도파민에 대한 선택성 향상을 위한 세로토닌 반응성 ssDNA-SWCNT 나노센서의 머신러닝 지원 라만 스펙트럼 분석

Summary

이 프로토콜은 ssDNA로 감싼 SWCNT 나노센서의 라만 스펙트럼 분석을 설명하며, 머신러닝 모델의 도움을 통해 도파민에 대한 세로토닌의 선택적 측정을 개선할 수 있게 합니다.

Abstract

세로토닌(5-하이드록시트립타민, 5-HT)은 신경조절에 중요한 역할을 하지만, 현재의 검출 방법으로는 5-HT를 높은 민감도와 선택성으로 실시간으로 감지하는 데 어려움을 겪고 있습니다. 우리는 이전에 근적외선 세로토닌 나노센서(nIRHT)를 개발했는데, 이는 ssDNA로 감싸진 단일 벽 탄소 나노튜브로 구성되어 5-HT를 민감하게 감지합니다. 하지만 nIRHT의 형광 반응은 5HT와 도파민(DA)을 구별하지 못해 실용적 응용이 제한됩니다. 본 연구에서는 라만 분광학과 머신러닝을 결합하여 이러한 선택성 문제를 극복했습니다. G-밴드 스펙트럼 특징은 5HT와 DA가 nIRHT에 결합하는 뚜렷한 특징을 보여주었으며, DA가 G-밴드 억제를 더 크게 유발하는 경우가 나타났습니다. 우리는 분석물질 특이적 스펙트럼 변화를 분리하기 위해 차분 라만(ΔRaman)을 사용했고, 분류를 위해 세 가지 머신러닝 모델을 훈련시켰습니다. ΔRaman을 사용한 무작위 숲 모델은 95.8%의 정확도로 최적의 성능을 달성했으며, 원시 라만 스펙트럼을 사용한 모델보다 훨씬 뛰어난 성능을 보였습니다. 이 접근법은 특이성이 향상되어 아세틸콜린, GABA, 글루타메이트에 대한 반응이 거의 없었고, 생리학적 적용에 적합한 0.1 μM의 검출한계를 달성했습니다. 이 라만 기반 접근법은 비선택적 nIRHT 형광 센서를 강력한 신경전달물질 구별이 가능한 플랫폼으로 전환하여 단일벽 탄소 나노튜브(SWCNT) 기반 분자 센싱에서의 선택성 문제를 극복합니다.

Introduction

세로토닌(5-하이드록시트립타민, 5-HT)은 기분, 인지, 수면, 식욕을 조절하는 중요한 신경전달물질이며, 기능 장애는 우울증, 불안 및 기타 신경정신과 장애와 관련이^{있습니다.} 생물학적 시스템에서 세로토닌 역학을 실시간으로 모니터링하는 것은 시냅스 전달의 밀리초 단위와^{신경 조직의} 복잡한 화학 환경 때문에 여전히 도전적입니다. 신경전달물질 검출 기술의 상당한 발전에도 불구하고, 세로토닌에 대한 높은 감도와 분자 선택성을 모두 달성하는 것은 여전히 상당한 분석 과제를 제시하고 있습니다.

현재 세로토닌 검출 방법은 전통적인 분석 기법부터 신흥 나노센서 플랫폼에 이르기까지 다양합니다. 전기화학 검출을 이용한 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC-ED)는 여전히 금본위로 남아 있으며, 0.056 nM의 검출 한계와 우수한 재현성을 달성^합니다. 하지만 HPLC는 광범위한 샘플 준비와 15-30분 분석 시간이 필요해^{실시간 모니터링이} 불가능합니다. 고속 스캔 순환 볼트탐트(FSCV)는 탄소 섬유 미세전극에서 초초 수준의 시간 해상도를 가능하게 하지만, 전극 오염과 구조적으로 유사한 신경전달물질 간의 제한된 선택성 문제를 겪는다 ^5,6. iSeroSnFR⁷과 GRAB-5HT⁸을 포함한 유전자 암호화 형광 센서의 최근 개발은 놀라운 감도와 역량을 달성하지만, 표적 조직의 유전적 변형이 필요해 임상 번역이 제한되고 있습니다.

