용매 주조 기법으로 제조된 용해형 마이크로니들 어레이 패치와 마이크로니들 기반 생체의학적 장치의 필수 특성 분석

Summary

본 연구는 연구자들이 마이크로몰딩이라고도 불리는 용매 주조법을 사용해 자체 DMAP 장치를 준비하고 기본적인 특성 분석을 수행할 수 있도록 실용적인 가이드 역할을 하는 것을 목표로 합니다.

Abstract

마이크로니들 기반 기술은 피부 및 경피 전달 연구 분야에 혁신을 가져왔으며, 오늘날 피부를 통해 약물을 투여하는 가장 직관적인 방법으로 여겨지고 있습니다. 마이크로니들 어레이 패치(MAP)의 성공은 주로 국소 약물의 침투를 막는 피부 장벽 기능을 무통증으로 각 질층 을 뚫어 무력화할 수 있기 때문입니다. 용해형 MAP(DMAP)은 구성 재료의 생체 적합성, 환자 자가 투여 가능성, 사용 후 발생하는 날카로운 폐기물이 없다는 점에서 다른 MAP 기반 기기 유형과 차별화됩니다. DMAP는 보통 고분자 재료로 만들어지며, 피부에 삽입되면 간질액과 접촉하면 재확산되어 그 화물을 방출합니다. 작업대 수준에서는 DMAP가 일반적으로 용매 주조법으로 제조되며, 이는 원하는 MAP의 형태와 길이의 네거티브 마스터 몰드를 사용해 약물 적재 폴리머 분산체를 주조하는 방식입니다. 이들은 원심력이나 양압을 가해 몰드의 공동을 채우도록 강제로 이루어집니다. 건조 후 DMAP는 고체가 되어 마스터 몰드에서 떼어내며, 사용 전에 다양한 특성 분석이 정기적으로 거쳐집니다. 이 검사들은 일반적으로 DMAP의 기계적 특성 연구, 잔류 수분 함량 측정, 피부 구조 침투 능력, 약물 방출 성능, 그리고 생 체 적합성 시험관 내 평가를 포함합니다.

Introduction

약리학적 활성 물질을 피부 안팎으로 국소 및 경피 투여하는 것은 경구 약물 투여의 유망한 대안으로 여겨지지만, 각질층이 작용하는 자연스러운 피부 장벽 기능으로 인해 상당한 도전 과제가 있습니다. 이 한계는 특히 분자량 >500 Da¹을 가진 분자에 영향을 미칩니다. 또한, 친수성이나 지방친성과 같은 특정 물리화학적 특성을 가진 다른 분자들의 피부를 통한 수동 확산도 제한됩니다. 이 장벽을 극복하기 위해 이온토포레시스, 소노포레시스, 전기천공, 화학 증강제 사용, 열방법, 나노 크기 시스템 등 다양한 기술 전략이 제안되었습니다. 그럼에도 불구하고, 마이크로니들 어레이 패치(MAPs)는 각질층 기능을 극도로 효과적으로 제거하고, 비용 효율적이며, 환자에게 통증 없는 진료 제공, 그리고 의료진이 필요 없는 자가 투여 가능성 등 여러 장점으로 두드러집니다^.

