 신선한 행크스 밸런스 소금 용액(HBSS)이 얼음 위에 담긴 35mm 멸균 접시에 옮깁니다.
6. 다른 측두골은 현미경으로 옮기고, 측두골 조직은 한 쌍의 겸자로 고정한 뒤, 다른 한 쌍으로 표면 근육 조직을 둔하게 해부하여 흰색 반고리 고리가 보일 때까지 합니다(그림 1C). 달팽우 위치를 확인한 후에는 반투명한 달팽이 조직이 관찰될 때까지 둔한 박리를 계속 아래로 진행합니다(그림 1D).
   참고: 2.6-2.7단계는 얼음 위에서 수행해야 합니다.
7. 미세 해리 겸자를 사용해 달팽이관의 꼭짓기 굽이에서 뼈벽의 작은 조각을 조심스럽게 제거하고, 겸자의 한쪽을 부드럽게 달팽이관에 삽입하여 골벽을 막성 미로에서 분리합니다. 골벽을 제거하고 막성 미로 조직을 신선한 행크스 밸런스 소금 용액(HBSS)에서 확장합니다(그림 1E).
8. 한 쌍의 겸자로 기저막을 고정하고, 다른 한 쌍의 겸자로 혈관선상을 조심스럽게 분리합니다. 1.5mL 마이크로 원심분리관에 1mL의 1mg/mL 콜라게나제 II형 용액을 얼음 위에 놓고 옮깁니다(그림 1F).
9. 위 단계를 반복하여 반대편에서 혈관줄무늬를 채취하세요.

3. 군관선상의 변두리 세포 획득을 위한 효소 분해

1. 채취한 조직이 담긴 마이크로 원심분리관을 1mg/mL 콜라게나제 II 용액에 37°C에서 30분간 배양합니다.
   참고: 콜라겐제 II형 용액은 인산염 완충 식염수(PBS; 2.7 mM KCl, 2.0 mM KH₂PO₄, 137 mM NaCl, 10 mM Na₂HPO₄)에 희석하여 제조되었습니다.
2. 튜브를 300 × g 에서 8분간 원심분리합니다.
3. 조심스럽게 상정액을 제거하세요. 소화를 종료하기 위해 배양지 1mL를 추가하고, 세포를 부드럽게 분쇄하여 세포를 다시 현탁시키고, 300 × g에서 다시 8분간 원심분리합니다.
4. 상청액을 흡인하고 신선한 배양지 1mL를 추가하세요. 삼각하여 단일 세포 현탁액을 얻고, 현탁액을 15 mL 원뿔 튜브로 옮기고, 추가 배지를 추가하여 전체 부피를 10 mL로 조절합니다.
5. 세포 현탁액을 반복 피펫팅으로 완전히 혼합한 후, 6웰 플레이트의 각 웰에 1mL의 현탁액을 옮깁니다. 세포를 2 mL의 DMEM에 2% FBS, 1% EpiCGS-a, 1% 페니실린/스트렙토마이신 용액을 보충하여 37°C에서 5%_CO2 인큐베이터에서 배양합니다.
6. 매일같이 매개체를 교체하고 세포 상태를 모니터링하세요. 변백 세포의 군집 증식은 일반적으로 플레이트 부착 후 2일 후에 관찰할 수 있습니다.

4. 주변 세포의 정제

1. 배양 3일째에는 가장자리 세포의 자갈처럼 생긴 군집 주변에 수많은 방추 모양의 섬유아세포가 나타나는 것을 관찰합니다(그림 2B).
2. 접착 속도 차이를 이용해 부드럽게 피펫으로 방추 모양의 섬유아세포를 부분적으로 제거합니다. 1 mL 피펫을 사용해 D-Hanks의 균형 잡힌 염 용액을 네 사분면 각각의 넓은 영역에 부드럽게 세척합니다. 현미경으로 세포 정제를 모니터링하고, 피펫팅의 힘과 방향을 적절히 조절하세요. 일반적으로 대면적 플러싱은 두 번 수행됩니다. 각 라운드 후에는 섬유아세포 밀도를 현미경으로 검사합니다; 이러한 관찰을 바탕으로, 인구 밀도가 높은 섬유아세포 부위에 국소적으로 부드러운 피펫팅을 적용하여 배양 접시 전반에 드문드문하고 균일하게 분포하도록 합니다.
   참고: 섬유아세포의 밀도는 적절한 유지되었으며, 완전한 제거나 과도한 정제 시 원발세포 성장이 제한될 수 있습니다. 우리는 경계세포와 섬유아세포의 비율을 대략 2:1로 유지할 것을 권장합니다.
3. 현미경 검사에서 섬유아세포가 주변 세포 군집에 드문드문드문 분포해 보이면 정제를 중단하세요. 상원액을 제거하고 신선한 배양지 2mL를 추가하여 배양을 계속하세요.

