고농도 용액에서 유리한 특성을 가진 항체 식별을 위한 자동 초희석 자기 결합 측정

요약

여기서는 대용량 데이터셋을 생성하고 AI/ML 개발 가능성 예측을 지원하기 위한 대규모 항체 콜로이드 안정성 분석법의 고처리량 적응을 설명합니다.

초록

항체 공학의 주요 과제 중 하나는 콜로이드 안정성을 평가하는 분석 스크리닝 방법 개발로, 생물학적 제제가 고농도 제형 및 투여에 적합한지 확인하는 것입니다. 전하 안정화 자기 상호작용 나노입자 분광법(CS-SINS)은 기존의 친화력 포획 자기 상호작용 나노입자 분광법(AC-SINS)의 수정 버전으로, 고농도 용액 거동 예측을 위한 견고한 콜로이드 안정성 평가법으로 적응되었습니다. 이 방법은 콜로이드 안정성 문제를 주요 자원 투입 전에 식별하여 중요한 초기 개발 가능성 결정을 가능하게 하여 하위 이탈률을 크게 줄이고 후보 선발 일정을 가속화합니다. 본 연구는 이 분석법이 기존 발견 워크플로우와 원활하게 통합되며, 샘플 요구량이 최소화되어 일반적인 초기 단계 분석과 병행하여 고농도 행동을 예측하는 데 유용한 데이터를 제공하면서도 다른 특성 분석을 저해하지 않음을 보여줍니다. 플라스몬 공명 파장의 이동 외에도 일상적인 동적 광산란(DLS) 측정이 여기서 설명한 HTP 방법의 신뢰성을 향상시킬 수 있음이 입증되었습니다. 종합적으로 볼 때, DLS 측정과 자동 분석 프로그램을 이용한 교차 검증이 다양한 기법의 후보 항체 치료제를 신뢰성 있게 선정하는 데 도움이 될 것으로 기대됩니다.

서론

치료용 항체의 개발 및 제형에서 오팔레스와 점도는 환자 중심의 ^{상업 제품 개발}에 핵심 고려사항입니다. ^{1,2,3,4,5,6,7,8}. 고전적으로, 이러한 특성을 직접 고농도로 관찰하려면 대량의 단백질이 필요하므로, 단백질 가용성이 제한된 초기 항체 발견 단계에서 최적의 리드 식별을 효과적으로 방해합니다. 이러한 현상의 신뢰성 있는 식별은 1,2,3,4,5,6,7,8 구간에서 고농도 용액 거동이 저조한 현상 평가에 매우 중요합니다. 따라서 고농도인 9,10,11,12,13,14,15,16에서 해의 거동이 나빠질 것을 예측하는 고처리량, 저농도 방법에 대한 관심이 큽니다. 그 중 하나인 kD-DLS는 고농도 특성을 예측하는 데 신뢰할 수 있음이 입증되었으나, 초기 단계 워크플로우의 낮은 단백질 소비와 고처리량 요구사항을 충족하지 못합니다^12,13.

최근에는 초고소비량의 금 나노입자 기반 분석법인 CS-SINS가 kD-DLS 실험 결과와 강한 상관관계를 보이며, 고농도¹⁶에서 용액 특성 예측에 꽤 효과적임이 밝혀졌습니다. 이러한 특성들은 CS-SINS를 고처리량 스크리닝 도구로 개발하기에 이상적인 후보로 만듭니다. CS-SINS 분석은 금 나노입자 표면에 고정된 포획 항체를 사용하여 후보 항체를 Fc 영역을 통해 고정하여 Fab 팔을 용액 상호작용에 노출시킵니다. 이 구성은 Fab-Fab 상호작용이 측정된 자기결합 신호를 지배한다는 것을 의미하며, 이는 연구에 따르면 Fab 도메인이 주로 mAb 자기결합 특성에 기여한다는 점을 보여주기 때문이다. 이는 상보성 결정 영역(CDR) 표면 특성 17,18,19,20,21,22,23 때문일 가능성이 크다. 이러한 기전적 기초 덕분에 CS-SIN은 고농도 제형과 관련된 콜로이드 안정성 위험을 예측하는 데 매우 적합합니다. 대체 HTP 방법으로는 스탠드업 단층 흡착 크로마토그래피(SMAC), 일반적인 고정상과의 자기 결합을 모방하는 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 컬럼 기반 접근법, 교차 상호작용 크로마토그래피(CIC) 등이 있으며, 이는 컬럼 준비와 대량 시료 요구량 17,24,25,26,27을 포함합니다.

여기서 설명하는 방법은 CS-SINS 분석의 플레이트 검증 설정을 상세히 설명하며, 기존 방법의 장점을 결합하고 결과 신뢰성을 높이는 실험실 자동화 및 분석을 통해 HTP 스크리닝을 가능하게 합니다. 또한 이 연구는 분석에서 자기 상호작용의 농축 특성 덕분에 다양한 샘플 유형이 고품질 결과를 내는 방식을 보여주며, 이 방법이 단백질 원료에 구애받지 않는다는 점을 입증합니다. 더 나아가, 콜로이드 특성을 프로젝트 팀에 조기 전달하는 것이 전략적 다특이적 항체 약물 설계를 더욱 지원할 수 있는 방법도 고려합니다^. 28,29,30,31,32,33,34.

고농도 용액 특성 연구는 일반적으로 리드 선정과 엔지니어링 완료 후 다특이적 후보 선별 캠페인에서 하류에서 수행됩니다(그림 1A). CS-SINS와 같은 방법으로 초희석 측정으로 콜로이드 안정성 위험을 예측할 수 있게 되어, 초희석 측정을 통해 이러한 특성의 조기 예측이 가능해졌습니다¹⁶. 후보 풀이 클 때 초기 개발성 스크리닝(그림 1A)을 도입하고, 단일 특이적 및 다특이 포맷 모두에 대한 병렬 데이터 생성 캠페인이 신약 개발 과정을 더 잘 알리는 데 도움이 될 수 있습니다^31,32. HTP CS-SINS 는 결합 및 기능 결정과 병행하여 기존 분자 스크리닝 패러다임에 적합하여, 기존 워크플로우를 방해하거나 지연시키지 않고 정보 패키지를 확장합니다. 유리한 콜로이드 특성에 중점을 둔 리드 후보 선발은 그림 1B에 나타난 선발 진행에 영향을 미칩니다.