MAP는 각질 층을 관통하고 표피 장벽을 우회하는 미세 바늘 모양의 돌출부를 포함하는 장치입니다. 문헌에는 고체 MAPs, 코팅 MAPs, 용해성 MAPs, 부풀림 MAPs, 그리고 속공 MAPs 등 여러 유형이 기술되어 있습니다. 용해성 MAP(DMAP)은 수용성 고분자 재료로 구성되어 있으며, '찌르고 방출(poke and release)' 전략을 사용하여 특별한 특징을 가지고 있습니다. 특히, 간질액과 접촉하면 피부 구조에 삽입될 때 녹아 그 성분이 방출됩니다. 고체 MAP가 피부 구조 내에 마이크로채널을 만들어 이후 국소 적용된 제형^제가 통과할 수 있게 하는 '포크 앤 패치(poke and release)' 전략과 ^{달리, '}포크 앤 릴리스(poke and release)' 방식은 마이크로채널이 열려 있는 동안 지속되지 않습니다. "포크 앤 플로우" 전략은 구조가 훨씬 복잡하고 제조가 어려운 속이 빈 MAP를 준비해야 합니다. DMAP의 또 다른 장점은 적용 후 날카로운 폐기물을 발생시키지 않아 바늘 찔림 부상과 생물학적 오염 위험을 줄인다는 점입니다. 더불어, 간단하고 최소 침습적인 적용 덕분에 환자가 자율 관리가 가능해져, 훈련된 의료진, 의료 인프라, 안전한 날카로운 폐기 시스템 접근^{이 제한된 자원}이 제한적이거나 지리적으로 외진 환경에서 사용할 수 있습니다. 피부 및 경피 약물 전달에 집중하는 과학계는 앞서 언급한 전략의 한계를 극복하기 위해 특히 DMAP 기술에 점점 더 의존하고 있습니다. MAP에 관한 최초의 발표는 1980년대로 거슬러 올라가지만, 이 기술은 2000년대 초반에 큰 급증을 경험했습니다. 그 이후로 출판물 수는 기하급수적으로 증가하여 현재 연간 약 500편에 이릅니다.

DMAP는 일반적으로 용매 주조법 또는 마이크로몰딩⁶으로 제조됩니다. 이 제조 기술은 원하는 MAP의 형태와 길이를 가진 네거티브 마스터 몰드를 사용하는 데 기반합니다. 약물이나 나노 크기의 시스템이 적재된 고분자 분산물을 주조한 후, 외부 힘이 가해 마스터 몰드의 미세한 바늘 모양 공동을 채웁니다. DMAP는 건조된 후 조심스럽게 벗겨내거나 화학 물질로 마스터 몰드를 녹여 탈몰드할 수 있습니다. 이 마스터 몰드는 다양한 재료로 만들어지며, 폴리디메틸실록산(PDMS)이 가장 흔한데, 이는 유연성과 낮은 접착력 덕분에 DMAP의 탈몰드를 용이하게 합니다. 마스터 몰드의 준비는 일반적으로 석판 인쇄 기법을 사용하여 수행됩니다; 현재는 다양한 형태, 길이, 밀도의 상업용 PDMS 몰드가 구할 수 있습니다.

여기서는 용매 주조 기법을 이용한 DMAP 제조에 대한 지침을 제공합니다. 이 경우 원심력이나 양압을 가해 공정이 수행됩니다. 이로써 MAP 기반 생의학기기의 고비용 제조 방식에 대한 효율적인 비용 프로토콜 대안이 가능해져, 더 넓은 연구자들이 피부 관련 연구에 MAP를 통합할 수 있게 되었습니다. 또한, 학술 및 기초 연구 목적의 생 체 내 시험에 앞서 필수적인 특성 분석에는 바늘 길이와 기하학, 압축에 대한 기계적 저항성, 체외 삽입 성능, 약물 부하 및 방출, 잔류 수분 함량, 안정성, 체 외 약물 흡수, 시험관 내 안전성 프로파일 등이 포함됩니다.

Protocol

이 연구에 사용된 시약과 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 원심분리를 이용한 용해 마이크로니들 배열 제조