단일 벽 탄소 나노튜브(SWCNT) 광학 센서는 라벨 없는 신경전달^{물질 검출}을 위한 유망한 플랫폼으로 떠올랐습니다. DNA 기능화된 단단면CNT는 분석물 결합 시 근적외선(nIR) 형광 변조를 보이며, 조직 투명 창(900-1400 nm)에서 검출할 수 있게 합니다^10,11. 랜드리 연구팀은 지수 농축(SELEC)에 의한 리간드의 체계적 진화를 통해 nIRHT 센서를 개발했으며,^10~10개의 고유 ssDNA 서열을 스크리닝하여 세로토닌 반응 구조체를 식별했습니다¹². 이 센서는 세로토닌 결합 시 200% 형광 증강을 갖춘 미세몰 감도를 달성하며, 도파민이나 세로토닌 산화와는 독립적으로 작동합니다. 산화 간섭을 배제하기 위해, 이전 연구에서는 이러한 신경전달물질 용액의 안정성을 확인했습니다; UV-Vis와 NMR 분석 결과, 순수 5HT¹²와 비교했을 때 산화 변화나 새로운 피크 형성이 없음을 확인하였습니다. 더불어, 이 시스템에서 사용되는 짧은 배양 시간과 중성 pH 조건은 상당한 퀴논 형성을 방지하기 위해 설계되었습니다. 마찬가지로, 스트라노 연구팀은 코로나 상 분자 인식(CoPhMoRe)을 개척하여 (GT)₁₅ 감싼 SWCNT가 11 nM 농도에서 도파민을 감지함을 입증했다¹³. 우리 연구팀은 최근 기계 학습 유도 최적화를 통해 이 분야를 발전시켰으며, 체계적으로 돌연변이된 서열에 대한 고처리량 스크리닝을 통해 2.5배의 민감도를 향상시켰습니다¹⁴.

이러한 발전에도 불구하고, 세로토닌과 도파민 간의 선택성이 부족하다는 근본적인 한계가 여전히 존재합니다. 두 신경전달물질 모두 방향족 고리와 에틸아민 사슬을 포함하며, 하이드록실기¹⁵ 차이만 있습니다. 현재의 형광 기반 SWCNT 센서는 일반적으로 5:1 미만의 선택비를 달성하여, 시냅스 환경에서 공동 방출된 신경전달물질을 구별하기에 부적절하다¹⁶. 이러한 선택성 문제는 세로토닌과 도파민이 보상과 동기를 조절하는 뇌 영역에서 종종 공존하기 때문에 특히 중요합니다¹⁷.

라만 분광법은 SWCNT 분석 복합체¹⁸의 진동 모드 분석을 통해 보완적인 화학 정보를 제공합니다. SWCNT의 G-밴드(~1580 cm⁻¹)는 G⁺와 G⁻ 성분으로 나뉘며, 분자 흡착과 전자^도핑에 민감한 주파수를 가집니다. 이전 연구에서는 SWCNT의 비공유 계면활성제가 G-밴드 영역²⁰에서 뚜렷한 라만 스펙트럼 변화를 유도한다는 것을 보여주었습니다.

본 연구에서는 nIRHT 센서의 머신러닝 지원 라만 스펙트럼 분석을 통해 세로토닌과 도파민 간의 선택성을 향상시키는 것을 시연합니다. 0.01에서 100 μM까지 농도 의존적 라만 반응을 체계적으로 특성화하여 각 신경전달물질별로 뚜렷한 스펙트럼 지문을 밝혀냈습니다. 세 가지 머신러닝 모델—합성곱 신경망(CNN), 지지벡터 기계(SVM), 랜덤포레스트(RF)—가 스펙트럼 데이터셋에서 학습되어 분석물 동일성을 분류하였습니다. 특히 분석물질 특이적 특징을 분리하기 위해 기준선 신호를 제거하는 차동 라만 처리를 도입했습니다. DR 처리를 적용한 최적화된 RF 모델은 95.8%의 분류 정확도를 달성하여 분자 분별 능력에서 중요한 진전을 의미합니다. 이 다중 모달 접근법은 nIR 형광 감도와 라만 화학적 특이성을 결합하여 복잡한 생물학적 환경에서 실시간 선택적 세로토닌 모니터링으로 가는 길을 제공합니다.