제안된 초기 개발성 스크리닝 워크플로우에서 리드 식별은 제조 및 환자 접근성을 포함한 유리한 약물 특성의 전체 그림을 고려하여 후속 개발을 간소화합니다³⁴. 생물학적 제제의 고농도 특성은 투여 경로를 결정할 수 있습니다: 병원 방문이 필요한 정맥 주사나 환자가 집에서 투여할 수 있지만 종종 고농도 제품이 필요한 피하 주사^35,36. 자기결합이 낮은 개발 가능한 mAb는 보통 >100 mg/mL ^5.35로 제형됩니다. 점성 감소제와 같은 부형제를 이용한 제형 최적화는 CMC 개발 단계에서 용액 특성이 좋지 않은 적합한 후보물의 콜로이드 안정성 위험을 극복할 수 있습니다^34,35. 하지만 이는 바이오제약 제조에 후속 문제를 야기하고 성공적인 신약 승인까지의 일정을 단축시킵니다³⁶. 점도가 낮은 것으로 알려진 부활제(예: 염과 아미노산)도 단백질 안정성에 영향을 미쳐, 이전에 특성화된 발달성 프로필을 변화시키고 과정을 더욱 복잡하게 만들 수 있습니다^36,37. 또한, 과도한 부곡법은 면역원성 문제, 다양한 안전 문제, 치료 순응도에 영향을 미쳐 환자 집단을 제한할 수 있으며^{, 생산 공간에} 새로운 도전 과제를 야기할 수 ^{있습니다.} Starr 등은 CS-SINS 방법을 처음으로 발표하여 PLL과 IgG의 최적 질량 분율을 0.03으로 기술하고, 히스티딘 제형에서 mAb 자가결합에 대해 제타 전위 측정을 통해 나노입자 안정화를 확인했다¹⁶. 특히 PLL을 과도하게 첨가하면 분석에서 과안정화가 발생하고 mAb 자기 상호작용 관찰이 불가능해집니다(PLL에 의한 금 나노입자 안정성 향상은 보충 그림 1에 나타났습니다). 소금 없이 히스티딘 제형을 사용하면 정전기 스크리닝을 최소화할 수 있어(데바이 길이 증가), 분자 간 상호작용 범위를 확장하여 약한 자기결합 신호를 증폭시키고 항체가 가까이 있는 곳에서 고농도 행동을 모방합니다. 일반적으로, 자기결합이 관찰되지 않는 고농도 제형에는 저이온 강도 제형이 선호됩니다.

대형 PLL 고분자는 금 나노입자 표면에 더 많은 포획 mAb가 점유되는 것을 막아 플라즈모닉 이동 창을 좁히고, 이후 데이터 분석을 위해 더 정교한 곡선 적합 프로그램과 분석이 필요합니다. 이 연구는 내부 데이터베이스와 동기화되는 웹 포털 도구를 활용했습니다. 이러한 초기 비용의 주요 장점은 대규모 서열 풀에서 데이터 구축 잠재력을 가지고 하위 후보 후보의 다양성을 극대화하고 비용이 많이 드는 개발 단계에서 병목 현상을 완화할 수 있다는 점^입니다. 여기서 설명하는 CS-SINS 분석법은 HTP 호환 방법으로 두드러지며, 후기 콜로이드 안정성 검사와 잘 상관관계가 있음이 입증되었습니다¹⁶. AI 지원 프로파일링은 향후 프로그램을 위한 다구체적 설계와 각 도메인의 개별 기여를 복잡한 포맷으로 이해하기 위해 진행 중입니다^{41, 42, 43, 44}. 이러한 노력들은 메타분석과 항체 치료제의 콜로이드 안정성 특성 보다 상세한 결정에 영향을 미쳐, 궁극적으로 초기 연구개발 단계에서 시간을 절약할 것입니다.

프로토콜

그림 2 는 나노입자 결합 준비를 보여주고, 그림 3 은 전체 워크플로우를, 그림 4 는 실험실 자동화 과정을 도화하고, 그림 5 는 데이터 분석 파이프라인의 다이어그램을 보여줍니다. 시약과 사용된 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 완충제 준비

참고: 1주차 (샘플 준비)

1. 히스티딘(10 mM), pH 6.0(샘플 및 분석 완충제)을 준비합니다.
   참고: 이 단계들은 첫날에 수행됩니다.
   1. 5 mM L-히스티딘 모노하이드로클로라이드 모노하이드레이트와 5 mM L-히스티딘을 초순수수에 용해합니다. 염산을 저으며 pH가 보정된 pH 미터기로 측정된 6.0에 도달할 때까지 떨어뜨리며 첨가합니다.
   2. 진공 상태에서 0.22 μm 기공 크기 필터를 통해 용액을 걸러내고, 무균 병에 여과액을 수집합니다.
   3. 품질 관리 목적으로 전도도를 측정하고 약 500 μS/cm의 측정값을 확보하세요.
2. 아세테이트 칼륨(20 mM), pH 4.3(캡처 mAb 결합 완충제)을 준비합니다.
   1. 초순수수에 아세트산 칼륨을 녹이고 빙하 아세트산으로 pH를 4.3으로 조절하세요.
   2. 1.1.2 단계에 설명된 대로 0.22 μm 기공 크기 필터를 통해 진공 여과하여 용액을 멸균합니다.
3. 폴리-L-라이신을 준비하세요.
   1. 초순수수에 5 mg/mL 스톡 용액을 준비하여 −20 °C에서 보관하다가 사용하세요.

2. 모든 샘플(후보 mAb) 투석

참고: 이 단계들은 2일차부터 5일차까지 수행하세요.

1. 100 μL 또는 300 μL 투암제를 10 mM 히스티딘, pH 6.0에 5분간 미리 담가둡니다.
2. 모든 샘플(50–100 μL)을 투석 카세트로 옮깁니다. 카세트를 10 mM 히스티딘 버퍼, pH 6.0(박스당 700 mL)에 담근 후 저반봉을 저장소에 넣고, 저장소를 자기 교반판 위에 놓은 후 4 °C에서 2시간 15분간 배양합니다.
3. 10 mM 히스티딘, pH 6.0을 2시간 15분마다 7회 버퍼 교환 또는 4회 밤새 버퍼 교환을 수행하여 샘플에서 염분을 완전히 제거합니다.
4. 샘플을 채취하여 깨끗한 매트릭스 바이알로 옮긴 후 CS-SINS 분석이 완료될 때까지 4 °C에서 보관합니다.
5. 투석 후 샘플 농도를 측정하고 다분산 정보를 기록하세요. 1 mg/mL 용액의 경우 280 nm에서의 원시 흡광도값을 280 nm에서의 흡수율로 나누어 보정된 농도를 계산합니다.
6. 액체 처리 입력 파일을 우물 주소와 농도(μg/mL), 제어 포함으로 준비하세요.