1. DMAP의 구성 물질을 적절한 양의 물에 녹이고 격렬하게 저어서 수성 콜로이드 분산을 준비합니다. 선택된 폴리머와 농도에 따라 분산 시간은 달라질 수 있습니다. 필요하다면 폴리머의 분산을 촉진하기 위해 물을 적당한 온도(40-45 °C)로 가열하세요.
   참고: DMAP 제조에 가장 흔히 사용되는 폴리머는 폴리(비닐 피롤리돈)(PVP), 카라야 검, 히알루론산(HA), 폴리(메틸 비닐 에테르 알트말레산)(PMVE-MA), 폴리(비닐 알코올)(PVA), 카복시메틸 셀룰로오스(CMC), 키토산 등이지만, 최적의 특성을 가진 다른 수용성 물질도 사용할 수 있습니다. 대부분의 제형에서 일반적인 작동 농도는 5%에서 30% w/w 사이입니다. 낮은 농도는 일반적으로 빠르게 용해되는 DMAP를 생성하며, 높은 농도는 느리게 용해되는 장치를 생성합니다. 하지만 최적의 농도는 고분자의 분자량, 점도, 마이크로바늘의 원하는 기계적 특성에 따라 다르게 DMAP 프로토타입을 준비하여 경험적으로 결정해야 합니다.
2. 고분자를 밤새 최소한으로 저어 완전한 분산을 이루고, 공기 방울을 제거하세요.
3. 기포가 지속되면 고분자 분산을 원심분리합니다(1000 x g; 5분; 25 °C).
4. 화물(약물 또는 나노 입자)을 원하는 농도로 첨가하고, 새로운 기포가 섞이지 않도록 균일해질 때까지 적당히 저어줍니다.
5. PDMS 몰드는 12웰 플레이트에 폐기하세요. 이를 위해 몰드를 웰에 넣는 데 모델링 클레이, 덴탈 시멘트 또는 유사한 재료로 맞추세요.
6. 약물 가재 고분자 혼합물 50 μL를 PDMS 몰드와 원심분리기에 주조합니다(3000 x g; 5분; 25 °C). 그 후 판을 180° 돌려 원심분리 과정을 반복하여 모든 바늘 모양 공동이 채워지도록 합니다.
7. 약물이 포함된 고분자 분산의 과잉 분포를 조심스럽게 제거하세요. 액체 상태라면 고분자 분산을 피펫으로 옮기세요; 점도가 높으면 주걱을 사용하세요.
8. 이중 원심분리 과정(1.6단계)을 반복하여 이전 단계에서 넘쳤을 수 있는 약물 가재 분포물을 다시 몰드에 넣습니다.
9. 몰드 내 약물 가재 분포물을 진공 상태(600 mBar; 30분; 25 °C)에서 건조합니다.
10. 1.6-1.9 단계부터 최소 두 번 반복하여 약물 가재 폴리머 분산이 마스터 몰드에 올바르게 채워지도록 하십시오.
    참고: 원심력은 각 반복에서 500 x g (25 °C)씩 점진적으로 줄일 수 있습니다.
11. 약물이 없는 고농축 폴리머 분산물을 준비하여 DMAP 장치의 베이스플레이트를 만듭니다. 이는 몰드 공동에 메워진 분산 물질이 베이스플레이트로 역류하지 않도록 보장합니다.
12. 50 μL 자유 약물 고분자 분산액을 PDMS 몰드에 주조하고, 중간 판을 포함해 180°(500 x g; 5분; 25 °C; 2x) 회전 속도로 원심분리하여 두 번 퍼뜨립니다. 원심분리 후에는 각 몰드에 100 μL의 분산을 추가하고, 12시간 후에 베이스플레이트에 추가로 50 μL를 추가합니다.
13. DMAP를 PDMS 몰드에 넣어 실온에서 3-5일간 건조 밀봉 건조기에 넣어 건조시킵니다.
14. PDMS에서 DMAP를 조심스럽게 몰드를 제거하거나 스카치 셀룰로오스 테이프로 떼어내세요(그림 1).
15. 제조된 DMAP의 특성화(3단계 참조).

2. 양압을 가해 용해하는 마이크로니들 배열 제조

1. 이전 섹션에서 설명한 대로 1.5단계까지 진행하세요.
2. 약물 가재 폴리머 블렌드 150 μL를 PDMS 몰드에 주조하여 압력 탱크에 넣습니다.
3. 압력 탱크에 공기를 채워 최소 15분 동안 3-4바 압력에 도달하세요.
4. 약물이 포함된 고분자 분산의 과잉 분포를 조심스럽게 제거하세요. 이를 위해 고분자 분산물이 액체라면 피펫을 사용하고, 점성이 상당히 높으면 주걱으로 제거하세요.
5. 이전 단계에서 넘쳤을 수 있는 약물 함유 폴리머 분산을 몰드에 다시 주입하기 위해 압력을 반복합니다(2.2-2.3단계).
6. 약물이 포함된 고분자 분산물을 진공 상태(600 mbar; 30분; 25 °C)에서 건조합니다.
7. 약물이 없는 고농축 폴리머 분산물을 준비하여 DMAP 장치의 베이스플레이트를 만듭니다. 이는 몰드 공동에 메워진 분산 물질이 베이스플레이트로 역류하지 않도록 보장합니다.
8. 2.3단계에서 설명한 대로 0.2g의 자유 약물 고분자 분산액을 PDMS 몰드에 주조하고 양압을 가합니다.
9. 1.13단계부터 이전 섹션에서 설명한 대로 진행하세요.