Protocol

1. ssDNA 기능화된 SWCNT nIRHT 나노센서 제작

1. 1.5mL 튜브에 1mg의 단일벽 탄소 나노튜브(SWCNT), 100 μL 100 mM E6#9 ssDNA, 1x 인산염 완충 생리식염수(PBS) 900 μL를 결합합니다.
   주의: 건조한 SWCNT 분말은 흡입 위험이 있습니다. 분말은 인증된 화학 연기 후드 안에 보관하고, 마스크와 장갑 등 적절한 개인 보호 장비를 착용하세요.
2. 혼합물을 욕조 소닉케이터로 5분간 분산시킵니다. 3mm 프로브가 장착된 팁 소닉네이터를 사용해 50% 진폭으로 얼음 목욕에서 30분간 초음파 처리합니다.
3. 초음파 처리된 용액을 21,500 x g 에서 1시간 원심분리하여 비분산 단단핵 CNT를 침전시킵니다. 850 μL의 상상액을 조심스럽게 수집하여 새 튜브로 옮깁니다.
4. 수집된 SWCNT 현탁액의 흡광도를 632nm 파장에서 측정합니다. SWCNT 소멸 계수 0.036 (mg/L)⁻¹ cm⁻¹을 사용하여 농도를 계산합니다. 최종 nIRHT 센서 용액은 4°C에서 보관하여 추가 사용을 기다립니다.

2. 라만 스펙트럼 측정

1. 10 mg/L nIRHT 분산 중 90 μL를 96웰 플레이트에 적재합니다. 532 nm 레이저 여기 소스를 사용하여 PBS 버퍼에서 센서의 라만 스펙트럼을 측정합니다. 이 기록된 스펙트럼을 기준선으로 설정하세요.
   주의: 생생물 샘플을 조사할 때는 레이저 출력을 10 mW, 파장을 532nm로 엄격히 유지하는 것이 매우 중요합니다. 높은 레이저 출력은 심각한 광독성을 유발하고 세포 생존력을 저해할 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용된 532 nm 10 mW 레이저는 살아있는 세포 분석에 안전하고 비파괴적임이 입증되었으며, 민감한^{소기관 21} 과 1차^뉴런의 전기생리 활성을 보존하면서 견고한 라만 신호 획득을 보장합니다.
2. 각 90 μL 센서 용액(10mg/L)에 분석 용액 10 μL을 스파이크하여 최종 농도인 0.01, 0.1, 1, 5, 10, 50, 100 μM에 도달합니다. 분석 물질 첨가 후 5분간 기다려 충분한 배양을 허용합니다.
3. 인큐베이팅된 샘플의 라만 스펙트럼을 측정하세요. 각 농도별로 샘플을 3중으로 준비하고, 재현성을 보장하기 위해 2.1부터 2.2까지 단계를 반복합니다.