3. 포획 mAb의 버퍼 교환 (그림 2, 1단계)

참고: 이 단계들은 2주차 1일차에 수행하세요(검사).

1. 2 mL 탈염 컬럼에서 저장 완충제를 1,000 × g에서 실온에서 2분간 원심분리하여 제거합니다. 포획 mAb 700 μL마다 두 개의 탈염 컬럼을 준비합니다. 각 원심분리 단계마다 플로우 스루를 버리세요.
2. 컬럼을 20 mM 칼륨 아세테이트 완충제 1mL, pH 4.3으로 세 번 세척합니다. 각 세척 중 1,000 × g 에서 컬럼을 2분간 원심분리합니다.
3. 각 컬럼에 700 μL 캡처 mAb(염소 항인간 Fcγ 특이적 항체)를 첨가하고, 1,000 × g에서 2분간 원심분리하여 신선한 15mL 튜브에 용출합니다.
4. 탈염된 용출물을 수집하여 두 번째 평형 탈염 컬럼에 적용한 후 1,000 × g에서 추가로 2분간 원심분리합니다.
5. 모든 용출된 샘플을 합치세요.
6. 2–5일차 2.5단계에서 설명한 대로 탈염 후 캡처 mAb 용액의 농도를 측정합니다.
7. 캡처 mAb 스톡 용액을 20 mM 아세테이트 칼륨 버퍼와 함께 0.8 mg/mL로 희석한 후 사용 전까지 따로 보관합니다.

4. 폴리-L-라이신 작동 재료의 준비

1. 폴리-L-라이신 정액을 소량 2.66 mg/mL로 초순수수에 희석합니다.

5. 금 나노입자 농도 (그림 2, 단계 2)

1. 20nm 금 나노입자를 포함한 폴리프로필렌 마이크로 원심분리관을 사용해 1 mL 튜브에 1.2 mL 스톡 현탁액 또는 5 mL 튜브에 4.8 mL 알리코트를 준비합니다. 원심분리기는 21,130 g ×에서 6분간 사용했습니다.
2. 상청액(~1.1–1.15 mL)을 제거하고 펠릿을 방해하지 않고 별도의 원뿔 튜브로 옮깁니다.
3. 농축된 펠릿과 잔류 부피를 깨끗한 마이크로 원심분리기 튜브에 섞으세요. 피펫팅으로 나노입자 부피를 결정하고, 저장된 상청액을 사용해 (1 mL 튜브 수× 50 μL 또는 (5 mL 튜브 수× 200 μL)로 조정합니다. 예를 들어, 10개의 1.2 mL 알리코트를 1mL 튜브에 원심분리한 후, 최종 농축 나노 입자 부피를 500 μL로 조절합니다.

6. 나노입자 조립

1. 폴리-L-라이신 작업 용액 1.5 μL과 버퍼 교환 포획 mAb 48.5 μL을 완전히 혼합합니다(그림 2, 단계 3).
2. 5단계의 농축 나노입자 용액과 6.1단계의 폴리-L-라이신/캡처 mAb 용액을 1:1 혼합물로 준비합니다(그림 2, 4단계).
3. 혼합물을 상온(23 °C)에서 하룻밤 배양하세요 (그림 2, 단계 5).

7. 액체 취급 분석판 설치

참고: 이 단계들은 2일차에 수행하세요.

1. 분석에 필요한 재료를 수집하는데, 여기에는 투석 후 항체, 투석 후 농도가 포함된 액체 취급 입력 파일, 결합된 금 나노입자, 로봇 핸들링 팁, 플레이트, 저장소가 포함됩니다(그림 3, 실험실 자동화, 1단계). 팁, 샘플, 플레이트, 저장소를 그림 3 (실험실 자동화, 1단계)에 표시된 레이아웃에 따라 데크에 미리 적재하세요.
2. 샘플 플레이트의 웰 A12–D12에 대조군을 추가합니다(양성 대조군 2개와 음성 대조군 2개). 액체 취급자가 준비한 완충 샘플을 위해 H12 우물을 비워두세요.
3. 액체 핸들러 CS-SINS 메서드를 열고 프로그램을 시작하세요(그림 3, 실험실 자동화, 2–3단계). 요청이 뜨면 액체 핸들러 입력 파일을 불러오고 샘플 수를 입력합니다(그림 4A). 이후 두 번의 계산 체크 창(그림 4B, C)을 검토하고 값을 확인한 후 실행을 진행합니다.
4. 대조군을 포함한 샘플을 10 mM 히스티딘 버퍼, pH 6.0에서 55.5 μg/mL로 정규화하여, 매트릭스 샘플 튜브에서 폴리머라제 연쇄반응판으로 최종 100 μL 용량으로 옮기세요(그림 4D, 1단계). 진행 상황을 모니터링하며, 완성된 플레이트 영역은 회색으로 보이고 활성 단계가 녹색으로 강조되어 있음을 주목하세요(그림 4E).
5. 각 샘플을 11.1 μg/mL 비율의 10 mM 히스티딘 버퍼, pH 6.0에서 대용량 희석하여 중합효소 연쇄반응판에서 최종 부피 200 μL의 딥웰 블록으로 옮겨 준비합니다(그림 4D, 단계 2).
6. 2단계 이후에는 시스템이 일시정지되도록 하세요. 지시가 주어지면 6.3단계에서 준비한 농축금 나노입자를 튜브를 뒤집어 약 10회 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다.
   1. 나노입자를 두 개의 폴리프로필렌 마이크로 원심분리관 사이에 고르게 분포하고, 캡을 열어 튜브를 데크의 지정된 튜브 선반 위치에 놓으세요(그림 4D, 강조된 "AuNP"). 실행을 재개하고 액체 취급자가 두 번째 심부 우물 블록의 각 웰에 20μL의 나노입자를 두 웰씩 분사하도록 허용합니다(그림 4D, 단계 3).
7. 액체 취급자가 11.1 μg/mL 샘플을 포함하는 딥웰 블록(그림 4D, 단계 2)에서 두 번째 딥웰 블록으로 192 μL 샘플을 옮기고 완전히 혼합하도록 합니다. 각 샘플마다 4× CS-SINS 마스터믹스를 생성하여, 48 μL 금 나노입자를 추가하여 최종 부피 240 μL에 10 μg/mL의 최종 샘플 농도를 얻습니다(그림 4D, 단계 3). 이 시점에서 4시간 부화 타이머를 시작하세요.
8. 액체 핸들러가 소스 웰에 30 μL을 분배한 후, 384 웰 플레이트의 각 사분면에 있는 4개 웰 중 3개 웰에 60 μL를 분배하여 각 샘플에 대해 기술적 삼중화를 생성합니다(그림 4D, 단계 4). 남은 30 μL를 소스 플레이트로 되돌려 넣습니다.
9. 진행 중에 액체 취급 갑판 배치를 모니터링하세요. 사용된 팁과 채워진 샘플 웰이 실시간으로 밝은 회색에서 짙은 회색으로 변하는 것을 관찰하며, 활성 움직임은 녹색으로 표시됩니다(그림 4E).
10. 주행이 끝난 후 플레이트를 제거하세요. 접착이 최소한인 투명 플레이트 밀봉으로 판을 밀봉한 후 상온에서 총 4시간 배양합니다. 3.5시간 시점에 보 충 그림 2에 표시된 설정을 사용해 동적 광 산란 프로그램을 시작하여 챔버를 20 °C로 평형화합니다.
11. 각 웰의 510에서 570 nm 흡광 스펙트럼을 4시간 시점에서 1 nm 단위(피크 양쪽 각각 30 nm) 단위로 측정합니다.
12. 보 충 그림 2에 표시된 설정으로 4.5시간 시점에서 동적 광산란 판 리더기를 사용해 즉시 판을 측정하십시오.
    참고: 동적 범위가 제한적이므로 스펙트럼 측정에는 고성능 판 리더기를 사용해야 합니다. 속도 읽기 기능은 사용하지 마세요.

