방법 논문

쥐에서 티모퀴논이 Keap-1/Nrf-2 신호 전달, 산화 스트레스 및 행동에 미치는 영향 평가

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DOI:

10.3791/69924

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2026년 3월 13일

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1Faculty of Medicine, Department of Physiology, Kirsehir Ahi Evran University, 2Faculty of Medicine, Department of Histology and Embryology, Kirsehir Ahi Evran University

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 아만성 델타메트린 노출 쥐 모델에서 티모퀴논이 Keap-1/Nrf-2 경로, 산화 스트레스 바이오마커, 행동 결과에 미치는 영향을 평가하는 방법을 보여줍니다.

초록

최근 농약 노출 연구의 발전으로 항산화제 기반 보호 전략에 대한 관심이 높아졌습니다. 티모퀴논(TQ)은 식물에서 유래한 생리활성 화합물로, 다양한 독성 물질에 대해 보호 효과를 발휘하는 것으로 보고되었습니다. 본 연구는 저용량 델타메트린(DTM)에 노출된 쥐에서 TQ가 산화 스트레스 매개변수, Keap-1/Nrf-2 신호 전달 경로, 행동 결과에 미치는 영향을 평가하는 프로토콜을 설명합니다. 여기서는 24마리의 성체 수컷 Wistar Albino 쥐(250± 20g)를 네 그룹(n=6/그룹)으로 무작위로 배정했습니다: 대조군, TQ, DTM, 그리고 DTM+TQ. DTM(1.28 mg/kg)과 TQ(10 mg/kg)는 30일간 위내로 투여되었습니다. 연구 기간 내내 체중을 모니터링하였습니다. 운동 활동과 불안과 유사한 행동은 31일째 개방 필드 검사를 사용해 평가되었고, 우울증과 유사한 행동은 32일째 강제 수영 검사로 평가되었습니다. 실험 기간이 끝날 무렵, 생화학적, 조직병리학적, 분자 분석을 위해 혈장과 뇌 조직이 수집되었습니다. 혈장 및 대뇌 피질 샘플에서 말론디알데히드, 총 질소, 글루타티온, 설피드릴 그룹 수치를 포함한 산화 스트레스 지표를 측정하였습니다. 켈치 유사 ECH 관련 단백질 1(Keap-1)과 핵 인자 적혈구 2 관련 인자 2(Nrf-2) 발현 수준을 웨스턴 블롯팅과 면역조직화학을 통해 분석하였다. 이 프로토콜은 농약에 의한 신경독성과 항산화 물질의 조절 효과를 조사하기 위한 포괄적이고 재현 가능한 접근법을 제공합니다.

서론

살충제는 농업 및 가정 환경에서 해충 방제를 위해 널리 사용됩니다; 하지만 저용량에 만성적으로 노출되면 인간과 동물 모두에게 환경 오염과 건강에 해로운 영향을 초래할 수 있습니다. 특히 오염된 음식과 물을 통한 이러한 노출은 신경학적 질환 및 기타 전신 독성 위험 증가와 관련이 있습니다1.

피레스로이드가 유기인에 대한 더 엄격한 규제와 상대적으로 낮은 포유류 독성 덕분에 대부분 유기인을 대체했습니다. DTM은 α-시아노 그룹을 포함하는 II형 피레스로이드로, 전 세계적으로 가장 널리 사용되는 살충제 중 하나이며 곤충에 대해 매우 효과적인 것으로 평가됩니다2. 그럼에도 불구하고, 실험 연구들은 DTM 노출이 동물 모델에서 산화 스트레스와 신경독성을 유발한다는 것을 입증했습니다 3,4.

DTM은 혈액-뇌 장벽을 쉽게 통과하며 전압 개폐 나트륨 채널의 개방을 연장시켜 신경 기능을 방해하는 매우 친지성 화합물입니다. 이 효과는 반복적인 신경 발화, 세포 내 나트륨 유입 증가, 반응성 산소 생성 증가를 초래하며, 궁극적으로 산화 손상, 염증, 행동 변화, 특히 해마와 대뇌 피질1과 같은 취약한 뇌 영역에서 나타납니다. 농약에 의한 신경독성에 대한 우려가 커지면서, 자연 자원에서 유래한 항산화제 기반 보호 전략에 대한 관심이 점점 커지고 있습니다. 나이젤라 사티바 에센셜 오일의 주요 생리활성 성분인 TQ는 강력한 항산화, 항염증, 신경 보호 특성을 가진 것으로 보고되었습니다5. 여러 연구에서 화학적으로 유발된 산화 스트레스와 신경퇴행성 과정에 대한 유익한 효과가 입증되었습니다 5,6,7,8,9.