5. 면역형광 염색

1. 정제 후 2일째에는 현미경으로 세포 형태를 관찰합니다. 적절한 세포 군집 형성과 적절한 밀도가 관찰되면 배양지를 흡취하고 인산염 완충 식염수(PBS, pH 7.4)로 세포를 세 번 세척합니다.
2. 4% 파라포름알데히드 세포를 상온에서 15분간 고정하세요. 고정액을 제거한 후에는 PBS로 세포를 세 번(세척당 5분) 세척합니다.
3. 0.5% Triton X-100으로 세포를 15분간 투과시킵니다. 용액을 제거하고 PBS로 셀을 세 번 세척하세요(세척당 5분).
4. 10% 염소 혈청이 포함된 PBS로 실온에서 30분간 세포를 차단합니다.
5. 토끼 항생쥐 CK18 단클론 항체(염소 혈청 3% 포함 PBS에 1:300 희석) 또는 KCNQ1 항체(G-8)(3% 염소 혈청 포함 PBS에 1:100 희석)를 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
6. PBS로 셀을 세 번 세척하세요(한 번 10분). 상온에서 해당 2차 항체(염소 혈청 함유 3% 포함 PBS에 1:300 희석)와 함께 1시간 인큐베이팅합니다.
7. 2차 항체를 제거하고 PBS로 세포를 세 번 세척하세요(세척당 10분).
8. DAPI가 포함된 안티페이드 마운팅 매체 1-2방울을 슬라이드, 커버슬립 장착, 공초점 레이저 스캐닝 시스템을 사용해 표본을 검사합니다.
   참고: 세척 단계를 제외하고, 항체를 포함한 모든 배양액은 세포를 완전히 덮을 수 있을 만큼 충분한 양으로 첨가되었습니다.

6. H₂O₂ 처리 및 ROS 염색

1. 7일간의 배양 후 주변 세포가 융합 단일층을 형성하면, 1 mM H₂O₂로 산화 스트레스를 유도합니다. 30% H₂O₂ 스톡 용액을 상피세포 배지에 1:10000으로 희석하여 1 mM 작업 용액을 준비합니다. 이 작동 용액으로 실험군을 인큐베이팅하고, 대조군은 상피세포 배지만으로 처리합니다.
2. 16시간 처리 후에는 배지를 조심스럽게 제거하고 PBS로 세포를 세척하세요. 제조사 프로토콜에 따라 반응성 산소종 분석 키트를 사용하여 경계 세포의 세포내 ROS 수치를 평가합니다.
3. 배양지를 제거한 후 희석한 MitoTracker Red CMXRos(미토콘드리아 선택 염료)와 DCFH-DA를 세포에 첨가하고, 37°C에서 세포 배양 인큐베이터에서 30분간 배큐합니다.
4. 세포를 PBS로 세 번(각각 5분씩) 세척한 후, 커버슬립을 장착한 후 공초점 레이저 주사 현미경으로 샘플을 관찰하세요.

7. D-갈락토스 처리 및 SA-β-갤 염색

1. 7일간의 배양 후 주변 세포가 합류 단층을 형성하면, D-갈락토스 분말을 EpiCM-a 배지에 용해하여 40 mg/mL D-gal 작업 용액을 준비했습니다. 이 용액(6웰 플레이트의 웰당 2mL, 37°C에서 48시간)으로 실험군을 배양하여 세포 노화를 유도하고, 대조군은 동일한 부피의 에피소 배지만으로 처리합니다.
2. 48시간 처리 후에는 배지를 조심스럽게 제거하고 PBS로 세포를 세척하세요. 제조사 지침에 따라 SA-β-갤런 염색 키트를 사용해 주변 세포의 세포 노화를 평가하세요.
3. 세포를 고정액으로 상온에서 15분간 고정하세요. 고정제를 제거한 후에는 PBS로 셀을 세 번(한 번 5분) 세척합니다.
4. 5% X-Gal(6웰 플레이트의 웰당 1mL)이 포함된 SA-β갤 염색 작업 용액을 37°C에서_CO2 없는 가습 인큐베이터에서 하룻밤 배양합니다.
5. 현미경을 이용해 밝은 영역 조명 하에서 SA-β-갤 염색 이미지를 촬영합니다.