8. 데이터 분석 (그림 5, 데이터 처리 방식)

1. 분광광도계 플랫폼에서 원본 파일을 내보내 접근 가능한 드라이브 폴더에 저장하세요.
2. 내부 서버에 연결된 스크립팅 웹 포털에 접속하세요. 필요한 CS-SINS 입력 매개변수를 입력하는데, 여기에는 (1) 시작 파장; (2) 원시 결과 파일의 디렉터리 위치; (3) 번호판 세트 및 후보자 식별자; (4) 정규화를 위한 양성 및 음의 통제 우정 주소; (5) 방법 설정 명칭("수동" 또는 "액체 핸들러"); (6) 스펙트럼 스캔 및 동적 광 산란 측정에 사용되는 기기; (7) 전자 실험실 노트북(ELN) 식별자; (8) 획득일.
3. 매개변수를 웹 포털에 제출하고, raw-results 디렉터리의 하위 폴더에 세 개의 Excel 파일이 생성되었는지 확인하세요.
4. 웹 포털에서 실행되는 곡선 맞춤 스크립트를 사용하여 λmax 값을 계산합니다.
5. 복제 값, 정규화된 결과, 스펙트럼 스캔 및 동적 광 산란 측정의 대표 그래프가 포함된 두 개의 출력 파일을 검토하세요.
6. 세 번째 출력 파일을 사용하면, 분석의 메타데이터와 정규화된 결과를 포함해 데이터베이스 사용자 인터페이스에서 대량 실험실 결과를 생성합니다. 그룹별 요구사항에 따라 보고 속성을 정의하고, 결과를 데이터베이스에 업로드하여 회사 전체의 접근을 가능하게 합니다.

결과

그림 6 은 결과를 보여주며, 보조 그림 3A는 대표적인 원유 및 정제 샘플에서 나온 CS-SINS 점수 예시를, 보충 그림 3B 는 우물간 신호 변동성을 보여주며, 보충 그림 4 는 플레이트 검증 과정 결과를, 보충 그림 5 는 두 CS-SINS 판값에 대한 정규화 계산을 설명합니다.

중요하게도, 투석 후 최소 55 μg/mL 농도로 10 mM 히스티딘(pH 6.0)으로 보고된 농도로 샘플을 수집하여 분석의 타당성을 위해 수집되었으며, 이는 최소 재고 농도(샘플당 최소 6 μg)이므로 새로운 자식 식별자를 만들었습니다. 총 70개의 정제 샘플과 20개의 원유 발현 샘플이 있었으며, 각각 서로 다른 개발 가능성 검사점에서 샘플 유형이 나타났습니다(리드 최적화 단계에서 정제된 샘플과 그림 1A에 강조된 리드 식별 단계의 1단계 또는 2단계 정제 원유 물질). 원물질은 완전 자동화된 포유류 발현 시스템인 단백질 발현 및 정제 플랫폼(PEPP)에서 생성되었습니다; GNF, 샌디에이고, 캘리포니아, 미국). 대조군은 상업용 자료에서 도출되었으며, 이전에 최대 또는 최소 점도, kD-DLS, CS-SINS 값을 가진 것으로 검증되었습니다. 신선한 알리코트는 -80°C에서 보관되며, 각 분석마다 새로운 알리코트가 사용됩니다.

그림 6A, B 는 샘플 유형별로 평균적인 스펙트럼 및 DLS 점수를 그래프로 표시하며, 막대 그래프는 색상 코드가 일치하는 오차 바(표준편차)를 보여줍니다. 정규화는 샘플과 음의 대조 값 간 차이(람다 최대는 스펙트럼 이동 또는 Z-평균, 유체역학적 직경 nm)를 대조군 간 차이로 나누어 계산합니다(보충 그림 5). 그림 6C 는 스펙트럼 점수를 DLS 점수와 비교하여 분석 접근법 간의 명확한 상관관계를 보여줍니다. 표 1에는 식별자, 웰 주소, 시료 유형, 스펙트럼 점수, DLS 점수와 표준편차가 나와 함께 나와 있습니다. 단일종 IgG의 콜로이드 안정성 위험 기준(스펙트럼 또는 DLS 수치와 상관없이)은 정규화 값 0.35( 그림 6A, B의 녹색 점선으로 표시됨, 복제 대조군 제외)보다 높은 기준입니다. 정제 샘플은 높은 위험 점수를 받았고, 정제 물질은 64/70이 낮았습니다. 중요한 점은, 다특화 포맷의 기준선이 더 높아질 것으로 예상된다는 점입니다. 조식 발현 표본에서는 20표 중 2표본이 높게, 18표꼴이 낮음을 기록했습니다. 여기서 테스트한 정제 물질 중에서도 일부 하위 집합의 부모 배치의 조략 발현도 선별되었고, 유사한 결과를 얻었으며( 보충 그림 3A에 나타났음), 이는 독립 배치에서 후보 단백질을 정제(스케일업)할 때 분석의 대표성을 나타냅니다. 샘플 크기가 제한되지만, 원시 PEPP 샘플이 정제 샘플보다 표준오차가 더 높게 나아질 수 있음이 주목됩니다. 후기 단계에서 CS-SINS 수행 이점은 점도(viscosity)나 kD-DLS 측정과 같이 더 많은 단백질이 필요한 분석법으로도 직교 평가를 수행할 수 있게 하며, 초기 발현성 스크리닝에서 CS-SINS 수행 이점은 콜로이드 안정성 위험을 선제적으로 해결하여 최종 리드 후보 풀에 영향을 미칠 수 있습니다(그림 1B). 오차가 높은 경계선 후보군은 하류 분석으로 위험 고위험 또는 저위험으로 확인할 수 있습니다.