TQ의 보호 효과의 주요 메커니즘 중 하나는 Keap-1/Nrf-2 신호 전달 경로의 조절입니다. 이 경로는 항산화 및 해독 효소의 발현을 조절하여 세포 산화환원 항상성을 유지하는 데 중심적인 역할을 합니다. 산화 스트레스 조건에서 Keap-1이 제재하는 Nrf-2 억제가 완화되어, Nrf-2가 핵으로 이동하여 항산화 반응 요소 의존적 유전자 발현을 활성화할 수 있게됩니다.

DTM 노출은 분자, 생화학, 조직학, 행동 수준에서 변화를 유도하기 때문에, 단일 분석 접근법으로는 신경독성 영향의 전체 범위를 포착하기에 충분하지 않습니다. 따라서 이 프로토콜은 행동 평가, 산화 스트레스 바이오마커 분석, 조직병리학적 평가, Keap-1/Nrf-2 경로의 분자 연구를 통합하여 농약 유발 신경독성과 TQ와 같은 항산화 화합물의 조절 효과를 연구하기 위한 포괄적이고 재현 가능한 틀을 제공합니다.

위에서 요약한 증거를 종합하여 DTM 유발 신경독성의 기전을 명확히 하고 잠재적 보호 개입을 평가하기 위한 통합적 실험적 접근법의 필요성을 강조합니다. 행동 평가와 Keap-1/Nrf-2 경로의 생화학적, 조직병리학적, 분자 분석을 결합함으로써, 본 프로토콜은 산화 스트레스 관련 신경 손상에 대한 다차원적 평가를 가능하게 합니다. 이 기전적 틀 내에서 실험 결과를 해석할 때, TQ가 산화환원 신호를 조절하고 조직 손상을 완화하며 아만성 DTM 노출 상황에서 행동 결과를 개선하는 방식을 강조합니다.

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프로토콜

기관 동물 실험 지역 윤리 위원회는 등록번호 68429034/35로 실험 프로토콜을 승인했습니다. 연구의 총 기간은 32일이었습니다. 실험 이전에 동물들은 표준 실험실 환경에 적응했습니다. 모든 실험 절차는 기관 및 국제 동물 윤리 지침을 엄격히 준수하여 수행되었습니다. 이 프로토콜에서 사용된 실험 재료는 재료표에 나열되어 있습니다.

참고: 화학 및 생물학적 폐기물은 기관의 실험실 안전 및 폐기물 관리 지침에 따라 처리되었습니다. 산, 염기, 유기 용매는 별도의 라벨이 붙은 용기에 수거되어 기관 유해 폐기물 부서로 전달되었습니다. 생물학적 물질과 오염된 소비재는 생물학적 위험 용기에 수거되어 멸균된 후 적절한 기관 시설로 이송되어 최종 폐기되었습니다.

1. 실험 설계

  1. 동물실험 연구소에서 250± 20g의 성체 수컷 위스타 알비노 쥐 24마리를 확보하세요. 각 쥐는 24± 2°C의 우리에 개별적으로 우리에 가두고, 12시간의 밝고 어두운 주기를 가집니다. 자유 롭게 표준 쥐 밥과 수돗물을 사용할 수 있습니다.
  2. 동물을 무작위로 네 그룹으로 나눕니다(n=6명): 그룹 1: 대조군(C), 그룹 2: TQ, 그룹 3: DTM, 그룹 4: DTM + TQ.
  3. DTM(순도 98%)을 옥수수유에 녹여 1.28 mg/kg의 용량으로 위내 가베지를 통해 30일간 투여합니다.
  4. TQ를 10 mg/kg 용량으로 옥수수 오일에 녹여 30일간 위내 개베지를 통해 투여합니다. 모든 약물 용액은 매일 신선하게 준비하여 총 용량 1 mL/kg로 투여하세요.
  5. 복합 치료군에서는 DTM 직후 TQ를 투여합니다. 대조군에게는 옥수수 기름만 투여하여 게베지 관련 스트레스를 고려하세요.
    참고: DTM 용량은 이전 문헌을 바탕으로 병환율을 일으키지 않고 산화 스트레스를 유발하도록 선택되었으며, LD501의 약 1/1에 해당합니다.