3. DMAP의 특성화

참고: 이 단계에서는 인간 및/또는 동물 피부 조직을 사용하는 방법이 기관 지침에 따라 수행되었습니다. 또한, 동물 피부 샘플을 사용하는 방법들은 동물 실험을 위한 3Rs 원칙에 따라 수행되었습니다.

1. 적절한 배율의 마이크로 카메라를 사용해 DMAP를 시각화하여 바늘 모양 돌출부를 구분합니다.^7.
   참고: 색이 있는 약물이나 염료가 주입된 경우, 팁과 베이스플레이트 사이에 다른 색이 있어야 합니다.
2. DMAP를 지지 장치에 부착하고 광학 현미경으로 마이크로바늘 모양의 돌출부의 형태와 길이를 시각화합니다. 날카로운 끝 구조를 관찰해야 합니다. 광학 현미경에 맞는 소프트웨어로 마이크로바늘 같은 돌출 길이를 기록하세요.
   참고: 광학 현미경으로 마이크로바늘 길이를 측정하려면 MAP를 대물렌즈에 수직으로 표시해야 합니다. 길이 측정과 마이크로바늘 모양의 돌출 형태는 주사 전자현미경(Scanning Electron Microscopy)으로 확인해야 합니다.
3. 압축된 후 마이크로니들 변형에 대한 DMAP의 기계적 특성을 평가합니다. 이를 위해 DMAPs 장치를 시판용 DMAPs 어플리케이터에 넣고, 스테인리스 평평한 표면에 30초간 압축하세요. 압축 후에는 마이크로바늘 모양의 돌출부의 길이를 기록하고, 다음 식과 비교하여 변형 비율을 계산^합니다:
   