검출되는 플라즈모닉 이동이 매우 작기 때문에, 분석에 대한 신뢰를 심어주는 대체 판독 방법이 기술되었으며, 이는 미세한 변화를 감지할 고급 판 리더기가 없을 때 특히 유용할 수 있는 동적 범위를 넓혀줍니다. DLS 판독은 나노입자 집집화와 나노입자의 스펙트럼 특성에 대한 의존도를 구분합니다; 하지만 두 기술자 모두 표준오차 범위가 비슷하며 측정값에 비해 작다. 이상치 판독에 더 취약한 샘플은 오차가 더 크거나(또는 '멀티모달' 상태라 DLS로 결과를 보고하지 않음), 반면 ASSAY의 작업 범위 내 CS-SINS 값은 오차 분포가 낮습니다. DLS 값과 스펙트럼 점수 값을 비교할 때, 조잡 샘플에서 추출한 DLS 결과의 오차 분포는 스펙트럼 점수보다 더 좁습니다; 하지만 이는 DLS 점수 기준 기준 미만인 한 후보자에게만 차이를 만들었고, 스펙트럼 점수에서는 차이가 없었습니다. 실험실에 다양한 기기가 있다면 유용할 수 있습니다.

데이터 처리 신뢰성과 방법 자체의 신뢰성을 구체적으로 다루기 위해, 위 데이터셋에서 양성 및 음수 대조군 모두에 대해 측정 시간을 종단에서 끝까지 수정했으며, 384웰 플레이트의 시작과 끝에 중간 기준점으로 여러 중·저조 대조군도 추가되었습니다. 보충 그림 4는 최종 판 검증 결과를 보여주며, 판의 시작과 끝에 배치된 샘플 값 간 값이 거의 차이가 없음을 보여줍니다(보충 그림 4A,B), 두 판값 간의 높은 상관관계(보충 그림 4C). 마지막으로, 그림 6의 스펙트럼 스캐닝과 DLS 데이터셋에서 대조군에 대해 Z-인자와 %CV를 계산하였습니다. 대조군을 위해 생성된 데이터를 통해 스펙트럼 스캔 판독값은 0.648로 확인되었으며, 양성 대조군은 0.019% CV, 음극 대조군은 0.012%였습니다. DLS 판독값의 Z-인자는 0.998로 계산되었으며, 양성 대조군은 0.025%, 음성 대조군은 0.021%의 CV를 기록했습니다. 전반적으로 이 분석법(그림 6C)에서 샘플값 간 스피어먼 상관계수는 0.829로 매우 양수로 계산되었습니다. 이 값들은 두 측정 유형 모두에서 견고한 정밀도와 재현성을 나타내며, 당연히 새로운 유리한 DLS 검출 전략이 Z-인자를 최적화하지만, 스펙트럼 스캔은 신뢰할 수 있는 결과를 기록할 수 있는 충분한 분리 대역(Z > 0.5)을 제공합니다. DLS 점수는 CS-SINS 워크플로우 내에서 동시에 수집되는 직교 판독 결과로, 추가 샘플 준비가 필요하지 않다는 점을 유의해야 합니다. 원시 DLS 점수의 값 차이가 더 크다는 것은 개선된 Z-팩터를 설명하지만, "점수"는 원시 값에서 정규화되어 동일하게 해석됩니다. 더 나아가, DLS 측정값은 플라스모닉 이동과 스펙트럼 정보를 통한 간접적 근접성 지표와 달리 나노입자 클러스터의 3차원 크기를 포착하여 CS-SINS 분석의 역학에 대한 이해를 강화할 수 있습니다. HTP 분석의 판 기반이자 시간이 매우 중요하다는 점을 고려하여, 이러한 방법들로 분석의 신뢰성을 높이고자 했습니다.