2. 체중 측정

  1. 연구 1일, 10일, 20일, 30일차에 체중을 측정합니다(그림 1).

3. 행동 매개변수

  1. 모든 행동 검사는 일관성을 보장하기 위해 표준화된 조건 하에서 수행하세요. 강제 수영 테스트(FST)와 오픈 필드 테스트(OFT)를 모두 시험 장비를 전면적으로 촬영할 수 있는 오버헤드 카메라를 사용하세요. 조명은 약 100–150 럭스로 유지하세요. 움직임 제한을 자세와 호흡을 유지하는 데 필요한 최소한의 움직임을 제외하고는 활동적인 움직임이 전혀 없는 상태를 정의합니다. 모든 시험장을 동물 간 70% 에탄올로 청소하여 후각 영향을 방지하세요.
  2. FST
    1. 32일째에 우울증과 유사한 행동을 평가하기 위해 FST를 수행하세요. 5분 테스트 세션 24시간 전에 15분간 사전 테스트 세션을 실시하여 동물들이 수중 환경에 익숙해지고 새로움으로 인한 스트레스를 최소화합니다. 사전 시험 세션 중에는 행동 채점(behavioral scaling)을 하지 마십시오.
    2. 쥐를 각각 원통형 용기(직경: 35cm, 높이: 50cm)에 넣고, 30cm의 물을 담고 25± 1°C에서 5분간 유지합니다.
    3. 비디오 카메라를 사용해 수영, 등반, 움직임 불편 상태를 기록하세요. 비디오 녹화에서 행동 매개변수를 초 단위로 정량화하세요10.
    4. 행동을 다음과 같이 정의합니다:
      움직임 정지: 동물이 떠 있는 상태에서 머리를 물 위에 유지하기 위해 최소한의 움직임만 할 때 움직이지 않는 것으로 간주합니다.
      수영: 수영을 네 발 모두가 조화롭게 움직이며 원통 전체를 능동적으로 수평으로 움직이는 것으로 정의합니다.
      등반: 등반을 동물이 수직 자세를 유지하면서 앞발을 실린더 벽에 힘차게 위로 향하게 움직이는 것을 정의합니다.
    5. 동물이 완전히 움직이지 않는 상태라면, 미리 정의된 기준에 따라 행동을 정지로 평가합니다.
    6. 시험 세션 중에는 외부 자극이나 방향 수정을 하지 마십시오. 안전상의 이유(예: 익사 위험)가 필요하지 않는 한 동물이 5분 동안 자유롭게 행동하도록 허용하세요.
  3. OFT
    1. 31일째에 운동 활동과 불안과 유사 행동을 평가하기 위해 OFT를 실시합니다.11. 90 x 35cm 크기의 경기장에서 5분간 개별 움직임을 기록하며, 검은 선으로 24개의 동일한 단위로 나누어 있습니다.
    2. 집단 배정에 눈이 가려진 조사관의 영상 녹화에서 다음과 같은 행동 매개변수를 정량화하라:
      네 발 모두 건너는 횟수(운동 활동)
      중심과 주변 영역에서 보내는 시간(불안과 유사한 행동)
    3. 동물이 완전히 움직이지 않는 경우, 그 행동을 정지로 기록하고 그 기간 동안 횡단을 0번 할당합니다.
    4. 테스트 세션 중에는 외부 자극, 재배치, 또는 경로 수정을 하지 마십시오.
    5. 안전상의 개입이 필요하지 않은 한 5분 동안 동물이 자유롭게 행동하도록 허용하세요.
    6. 동물 사이에 70% 에탄올로 경기장을 청소해 후각 신호를 제거하세요.