3. 머신러닝 기반 데이터 분석

1. 총 208개의 라만 스펙트럼으로 데이터셋을 구성하는데, 이 중 77건은 도파민(DA) 반응, 76건은 세로토닌(5HT) 반응, 47건은 대조군 반응입니다.
2. 스펙트럼 데이터의 G-밴드 영역에 대해 배경 감산을 수행합니다. 배경 감량 데이터를 G+ 밴드 피크를 기준으로 정규화합니다.
3. 정규화된 스펙트럼에서 잡음을 줄이기 위해 중앙값 필터를 적용하세요. 각 분석물 처리 스펙트럼에서 정규화된 제어 스펙트럼을 빼서 스펙트럼 변화를 분리합니다(ΔRaman).
4. 5HT, DA 또는 대조군의 삼진 분류를 위한 합성곱 신경망(CNN), 무작위 숲(RF), 지지 벡터 기계(SVM) 모델을 개발합니다.
5. 전체 데이터셋을 6:2:2 비율로 훈련, 검증, 테스트 세트로 나누세요.
6. CNN 아키텍처를 ReLU 활성화 함수와 최대 풀링 크기 2를 활용한 3개의 1D 컨볼루션 레이어, 그리고 2개의 완전히 연결된 레이어로 구성하세요.
7. 비선형 분류를 위해 방사형 기저 함수(RBF) 커널을 사용하여 SVM을 구성합니다.
8. 기본 하이퍼파라미터를 사용하여 RF 모델을 구성하세요.
9. 5중 교차 검증을 사용하여 구성된 모델을 훈련합니다. 통계적 견고성을 보장하기 위해 5개 부문 모두에 걸쳐 평균 성과 지표를 계산하세요.
10. 최종 분석을 위해 검증 데이터에서 가장 높은 정확도를 보이는 모델을 선택하세요.
11. 테스트 세트에서 선택한 모델을 평가하여 그 일반화 능력을 검증합니다.
12. 0.1 μM 농도 임계값 이하로 떨어지는 데이터를 순차적으로 학습 세트에서 제외하여 간접 검출 한계(LOD)를 결정합니다.
13. 훈련된 모델을 기준보다 낮은 농도 범위 전체에 대해 테스트하여 최종 LOD를 확립합니다.

Results

E6#9 ssDNA 기능화된 SWCNT 나노센서(nIRHT)는 이전에 SELEC 방법론으로 개발되었으며, 5HT 결합 시 가역적 nIR 형광 증강을 보여 시험관 내 및 체외 내 실시간 5HT 영상 ¹²를 가능하게 합니다. E6#9 서열(5'-CCCCCCACCACCACACACACACTACCCCC-3')은 SWCNT를 감싸 5HT의 결합 부위를 만듭니다. 하지만 이 센서는 특이성이 부족합니다: 5-HT와 DA 모두 비슷한 강도 증가를 초래하여 DA와 5-HT를 구별하는 데 한계가 있습니다.

이 한계를 극복하기 위해 우리는 라만 분광법을 사용하여 신경화학물질과 nIRHT 나노센서 간의 분자 수준 상호작용을 조사했습니다. nIRHT 나노센서 용액의 라만 분석은 G-밴드 영역(~1580 ^cm-...

Discussion

라만 분광 분석은 nIRHT 센서의 특이성을 크게 향상시켰으며, 이는 기존 형광 반응으로는 달성할 수 없는 능력이었습니다. 우리는 DA가 5HT에 비해 G⁻ 밴드(1570 ^cm-1)의 더 뚜렷한 억제를 유도하는 것을 관찰했습니다. 이러한 차등 신호는 SWCNT 표면의 분자 방향과 결합 기하학적 차이에서 비롯된 것으로 보입니다. 구체적으로, DA의 카테콜 부분은 SWCNT 표면과 더 강한 π-π 상호작용을 형성하여 더 큰 전자 교란을 유도하고, 이는 강화된 G⁻ 억제로 나타난다. 반면, 5HT의 인돌 링 시스템은 전자 결합이 약해 내재된 라만 신호를 더 많이 보존하는 것으로 보입니다. 이러한 차별적 상호작용은 구조적으로 유사한 두 신경전달물질을 구별하는 명확한 분광학적 근거를 제공합니다.

연속 모니터링을 위한 나노센서의 실용적 타당성을 평가하기 위해, 우리는 APTES 코팅 유리 기판에 고정된 나노센서...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
HiPCo raw	그리고 nbsp; 나노인테그리스
iDus1.7 InGaAs	안도르	DU490A-1,9
라만터치	나노 포톤
비브라 셀 130	소닉스