그림 1: 개발 가능성 패러다임 및 CS-SINS 데이터 수집. (A) 다특이 항체의 발견 캠페인부터 후보자 선정까지의 일반적인 워크플로우가 이 도표에 나타난다. 발견 과정은 단일 종 후보를 선별하고, 다양한 데이터 패키지에서 검증하여 관심 있는 단일 종을 좁힌 후 다종적 형식으로 결합하는 결과를 낳습니다. 데이터 패키지는 반복되거나 확장되어 리드 후보자를 좁혀 개발에 적합한 후보가 선정됩니다. 현재 작업 스트림에서는 소규모 분자 패널(보라색 상자)을 선택할 때 저처리량 분석이 수행됩니다. HTP CS-SINS 과정의 모든 단계에서 수행할 수 있어 귀중한 데이터를 추가하고 선택 과정을 개선합니다. (B) 상위 6개 후보에 대한 콜로이드 특성의 가상적 결과는 저처리량 분석법의 리드 후보 선발과 HTP CS-SINS 선제 선발 경로 두 가지 경로에 대해 제시됩니다. 불리한 해답 행동을 보이는 후보자는 빛으로 표시됩니다. 첫 번째 시나리오에서, 발견 스크린에서 얻은 최적의 결합 특성에 기반한 선도 후보의 절반이 농도가 낮은 행동을 보입니다. 두 번째 시나리오에서는 콜로이드 안정성이 중간 정도로 낮은 후보 1명만 포함되는데, 이는 초기 발견 스크리닝에서 CS-SINS 데이터와 결합 데이터와 병행하여 고려되었기 때문입니다. 두 번째 시나리오에서는 잠재적 유력 후보자의 다양성이 첫 번째 시나리오보다 더 높습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 2: SINS 분석법 워크플로우. 금 나노입자 제제 및 결합: (1) 포획 mAb를 버퍼로 교환하여 20 mM 아세테이트 칼륨, pH 4.3으로 교환하고 0.8 mg/mL로 희석합니다. (2) 금 나노입자는 스톡에서 농축됩니다. (3) 폴리-l-라이신은 버퍼 교환된 캡처 mAb와 혼합됩니다. (4) 금 나노입자는 폴리-l-라이신과 포획 mAb와 함께 배양하여 완전히 혼합됩니다. (5) CS-SINS 복합체를 상온에서 하룻밤 배양. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 3: 실험실 자동화 워크플로우. 실험실 자동화 워크플로우: (1) 재료와 샘플은 액체 취급 방식을 위해 컴파일됩니다. 10 mM 히스티딘, pH 6에 담긴 다핵 샘플은 매트릭스 튜브 또는 96웰 플레이트에 채취됩니다. 샘플 농도는 액체 핸들러 입력 파일에 포맷됩니다. CS-SINS 복합 금 나노입자를 모아 mAb를 포집하고, 로봇 액체 취급 팁, 플라스틱 기구를 수집하여 액체 취급 분석 장치를 준비합니다. (2) 분석판은 액체 핸들러에서 준비되어 실온에서 4시간 배양됩니다. 3) 4시간 지점에서 샘플 우물에서 25분 동안 스펙트럼 스캔(읽기 1)을 수집합니다; 4.5시간 이후에는 동적 광 산란(Readout 2)이 더 균일한 우물 개체군에 대한 크기 정보를 수집합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 4: 액체 취급 프로그램 및 플레이트 설정. (A) 프로그램 시작 시, 시스템이 초기화된 후, 지정된 우물 주소와 시료 농도를 입력 파일을 선택하는 별도의 창/프롬프트가 열립니다. 샘플 수는 매번 지정해야 하지만, 200 μL 부피(384웰 플레이트 스탬핑 전 혼합 시약의 최종 부피)는 동일하게 유지됩니다. (B) (A)에서 이전 창에서 계속을 클릭한 후, 이 두 번째 창이 나타나 왼쪽의 입력 파일과 오른쪽의 값에서 해석을 확인합니다. (C) (B) 해석을 확인한 후, 이 세 번째 창이 나타나 시료 농도(100 μL 부피)를 최종 심부 웰 플레이트(200 μL 부피)로 정규화하기 위한 수학을 두 번 확인하는 대화 상자가 나타납니다. (D) 이 레이아웃은 액체 핸들러 소프트웨어 모듈의 메서드 에디터 뷰에서 가져온 것입니다. 왼쪽에는 300 μL 표준 팁이 적재되어 있고, 무대 중앙에는 50 μL 상자 1개와 300 μL 슬림 팁 상자가 적재되어 있어 액체 취급 로봇과 호환됩니다. 앞쪽에는 10 mM 히스티딘(pH 6, 샘플이 투석된 버퍼)이 적재되어 버퍼 트로프가 설치됩니다. 골드 나노입자는 2개의 마이크로 원심분리관으로 균등하게 나뉘어 캡 없이 오른쪽 튜브 선반 뒤쪽에 장전됩니다. 샘플 튜브가 들어간 매트릭스 플레이트는 캐리어 뒤쪽 10번 열에 적재됩니다. 샘플 이후에는 정규화 플레이트(1), 11.1 μg/mL 샘플을 담은 딥웰 플레이트(2), 결합된 샘플과 나노입자의 200 μL 딥웰 플레이트(3), 384웰 포맷 플레이트(4)가 표시됩니다. (E) 액체 핸들러 데크 레이아웃은 팁 회수와 샘플 분배를 실시간으로 보여주며, 각 단계가 진행됨에 따라 웰을 표시합니다. 여기서 모든 샘플(캐리어 뒤쪽 3^열 96웰 이미지)과 이후 정규화 플레이트가 회색으로 표시되어 있는데, 이는 샘플이 소스 매트릭스 플레이트에서 정규화 플레이트에 추가되었음을 나타냅니다. 초록색 화면에는 트로프에서 버퍼를 흡입해 혼합 중 정규화 플레이트의 첫 번째 기둥에 분사한 후 8채널 헤드가 나타납니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 5: 데이터 처리 방식. 데이터 처리 방식: (1) 원시 데이터 파일이 내부 서버에 제출됩니다. (2) 데이터 파일은 스펙트럼 스캔의 곡선 적합을 미세 조정하고, CS-SINS 복제체의 람다 최대값을 계산하며, DLS를 통해 다중 모달 집단을 검증하는 스크립트로 읽고 처리됩니다. (3) 데이터는 복제본별로 그룹화되고, 이후 평균화되어 지정된 통제군으로 정규화됩니다; 데이터베이스 포털에 있는 일치하는 판 지도가 결과를 연결하기 위해 출처를 제공합니다. (4) 모든 데이터는 데이터베이스에 업로드할 수 있는 템플릿에 정리되며, ELN 보고용 그래프가 자동으로 생성됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 6: 1번과 2번 판출물의 대표 데이터. (A) 정제된 조수 발현 샘플과 수직 점선으로 구분된 대조 샘플에 대해 정제된 스펙트럼 이동 점수를 PPB ID로 그래프로 그래프로 표시하여 샘플 유형 간 오차 바 분포를 결정했습니다. 빨간색 선은 검사 상한선을 나타내며, 이는 양성 대조군에 해당하며, 초록색 점선은 CS-SINS 저위험 분자 프로파일의 컷오프 값을 나타냅니다. (B) 정제된 조수 발현 샘플과 대조군 샘플에 대해 PPB ID로 점선으로 구분하여 막대 그래프 플롯으로 표본 유형 간 오차 바 분포를 결정하였다. 일부 값이 누락되어 있습니다(예: 연한 파란색의 두^번째 값은 (A)에서 평균 이상의 점수를 기록했는데, 이는 DLS 출력의 멀티모달 스캔 결과로 인해 스크립팅 소프트웨어 웹 포털에서 유효하지 않다고 판단되었습니다. 빨간색 선은 검사 상한선을 나타내며, 이는 양성 대조군에 해당하며, 초록색 점선은 CS-SINS 저위험 분자 프로파일의 컷오프 값을 나타냅니다. (C) 스펙트럼 이동과 DLS 값의 평균화된 정규화 점수를 상관 도트 플롯으로 비교했으며, 이는 스펙트럼 이동 점수가 Y축에 해당하고 DLS 점수가 X축에 해당합니다. 색상 코드는 DLS 점수와만 연동됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