4. 산화 스트레스 표지자의 평가

  1. 모든 시술은 32일째에 시행하세요. 근주사 자일라진(5 mg/kg)과 케타민(45 mg/kg)으로 쥐를 심하게 마취합니다. 페달 철수 반사가 없으면 깊은 마취를 확인하세요. 심장 천자를 통해 약 3–5mL의 혈액을 EDTA 코팅된 튜브에 채취합니다.
  2. 심마취 하에서 출혈로 완전한 안락사를 하고, 조직 채취 전에 사망을 확정하세요. 3,000 x g 에서 4°C에서 10–15분간 원심분리기 혈액 샘플을 채취합니다. 버피 코트를 손상시키지 않고 혈장을 조심스럽게 수집하고, 알리쿼트는 −80 °C에 보관하세요. 얼음 위에 뇌를 빠르게 해부하세요. 생화학적 분석을 위해 좌뇌반구와 해마를 분리하고, 액체 질소(−80 °C 저장)에서 급동합니다. 조직학적 평가를 위해 10% 중성 완충 포르말린에 오른쪽 대뇌 반구를 고정합니다.
  3. 혈장 산화 스트레스 분석
    1. 혈장 지질 과산화 (TBARS 분석)
      1. 원심분리기 플라즈마 샘플(3,000 x g, 10분, 4 °C). 0.5 mL 혈장과 1mL TCA–TBA–HCl 시약(15% 트리클로로아세트산(TCA), 0.375% 티오바르비투르산(TBA), 0.25 N 염산(HCl))을 혼합합니다. 1,000 x g 에서 원심분리기를 10분간 사용한 후 상원액을 유리관에 옮깁니다. 인공 산화를 방지하기 위해 0.02% 부틸화 하이드록시톨루엔(BHT) 50 μL을 추가하세요.
      2. 100 °C에서 15분간 가열한 후 실온으로 냉각, 1,000 x g 에서 10분간 원심분리하고, 532 nm10에서 상원 흡수율을 측정합니다. Beer–Lambert 법칙을 사용하여 MDA 농도를 계산합니다
        ε = 1.56 ×10 5 M⁻1 cm⁻1, l = 1 cm이며, nmol/mL 혈장으로 발현됩니다.
    2. 혈장 티올(RSH) 수치
      1. 혈장 0.5 mL에 1% 도데실 황산나트륨(SDS)과 2 mM 에틸렌디아미네테트라아세트산(EDTA)을 포함한 트리스-HCl 완충제(100 mM, pH 8.2)를 혼합합니다. 25 °C에서 5분간 인큐베이팅한 후 원심분리기(3,000 x g, 10분, 4 °C)로 보관합니다. 상정액을 분석할 때 사용하세요.
      2. 0.3 mM 5,5′-디티오비스(2-니트로벤조산)(DTNB)를 첨가하고 37°C에서 15분간 배양합니다. 412 nm10에서 흡광도를 측정하세요. RSH 농도를 ε = 13,600 M⁻1 cm⁻1 로 계산하고 μmol/L 플라즈마로 표현합니다.
    3. 혈장 NOx 농도 (그리스 반응)
      1. 혈장을 0.3M 수산화나트륨(NaOH)과 5% 황산 아연(ZnSO₄)으로 탈단백합니다. 20,000 x g 에서 5분간 원심분리기로 넣고 상원액을 채취합니다.
      2. 질산염 용액(100, 10, 1 mmol/L)을 준비하고 표준 곡선(1–100 μmol/L)을 생성합니다. 100 μL의 상정액(중복 웰)을 마이크로플레이트에 주입합니다.
      3. 바나듐(III) 염화물(VCl₃) 100 μL 후 50 μL 설파닐아마이드, 50 μL N-(1-나프틸) 에틸렌디아민을 추가합니다. 상온에서 30–45분간 배양하고 540 nm10에서 흡수 측정. 표준 곡선에서 NOx 농도를 산출하여 μmol/L 플라즈마로 표현합니다.
  4. 조직 산화 스트레스 분석
    1. 모든 생화학적 분석에는 약 100mg의 좌뇌 반구 조직을 사용하세요.
    2. 조직 지질 과산화 (TBARS 분석)
      1. 조직을 1:10 w/v로 얼음처럼 차갑게 넣어 10% TCA에 균질화하세요. 0.67% TBA의 같은 부피를 넣고 100°C에서 15분간 가열하세요. 냉각 및 원심분리기 (3,000 x g, 10분, 4 °C)10. 535nm에서 상상액 흡수도를 측정하세요. MDA는 ε = 1.56 × 105 M⁻1 cm⁻1 을 사용하여 nmol/g 습한 조직으로 표현합니다.
    3. 조직 글루타티온(GSH) 수치
      1. 조직을 10% TCA(1:10 w/v)와 원심분리기(3,000 x g, 10분, 4 °C)에서 균질화합니다. 상원 0.5mL와 DTNB 용액 2mL(1% 시트레이트나트륨 내 0.4 mg/mL)를 혼합합니다10. 즉시 412nm에서 흡광도를 측정하세요. GSH는 ε = 13,600 M⁻1 cm⁻1 을 사용하여 μmol/g 습윤 조직으로 표현합니다.
    4. 조직 NOx 수치 (그리스 반응)
      1. 인산염 완충 생리식염수(PBS)(1:5 w/v)와 원심분리기(2,000 x g, 5분)에서 조직을 균질화합니다. 상상유액을 0.3 M NaOH와 5% ZnSO₄로 탈단백합니다. 원심분리기(3,000 x g, 20분)를 사용해 투명한 상원액을 채취합니다.
      2. 질산염 표준 물질(1–100 μmol/L)을 준비합니다. 중복된 웰에 100 μL의 상정액을 주입하세요. 위에서 설명한 VCl₃과 Griess 시약을 추가하세요. 37 °C에서 45분간 배양하고 540 nm10에서 흡수 측정. 표준 곡선에서 농도를 결정하고 μmol/g 조직으로 표현합니다.
        주의: TCA, HCl, NaOH, 유기 용매 등 유해 화학물질을 사용하는 절차는 인증된 화학 연기 후드에서 수행되었습니다. 실험 전반에 걸쳐 실험복, 화학물질 저항 장갑, 보호 안경, 필요 시 얼굴 보호대 등 적절한 개인 보호 장비(PPE)가 사용되었습니다. 모든 화학물질은 기관 안전 지침과 관련 물질 안전 데이터 시트(MSDS)에 따라 취급되었습니다.