   여기서 h_o 와 h_f 는 각각 압축 전후의 마이크로바늘 길이를 나타냅니다.
   참고: 텍스처 분석기를 사용하면 압축력을 표준화할 수 있습니다. 이 경우 32N/배열의 힘은 환자가 DMAP 장치를 스스로 투여할 때 사용하는 엄지손가락 평균적인 힘과 같습니다.
4. 올레핀형 재료로 만든 열가소성 시트를 기반으로 한 대리 인공 피부 방법에 의한 DMAP의 예비 삽입 용량을 결정합니다⁸. 이를 위해 3.4단계에서 설명한 조건에 따라 DMAP 장치를 8장의 바인드 시트에 압축하세요. 각 층에 생긴 구멍 수는 광학 현미경 또는 현미경 카메라를 사용해 관찰하며, 깊이에 따라 관통 비율을 계산합니다.
   참고: 상업적으로 판매되는 열가소성 시트는 보통 127 μm 두께를 가집니다.
5. 인간, 돼지 또는 설치류 피부 제거 식물을 미리 절제하고 신중하게 다듬어 DMAP의 체외 삽입 능력을 결정합니다. 피부를 충분한 물로 1-2분간 물에 담가 세척한 후, 각질층 이 위를 향하게 하여 알루미늄 호일로 감싼 폼 위에 올려놓으세요.
   1. 3.4단계에서 설명한 조건에 따라 삽입을 진행하세요. 마이크로바늘 끝이 녹을 때까지 DMAP를 피부에 삽입해 두세요. DMAP에 염료나 색소가 첨가된 경우, 피부의 내부 및 외부 면의 색이 성공적인 DMAP 삽입임을 알 수 있습니다.^9. 또한, 피부 절편의 조직학적 분석을 통해 마이크로채널을 관찰할 수 있습니다^.
      참고: 이 단계는 체외 인간 또는 동물 피부를 이용한 것으로, 발렌시아 대학교 인간 및 동물 연구 윤리 위원회의 지침과 승인에 따라 수행되었습니다. 해당되는 경우 사전 동의를 받았으며, 모든 실험은 생의학 연구에서 인간 및 동물 조직 사용에 관한 기관 및 유럽 윤리 기준을 준수했습니다.
6. 잔류 수분 함량은 열중력 분석을 통해 산출됩니다. 100-110 °C까지 관찰된 체중 감소는 잔^{류 수분} 때문이라고 추정됩니다.
   참고: 문헌 출처에 따라 DMAP의 최적 건조를 위해 허용되는 잔류 수분 함량은 전체 무게의 5%-10%입니다.
7. DMAP를 5-10mL의 물(또는 분석된 약물에 적합한 수용 배양액)에 32-37 °C에서 담근 후 최적의 분석 방법으로 화물량을 정량화하여 정량화합니다.
   참고: UV-Vis 분광광도측정은 소분자 분석에 일반적으로 사용됩니다. 검출 및 정량 한계가 낮은 화합물의 경우, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)와 UV-Vis, 형광 또는 전기화학 검출을 강력히 권장합니다. HPLC와 질량분석법을 결합한 것은 뛰어난 민감도와 특이성이 요구될 때 사용할 수 있습니다. 단백질과 항체 화물의 분석 결정은 일반적으로 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA) 또는 웨스턴 블로팅과 같은 비신코닌산(BCA) 분석법과 면역 분석법을 사용하여 수행됩니다. 약물 방출 프로파일은^{방출 수용 배}지에서 미리 정해진 시점에 0.2-1 mL를 샘플링하여 얻습니다. 샘플링 지점마다 줄어든 부피를 동일한 부피의 템퍼링 릴리스 매체로 대체하여 샘플의 자동 농축과 관련된 오류를 방지합니다.
8. 위에서 언급한 특성 분석 분석을 반복하여 DMAP의 특성이 설계된 저장 조건 내에서 일정하게 유지되도록 하여 DMAP의 안정성을 평가합니다.
   참고: 화물이 열안정성이 있는 경우, DMAP는 일반적으로 실온(25 °C)에서 보관됩니다. 열에 민감한 활성 성분의 경우, DMAP는 4 °C에서 보관됩니다. 상대 습도는 30% 이하로 유지해야 합니다. DMAP의 안정성은 6개월 동안 정기적으로 모니터링됩니다.
9. 프란츠 확산 세포(FDC) 장치를 사용하여 체 외 약물 피부 침착과 흡수를 결정합니다. 이를 위해 설명된 대로 피부를 준비하고 3.6단계에 설명한 대로 DMAP를 피부 구조에 30초간 삽입하세요.
   1. 그 후 FDC 공여 챔버를 적절한 양의 시아노아크릴레이트로 피부에 접착합니다. 건조 후에는 적절한 클램프¹²를 사용하여 피부-기증자 챔버 복합체를 수용체 챔버에 부착합니다. 마지막으로, 3.5항에 설명된 샘플링 프로토콜을 진행하세요.
      참고: 이 단계는 체외 에서 얻은 인간 또는 동물 피부를 대상으로 하며, 발렌시아 대학교 인간 및 동물 연구 윤리 위원회의 지침과 승인에 따라 진행되었습니다. 해당되는 경우 사전 동의를 받았으며, 모든 실험은 생의학 연구에서 인간 및 동물 조직 사용에 관한 기관 및 유럽 윤리 기준을 준수했습니다. DMAP가 천천히 녹는 경우, 피부 구조에서 자동 배출되는 것을 방지하기 위해 수술용 접착 밴드로 피부에 고정하세요.
10. 제조사 지침에 따라 테트라졸륨 기반 및 레사주린 기반 검사나 증식 검사(5-Bromo-2'-deoxyuridine bromodeoxyuridinine, BrdU) 검사 등 대사 활성 검사를 사용하여 시험관 내 생체적합성을 평가합니다.
    참고: 선호되는 세포주는 각질세포, 섬유아세포, 또는 멜라닌세포입니다. DMAP에 노출되지 않은 세포는 일반적으로 음성 대조군으로 사용되며, 1% 도데실 황산나트륨(SDS)으로 처리된 세포는 양성 대조군으로 사용됩니다. 생체 적합성 평가는 DMAP의 용해 프로필에 따라 달라집니다. 24시간 이내에 용해되는 빠른 용해형 DMAP의 경우, 세포 노출 전에 장치를 용해시키는 추출물 기반 방법을 사용합니다. 느리게 용해되는 DMAP의 경우, 직접 접촉 방식을 적용하여 장치를 시드 웰에 직접 추가합니다. 국제 표준 ISO 10993 규정에 따르면, 세포 생존 결과>70%는 무독성으로 간주됩니다.