표 1. CS-SINS에 의해 산출된 항체 샘플의 콜로이드 안정성 점수. 표는 CS-SINS 분석에서 얻은 샘플 식별자, 웰 주소, 샘플 분류, 정규화된 스펙트럼 점수, 동적 광 산란(DLS) 점수를 요약합니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 그림 1: PLL은 CS-SINS에 대해 10 mM 내에서 AuNP의 안정성을 개선했습니다. 그의 버퍼, pH 6, 이 그림은 음성 대조 mAb가 PLL 코팅된 CS-SINS 복합체에 결합된 것과 버퍼 단독 대조 대조군의 밀접한 겹쳐 있는 모습을 보여주며, 음성 대조군 mAb 또는 버퍼만을 가진 비코팅 금 나노입자는 완전히 다른 범위의 피크를 가진다. 파란색으로 표시된 것은 10 mM으로 인큐베이션된 합액 AuNP의 4시간 시점에서 1nm 단위로 점진적 스펙트럼 스캔을 보여줍니다. 그의 버퍼는 폴리-l-라이신의 사전 배양이 없는 상태에서 음의 대조군(PPB-117487)과 함께 인큐베이션된 공액 비드로 겹쳐져 있습니다. 빨간색으로 표시된 것은 10 mM으로 인큐베이션된 커브레이션 AuNP의 점진적 스펙트럼 스캔(4시간 시점에서 1nm 단위로 촬영됨)입니다. 그의 버퍼는 폴리-l-라이신 사전 인큐베이션 후 음정 대조군(PPB-117487)과 함께 인큐베이션된 커브레이션 비드로 겹쳐져 있습니다. PLL이 있을 때 두 음성 대조군의 계산된 람다 최대 값은 가깝습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 그림 2: DLS 플레이트 리더의 DLS 및 웰 플레이트 선택 설정. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충 그림 3: PEPP에서 발현된 Abs와 정제된 후 발현된 CS-SINS 점수. (A) 정규화된 스펙트럼 이동 점수는 PEPP 샘플의 웰 및 플레이트 ID로 그래프(예: A1PL1 = 플레이트 1의 웰 A1)로 표시되어 Ab64를 표현하고, 정제된 Ab64의 정규화된 스펙트럼 이동 또는 DLS 점수와 수직 점선으로 구분하여 막대 그래프 플롯으로 샘플 유형 간 오차 바 분포(표준편차)를 결정하였다. 초록색 점선은 CS-SINS 저위험 분자 프로파일의 컷오프 값을 나타냅니다. (B) (A) 실험에서 진행된 모든 샘플의 총 AUC와 판 전체 분포는 여기 그래프로 표시되어 있습니다(해당 실험은 색상으로 구분). 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 그림 4: 대조군의 종단 간 384웰 플레이트 검증. (A) 384웰 플레이트의 시작 열에 있는 샘플의 평균된 정규화 스펙트럼 점수는 빨간색으로 표시되며, 384웰 플레이트 끝에서 스캔된 중복값은 라임 그린으로 표시됩니다. 복제 값은 나란히 배치되어 있으며, 양의 대조군(PPB ID 옆에 플러스 기호로 표시)부터 음의 대조군(PPB ID 옆에 마이너스 기호로 표시)까지 다양합니다. 액체 핸들러 프로그램이 준비한 버퍼 컨트롤 값(샘플 입력 프롬프트와는 무관하게)은 체크무늬 패턴으로 표시됩니다. (B) 384웰 플레이트의 시작 열에 있는 샘플의 평균되고 정규화된 DLS 점수는 빨간색으로 표시되며, 384웰 플레이트 끝에서 스캔된 중복 값은 라임 그린으로 표시됩니다. 복제 값은 나란히 배치되어 있으며, 양의 대조군(PPB ID 옆에 플러스 기호로 표시)부터 음의 대조군(PPB ID 옆에 마이너스 기호로 표시)까지 다양합니다. DLS 판독에는 버퍼 제어 값이 없습니다(멀티모달 판독 때문입니다). (C) 평균화된 정규화된 스펙트럼 점수는 384웰 플레이트의 시작 열부터 끝까지 샘플에 대해 상관 닷 플롯으로 DLS 점수와 상관점 플롯을 만듭니다. 데이터포인트의 색상 코딩은 평균적이고 정규화된 스펙트럼 스캔 점수와 직접적으로 대응합니다. DLS 판독에 대한 버퍼 제어 값이 없기 때문에(다중 모달 판독 때문에), 이 플롯에서는 두 판독값에서 6개의 제어만 중복하여 비교합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 그림 5: 사용자와 일간 보편적 보고 및 참조를 가능하게 하기 위한 스펙트럼 점수 또는 DLS 점수의 정규화 계산. 양성 대조군 값은 1, 음성 대조군은 0으로 설정되며, 점수가 높으면 콜로이드 거동이 좋지 않음을 나타냅니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