5. 서부 블롯 분석을 통한 Keap-1 및 Nrf-2 수준 결정

  1. 해마 조직을 50mg 조각으로 잘라내어 500 μL RIPA 완충제와 프로테아제 억제제 혼합물이 포함된 균질화 튜브에 넣습니다.
  2. 적절한 양의 자기 구슬을 추가하고 1,000 x g 에서 두 사이클 동안 균질화합니다. 원심분리기 14,000 x g 기준 4°C에서 10분간 가열.
  3. 상원액을 깨끗한 미세원심분리관으로 옮긴 후 같은 조건에서 다시 원심분리합니다. 샘플을 얼음에 보관하고 단백질 농도를 측정하세요.
  4. 제조사의 지침에 따라 Protein BR Assay Kit을 사용해 형광도계를 사용해 단백질 농도를 측정하세요.
  5. 전기영동을 위해 10% SDS–PAGE 겔을 준비합니다. 단백질 농도를 30 μg/μL로 조절합니다.
  6. 3:1 비율로 라엠리 버퍼 4개를 추가하고 10% β-머캅토에탄올을 보충하세요. 95°C에서 5분간 샘플을 가열한 후 잠시 원심분리합니다.
  7. 각 레인당 단백질 마커 5 μL과 단백질 30 μg 단백질을 로드합니다. 110V에서 젤을 60분에서 90분 동안 돌리세요.
  8. PVDF 막을 100% 메탄올에서 3–5분간 활성화한 후, 1× 전이 버퍼에서 10분간 상온에서 평형을 맞춘 후 옮깁니다.
  9. 필터 페이퍼와 스펀지는 옮겨 버퍼를 사용해 적셔서 옮겨 샌드위치를 조심스럽게 조립하여 공기 방울을 완전히 제거하세요. 100V의 습식 전달 시스템을 사용하여 4 °C(일정 전압)에서 90분간 단백질 전달을 수행합니다.
  10. 3% 소 혈청 알부민(BSA)에 막을 1시간 동안 상온에서 궤도 셰이커에서 차단합니다. 4°C에서 1차 항체를 3% BSA에 희석한 상태로 하룻밤 배양합니다(Keap-1 및 Nrf-2, 1:3,000; β-액틴, 1:1,000).
  11. 5분 동안 5회 세척하며, 0.1% Tween 20 세제가 포함된 × 3 생리식염수 1개를 사용하세요. 2차 항체(1:15,000)와 함께 실온에서 어두운 환경에서 1시간 인큐베이팅합니다.
  12. 설명한 대로 멤브레인을 세척하고 제조사 지침에 따라 강화 화학발광(ECL) 기판(예: 루미놀 기반 HRP 기판)과 함께 배양하세요(사용 직전 동일한 부피의 시약 A와 B를 혼합). 멤브레인 표면을 완전히 덮을 만큼 충분한 기질(멤브레인당 약 1mL)을 적용하고 상온에서 1–2분간 배양합니다.
  13. 화학 발광 신호를 검출할 수 있는 디지털 영상 시스템을 사용하여 검출할 수 있습니다(특정 여기 파장은 필요 없으며, 빛은 HRP–루미놀 반응에서 발생). 자동 노출 설정을 사용해 이미지를 획득하되, 채도 밴드가 없도록 하세요. 동일한 블롯 내 모든 샘플에 대해 동일한 노출 매개변수를 유지하세요.
  14. 동일한 ROI 선택, 배경 뺄셈, 정규화 매개변수 하에 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 덴시토메트릭 분석을 수행합니다. Keap-1과 Nrf-2 밴드 강도를 해당 하우스키핑 단백질 β-액틴에 정규화합니다. 정규화된 값을 통계 분석용 .csv 파일로 내보내세요.