Results

제조된 DMAP는 그림 2A에 나타난 것처럼 균질한 외관과 성공적으로 형성된 마이크로바늘 모양의 돌출을 나타내야 합니다. 색이 있는 화물이 마이크로니들 구조에만 적재될 경우, 소량의 약물이 팁에서 약물 넘침이나 자유 약물 고분자 분산 주조 전 세척 미완성으로 인해 DMAP의 베이스플레이트를 오염시킬 수 있습니다. 하지만 두 구조 사이에는 명확한 차이가 관찰됩니다. 광학 현미경으로 시각화할 때, 미세바늘과 유사한 돌출부는 날카로운 끝을 보여야 하며 변형이 없어야 합니다(그림 2B). 이러한 관측은 주사 전자현미경(SEM) 영상을 통해 확인하는 것이 강력히 권장되지만, 길이 측정 차이는 보통 무시할 만합니다.

DMAP의 압축은 그림 2C에서 볼 수 있듯이 바늘 모양...

Discussion

여기서 설명하는 프로토콜은 DMAP의 준비를 가능하게 합니다. 하지만 DMAP 제조에 사용할 수 있는 다양한 고분자 재료와 다양성 덕분에 다양한 특성을 가진 용해체 장치를 생산할 수 있습니다. 제시된 결과는 PVP라는 고농도의 물 분산성 고분자로 생성되어 빠르게 용해되는 DMAP에 해당합니다. DMAP의 용해 시간은 구성 분자를 단순히 대체하거나 농도를 변경하여 쉽게 조정할 수 있습니다. 따라서 재료 선택은 제조 과정에서 중요한 단계이며, 사용자는 개발된 장치의 이론과 목적에 따라 신중하게 재료를 선택해야 합니다.

또한, 여기 제시된 DMAP들은 마이크로니들 모양의 돌출부 안에서만 화물을 적재하여 시스템이 전달하는 약물의 양을 제한합니다. 특히, 활성 성분의 함량은 최대 5%까지 다양하며; 그러나 분자량, 구조, 성질에 따라 고분자 재료와 다르게 상호작용하며 건조 시 기계적 특성을 변경할 수 있습니다. 따라서 이 유형의...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
세포 배양 12-웰 플레이트	해당 없음	해당 없음	사양은 없습니다. 상업용 12웰 배양 플레이트는 모두 적합합니다
원심분리기	에펜도르프	원심분리기 5810 G	세포 배양 배지에 적응하는 다른 원심분리기로 교체 가능하다
메틸렌 블루	시그마 올드리치	66720	CAS 122965-43-9. 다른 염료나 브랜드로 교체 가능합니다
점토 조형	해당 없음	해당 없음	사양은 없습니다. 상업용 모델링 클레이는 모두 적합합니다
올레핀형 열가소성 시트	암코어	PM996	파라필름 M
폴리(비닐 알코올) (PVA) MW: 9-10 kDa	시그마 올드리치	363146	CAS 9002-89-5. 다른 브랜드로 교체 가능해
폴리(비닐 피롤리돈) (PVP) MW: 40 kDa	시그마 올드리치	PVP40	CAS 9003-39-8. 다른 브랜드로 교체 가능해
폴리디메틸실록산(PDMS) 몰드	마이크로포인트 테크놀로지스	ST-06	배열 바늘 분포 15 x 15; 높이 600 및 마이크로; m; 베이스 200 및 마이크로; m; 바늘 피치 500 & 마이크로; m. 다른 공동체 모양과 길이의 PDMS 몰드로 교체할 수 있습니다
압력 탱크	프로트리마	AT-10HT	4바 압력을 지원하는 다른 압력 탱크로 교체 가능합니다