8. 통계 분석

1. H₂O₂ 처리군과 대조군 간 ROS 염색의 평균 면역형광 강도, 그리고 D-갈락토스 처리군과 대조군 간 SA-β-갤런 양성 세포 비율 비교를 위해, 정상성과 로그 정상성 평가 후 t 검정을 적용합니다.

결과

배양된 세포의 성장 및 형태학적 특성
이 프로토콜을 사용하여 쥐 달팽이관에서 분리된 변두리 세포의 1차 배양을 성공적으로 확립하였습니다. 배양 2일째에 광학 현미경 검사로 세포가 기질에 달라붙어 군집을 형성하기 시작한 것이 밝혀졌습니다(그림 2Aa). 3일째에는 세포를 정제했습니다(그림 2B). 이후 며칠간의 후속 관찰 결과, 주요 변두리 세포가 기하급수적으로 확장하여 특징적인 자갈과 유사한 형태를 보이고 7일째에는 약 80%의 합류율에 도달했다(그림 2Ab-d).

세포 정제 후 2일째에 면역형광(IF) 염색 결과 CK18 발현이 확인되었고(그림 2C

토론

수십 년간 청력 손실에 관한 연구는 주로 감각 모세포와 나선신경절 뉴런과의 시냅스 연결에 초점을 맞추어 왔습니다¹¹. 수많은 연구들이 체외 내 모발세포 배양 모델을 구축하고 최적화하는 데 헌신되었으며, 이는 모세포 손상, 재생, 이독성 약물의 영향 조사에 필수적인 역할을 했습니다^12,13. 그러나 점점 늘어나는 연구와 리뷰들은^청각계에서 군관선상(stria vascularis)이 오랫동안 간과되어 왔던 중요한 역할을 강조하고 있습니다. 혈관선상은 내림프의 이온 조성을 조절하고 EP를 생성하는 역할을 하며, 이는 모세포가 정상 기능을 유지하는 데 의존하는¹⁴. 병리학적 연구들은 ARHL¹⁵

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
15 mL 원심분리관	서비스바이오	EP-1501-J	배양을 위한 사용
35mm 세포 배양 접시	네스트	706001	해부를 위한 사용
4% 파라포름알데히드	서비스바이오	G1101	면역형광 염색
6-웰 플레이트	서비스바이오	CCP-6H	배양을 위한 사용
Alexa Fluor 488-접합 염소 항토끼 항체	단백질 기술	SA00013-2	면역형광 염색
DAPI를 이용한 안티페이드 마운팅 매체	압생	ABS9235	면역형광 염색
세포 계수 키트-8	비요타임	C0037	셀 카운팅에 사용해
콜라게나제 II 유형	바이오샤프	BS164	배양을 위한 사용
공초점 레이저 스캐닝 시스템	올림푸스	FV1200	면역형광 염색
DCFH-DA	인비트로젠	C2938	ROS 염색
D-걸	솔라비오	D8310	셀 모델링에 사용함
EpiCM-a 미디엄	과학	4131	배양을 위한 사용
미세 겸자	후륜구동	F11020-11	해부를 위한 사용
염소 혈청	비요타임	C0265	면역형광 염색
H2O2	므비오	MM0707	셀 모델링에 사용함
행크의 밸런스 소금 솔루션 (HBSS)	바이오샤프	BL561A	배양을 위한 사용
이소플루란	후륜구동	R510-22-10	해부를 위한 사용
KCNQ1 항체 (G-8)	산타크루즈	SC-365186	면역형광 염색
현미경	올림푸스	SZX7-1063	해부를 위한 사용
현미경	올림푸스	IX71	면역형광 염색 결과를 관찰하는 데 사용됩니다
미토트래커 레드 CMXRos	인비트로젠	M7512	ROS 염색
신생아 쥐 새끼 (P0-P3)			BIONT에서 제공
PBS	서비스바이오	G4202	면역형광 염색
토끼 항쥐 CK18 단클론 항체	단백질 기술	10830-1-AP	면역형광 염색
노화 & 베타;-갈락토시다제 염색 키트	비요타임	C0602	노화 염색
트리톤 X-100	시그마-올드리치	X100	면역형광 염색