6. 조직병리학적 분석

  1. 오른쪽 대뇌 반구를 10% 중성 포르말린으로 72시간 고정하세요. 등급별 에탄올 시리즈(70%–100%)를 통해 탈수한 후 파라핀에 박힌 후 5 μm에서 절단합니다.
    Paxinos & Watson의 『The Rat Brain in Stereotacic Coordinates』(Academic Press)에서 정의된 입체 좌표에 따라 해마 및 내감각 피질 수준에서 관상뇌 절편을 얻습니다. 인터랙티브 쥐 뇌 지도 뷰어(https://labs.gaidi.ca/rat-brain-atlas 를 사용하여 해부학적 위치를 확인하고 정밀하게 조정하세요11.
  2. 표준 조직학적 절차를 사용하여 파라핀 내재 뇌 조직에서 4개의 연속 관상 절편(두께 5μm)을 준비합니다. 기존 프로토콜에 따라 헤마톡실린과 에오신(H&E)으로 절편을 염색합니다12. 모든 슬라이드를 200× 배율로 광학 현미경으로 검사하세요. 관찰자 편향을 최소화하기 위해 조직학적 평가를 블라인드 연구자가 수행하도록13.
    참고: 이 절차는 그룹 간 일관된 해부학적 비교를 보장했습니다.
  3. 각 절편당 10개의 무작위 영역에서 신경 손실, 세포 부종, 핵 피크시스, 염증 침윤, 혈관 울혈을 반정량적으로 평가합니다.
  4. 각 그룹별 매개변수별 평균 점수를 계산하세요. 평가 기준은 다음과 같았습니다: 0(없음, <5%), 1(경미<33%), 2(중등도, 33–66%), 3(중증, >66%; 표 1).

7. 해마와 후감피질에서 Nrf-2 및 Keap-1 반응성에 대한 면역조직화학적 분석

  1. 해마와 후후피질에서 5μm 두께의 조각을 준비하여 유리 슬라이드에 부착합니다.
  2. 절단부를 탈파라핀 및 재수화한 후, 상온에서 인산염 완충 식염수(PBS)에 세척합니다.
  3. 3% 과산화수소로 절편을 5분간 배양하여 내인성 과산화효소 활성을 차단합니다. PBS와 함께한 워시 섹션
  4. 슬라이드를 시트산나트륨 버퍼(pH 6.0)에서 10–15분간 가열하여 항원 회수를 수행합니다. 슬라이드를 30분 식힌 후 PBS로 세척하세요.
  5. 과산화수소 3%로 절편을 15분간 배큐하여 완전한 과산화효소 억제를 보장합니다. PBS로 세척하는 부분.
  6. 비특이적 결합을 줄이기 위해 차단액을 10분간 발라주세요. 절편을 4°C에서 하룻밤 동안 Nrf-2(1:100 희석)와 Keap-1(1:200 희석)에 대한 1차 항체와 함께 인큐베이팅합니다. 부화 후에는 PBS로 부위를 세척하세요.
  7. 적절한 2차 항체와 함께 절편을 상온에서 30분간 배양합니다. PBS로 세척하는 부분.
  8. 절편에 스트렙타비딘-과산화효소를 적용한 후 가습 챔버에서 실온에서 20분간 배양합니다(적은 필터 종이를 넣은 밀폐된 배양 상자를 사용해 상대습도를 95–100% 유지). 부화 후에는 PBS로 부위를 세척하세요.
  9. DAB 크로모겐을 적용하고 100× 배율로 광학 현미경으로 색 현상을 모니터링합니다. 수돗물로 슬라이드를 헹구면 반응을 멈추세요.
  10. 상온에서 5분간 희석한 헤마톡실린으로 부분을 반염색하세요. PBS와 증류수로 깨끗이 헹구세요. 영구 장착 매체를 사용해 섹션을 장착하세요.
  11. 착색된 부분을 현미경으로 살펴보세요. 16개의 대표 필드에서 ×400 배율로 사진현미경을 촬영합니다.
  12. 영상 분석 소프트웨어를 사용하여 Nrf-2와 Keap-1 면역반응성을 정량화합니다. 추가 통계 평가를 위해 정량화된 데이터를 기록하고 분석하세요.
  13. 면역조직화학 분석을 위해 ImageJ에서 이미지를 열고 Set Scale 도구를 사용해 보정하세요. 모든 이미지를 8비트 그레이스케일로 변환하여 강도 측정을 표준화하세요. 긍정적으로 착색된 영역과 인접한 배경 영역에 대해 관심 영역(ROI)을 수동으로 정의하고 ROI 관리자에 저장하세요.
  14. 일관된 H-DAB 색상 디컨볼루션을 사용하여 염색 강도를 정량화하고, 모든 샘플에서 동일한 임계값 매개변수를 적용합니다. 평균 회색값, 광학 밀도, 양의 면적 비율을 측정합니다.
  15. 셀 기반 분석의 경우, Watershed 도구를 사용해 임계값 이미지를 세그먼트하고, Analyze Particles를 사용해 양성 셀을 정량화합니다. 모든 데이터는 통계 분석을 위해 .csv 파일로 내보내졌습니다.

8. 통계 분석

  1. SPSS 버전 29.0을 사용하여 통계 분석을 수행하세요. 데이터 뷰 탭에 원시 데이터를 입력하고, 각 행은 개별 동물과 변수 뷰 탭에서 정의된 변수를 나타냅니다; 실험 그룹은 범주 변수(Control, TQ, DTM, DTM+TQ)로 코딩되었습니다.
  2. Shapiro–Wilk 검정을 사용하여 데이터 정규성을 평가하려면 'Analyze > Descriptive Statistics > Explore'를 선택하고, 결과 변수를 종속 목록에 할당하며, 그룹을 요인 목록에 할당하고, 검정이 포함된 정규성 플롯을 활성화합니다. 정규분포 변수의 경우, Analyze > Compare Means> One-Way ANOVA를 통해 분산 분석(ANOVA)을 사용해 그룹 비교를 수행하며, 옵션 항목에서 기술통계와 Levene의 균일성 검정을 활성화합니다.
  3. 유의미한 주 효과가 감지되면, Tukey의 사후 검사를 Post Hoc 메뉴를 통해 쌍별 그룹 차이를 식별합니다. Levene의 검정 결과를 사용하여 분산 균일성(p > 0.05)을 확인하라.
  4. 모수학적 가정을 충족하지 못하는 조직병리학적 점수 데이터에 대해서는, Kruskal–Wallis 검정을 사용하여 Kruskal–Wallis 검정을 사용하여 ' Analyze > Nonparametric Tests > Legacy Dialogs > K 독립 표본을 선택하고, 이어서 독립 표본 비모수 검사 모듈을 이용한 Dunn의 사후 검정과 Bonferroni 보정을 수행하세요.
  5. 통계 산출물과 요약표를 .xls 또는 .csv 파일로 내보내며, 결과는 평균 ± 표준편차(SD)로 표현되었고, p값 0.05< 통계적으로 유의미한 것으로 간주되었습니다.

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결과

체중 측정
체중은 1일, 10일, 20일, 30일차에 기록되었습니다. C 및 TQ 그룹의 쥐는 실험 기간 동안 체중이 점진적으로 증가했으며, 30일째에는 이들 그룹 간에 유의미한 차이가 없었습니다. 반면, DTM에 노출된 쥐는 대조군에 비해 체중이 유의미하게 감소하는 모습을 보였습니다. TQ의 병용 투여는 DTM 관련 체중 감소를 완화시켰습니다. 연구 기간 동안 사망자는 관찰되지 않았습니다 (그림 1).

행동 평가
운동 활동
운동 활동은 개방 필드 테스트에서 격자 교차 횟수로 평가되었습니다. C 그룹과 TQ 그룹은 유사한 운동 활동을 보였다. DTM 노출은 교차 횟수를 유의미하게 감소시켰으며, TQ 병용 투여는 DTM 그룹에 비해 운동 활동이 부분적으로 증가했습니다 (...

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토론

이 연구는 비만성 경구 DTM 노출이 쥐에서 일관된 행동, 생화학적, 분자적, 조직병리학적 변화를 유발하며, TQ가 병용 시 이러한 영향을 효과적으로 완화함을 입증합니다. 표준화된 행동 검사와 산화 스트레스 프로파일링, Keap-1/Nrf-2 신호 전달의 경로 수준 분석, 조직병리학적 평가를 통합함으로써, 이 프로토콜은 농약 유발 신경독성과 항산화제 기반 신경보호 평가를 위한 견고하고 재현 가능한 틀을 제공합니다.

선택된 DTM 용량(1.28 mg/kg/day, 경구 개베이지, 30일)은 확립된 아만성 노출 모델을 기반으로 하였으며, 사망률이나 급성 전신 독성을 유발하지 않으면서도 측정 가능한 신경행동 및 생화학적 효과를 발생시켰다14. 유사한 투여 및 노출 경로를 사용한 이전 연구들과 일치하게, DTM 처리된 쥐는 OFT 1,15,1...

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공개 사항

저자들은 이해 충돌이나 재정적 이해관계 상반이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 외부 자금 지원을 받지 못했습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
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5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산)열로 과학  그리고 nbsp; 69-78-3 
벤치탑 원심분리기 NF048Nü ve43560
Beta_Actin 서모피셔 사이언티픽, 미국7D2C10
BSA 솔루션 & nbsp;프로틴테크, 미국)66201-1-Ig
부틸화 하이드록시톨루엔시그마 올드리치128-37-0
디지탈 호모헤니자트&우름; r 다이한 사이언티브https://www.artlaboratuv<브르/> arcihazlari.com/urun/dai<브르/> han-hg-15d-dijital-homoje
nizator-set-a?srsltid=Afm
BOorx_az06ulcHpSzKZs
uP8-47Za4BkvLOM22Xh
p00tgwWhJ-86Vc
DTM  그리고 nbsp;바이엘 TR01426058O
헤마톡실린과 다시; 에오신 바이오 옵티카W01030708
염산머크7647-01-0
이미지 J 소프트웨어 프로그램 NIH; 미국 워싱턴https://imagej.net/ij/
면역조직화학 염색 키트  Lab VisionTM UltraVisionTM 대용량 감지 시스템: 안티-다가성HRP, TA-125-HL
라이카 오토컷 14051956472독일https://www.leicabiosystems
.com/histology-equipment/mi
크로토메/히스토코어-오토컷/
광각 현미경  니콘, 이클립스 니-우, 940728
N-(1-나프틸)에틸렌디아민열로 과학  1465-25-4
나노 마이크로플레이트 리더BMG 랩테크스펙트로스타 나노
인산 완충 식염수&NBSP;머크P4417
1차 항체 Keap-1 단백질 기술카탈로그 번호 10503-2-AP, 1:200
1차 항체 Nrf-2 및 nbsp;단백질 기술카탈로그 번호 16396-1-AP, 1/100
큐비트 단백질 BR 분석 키트  서모피셔 사이언티픽-인비트로젠Q33211
시트레이트 나트륨머크03-04-6132
도데실 설페이트 나트륨열로 과학  151-21-3
수산화나트륨머크1310-73-2
질산나트륨머크7631-99-4
스트렙타비딘 페르옥시다아제 열로 과학  SHRP248-B
설파닐아마이드열로 과학  그리고 nbsp; 63-74-1 
티오바르비투르산 머크504-17-6
TQ 케이먼 490-91-5
트리카르발릴산, 99%열보 사이언티브 케미컬스그리고 nbsp; 139360500
트리클로로아세트산열보 사이언티브 케미컬스76-03-9
트리스-HCl열로 과학  그리고 nbsp; 1185-53-1 
염화바나듐(III)시그마 올드리치7718-98-1
West Pico PLUS 화학발광 기질과 iBright 750 써모피셔 사이언티브 시스템https://www.clinxsci.com/product<브레르/> /mini_chemiluminescence_imagi
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황산아연 용액머크7733-02-0

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