토론

이 프로토콜은 원래 CS-SINS 방법¹⁶에서 여러 주요 수정을 나타냅니다. 중요하게도, 최적화된 PLL:IgG 비율과 히스티딘 버퍼는 원래 연구에서 유지되었다는 점이다^. 특히 이 분석법은 액체 취급 로봇 플랫폼에 맞게 조정되어 HTP 처리가 가능해졌으며(하루 최대 352개 샘플 vs 20~20개 샘플), 직접 작업 시간을 줄이고 자동 액체 취급을 통해 재현성을 향상시켰습니다. 이 로보틱스 시스템은 플레이트 기반 포맷과 호환되며, 384웰 플레이트와 다양한 실험실 기구 유형과 같은 새로운 포맷으로의 스탬핑도 가능합니다. 프로그램들은 독립적으로 실행될 수 있으며, 종단 간 워크플로우는 샘플 제한 환경에서 재현성을 높이는 대용량 판독을 제공합니다. DLS 측정은 스펙트럼 이동에 대한 직교 판독으로도 포함되었으며, 스펙트럼 이동 해석보다 더 최적의 Z-팩터(0.998 대 0.648)를 가지며, 이는 경계 스펙트럼 점수나 높은 표준편차를 가진 샘플에 특히 유용하며, 플레이트 리더 출력만으로 나타나는 동적 범위를 향상시키기 위한 플라스몬 이동 해석을 설명합니다. 고급 멀티모드 판 리더기가 없는 실험실도 DLS를 사용해 CS-SIN을 신뢰성 있게 수행할 수 있을 것으로 제안됩니다. 384웰 플레이트 전반에 걸친 시간 의존적 변동성을 해결하기 위해, 판의 시작과 끝에 대조군을 배치하여 광범위한 판 검증을 수행하여 스캔 시간 효과가 최소화됨을 확인했습니다(보충 그림 4). 또한, 원시 PEPP 샘플이 정제 물질과 유사한 결과를 내는 것이 입증되었으며(그림 6, 보조 그림 3A), 정제 단백질이 없는 이전 발견 단계에도 적용 가능성이 확장되었습니다. 보충 그림 3의 데이터는 출처 간 샘플 신뢰도를 가리키지만, 데이터가 수집되고 정규화된 서로 다른 데이터셋에서 이루어졌기 때문에 일별 분석법 변동성이 거의 없음을 나타냅니다. 더 구체적으로, 보충 그림 3B는 각 실험판의 모든 우물에 대한 곡선 아래 전체 면적을 나타내며(보충 그림 3A의 동일한 실험판과 색상으로 구분됨), 동일 실험 내에서, 그리고 서로 다른 비즈 준비 조건에서 예상되지만 변동성이 거의 없음을 보여줍니다. 초기 발견 단계에서는 kD-DLS 및 컬럼 기반 접근법(SMAC, CIC)과 같은 방법은 더 높은 시료 소비 요구와 원물질 12,13,24,25,26,27 처리 불가로 인해 실현 가능하지 않습니다; CS-SIN은 샘플당 6μg만으로도 콜로이드 안정성 스크리닝을 가능하게 하며, 1단계 정제가 가능합니다. 마지막으로, 곡선 맞춤 스크립트가 마이너 람다 최대 이동의 미세 조정을 수용하고 파일 처리 개선과 내부 데이터베이스 자동 데이터 보고를 가능하게 하도록 업데이트되었습니다.

일반적인 문제 해결 시나리오는 다음과 같습니다: (1) 스펙트럼 또는 DLS 점수의 높은 표준 편차, 이는 종종 나노입자 혼합 불완전(단계 7.6) 또는 샘플 집집을 나타내며, 이럴 경우 DLS에 의한 투석 샘플에 대한 품질 검사를 수행하여 투석 후 무결성을 확인하고 표준 스펙트럼 점수를 기본값으로 사용하는 것이 권장됩니다; (2) 다중모달 DLS 분포 또는 DLS 측정값 실패는 일반적으로 기존 샘플 집합이나 먼지 오염으로 인해 발생하며, 투석 전에 0.22 μm 필터를 통한 여과를 통해 이를 완화할 수 있습니다; (3) 스펙트럼과 DLS 점수 간의 불일치, 이는 일반적으로 DLS 측정값의 왜곡(높은 다다분산 때문일 가능성이 높으며, 스펙트럼 점수에서 정상-높은 범위 내에 나타날 수 있음); (4) 부적절한 나노입자 저장이나 열화된 포획 mAb로 인해 발생하는 일관성 없는 양성 대조 값; 각 분석마다 -80 °C에 보관된 신선한 알리코트를 사용해야 하며, 4 °C에서 며칠 이상 보관하지 않습니다.

분석법의 몇 가지 한계는 샘플을 철저히 투석하고 반수작업으로 반수작업으로 전날 준비하는 데 시간이 필요하다는 점입니다; 하지만 투석 시간은 샘플 세트 크기와 상관없이 동일합니다. 팁 막힘 위험과 관련해서는, 액체 취급 팁은 흡입 중 압력 변화를 모니터링하며, 작동 중에 관련 오류가 발생할 수 있습니다. 방법 개발 단계에서 로그 파일을 확인했고(서비스 이후에도 계속 확인), 스크립트가 예상 볼륨을 계산하고 있는지 확인했습니다. 구분 기능은 농축 비드 준비물에 대해 테스트되었으며 문제를 예상하지 않습니다. 우리는 분석의 시간에 민감한 특성, Fab 주도적 평가, 그리고 점도나 오팔리스와 같은 콜로이드 거동을 직접 측정하지 않고 대체 분석법으로서의 역할을 인정합니다. 그러나 이러한 적응은 신약 발견 과정 초기에 더 큰 데이터셋을 효율적으로 특성화할 수 있게 해주며, 이전에는 없던 강력한 스크리닝 도구가 되었습니다.

이 프로토콜의 여러 중요한 단계는 재현 가능한 결과를 보장하기 위해 세심한 주의가 필요합니다. 첫째, 완충 준비 중 정확한 pH 조정(1.1.1 및 1.2.1 단계)이 필수적이며, ±0.1 pH 단위를 초과하는 편차는 나노입자의 안정성과 항체 포획 효율에 영향을 줄 수 있습니다. 캡처 항체 준비에 사용되는 저pH 버퍼는 최적의 접합을 보장하며, 지정된 버퍼 조건은 전하 안정화 및 광범위한 항체 적합성(주로 제형 맥락에서)을 위해 최적화되었습니다. 10 mM 히스티딘 pH 6.0 완충제는 단백질 안정성을 유지하면서 최적의 정전기 상호작용을 제공합니다. 둘째, 철저한 투석과 완전한 염분 제거(2.3단계)가 매우 중요합니다; 불완전한 투석은 나노입자 조립 중 정전기적 상호작용에 방해가 될 수 있습니다. 셋째, 금 나노입자 농도 단계(프로토콜 단계 5.1–5.3)는 펠릿을 교란하지 않도록 신중하게 수행해야 하며, 불일정한 나노입자 농도는 분석의 감도에 직접적인 영향을 미칩니다. 넷째, PLL:캡처 mAb 비율 0.03(단계 4.1)은 앞서 설정된¹⁶과 같이 충분한 플라스모닉 이동 윈도우를 유지하면서 최대 표면 커버리지를 최적화한 것입니다. 액체 취급 역학과 관련해, 액체 감지 팁은 금 나노입자가 도입될 때까지 정규화와 판 혼합을 수행하는 데 사용되었으며, 금 나노입자는 용액 내에서 신뢰성 있게 측정되지 않아 분배 부피를 표준 양으로 설정합니다. 상류 액체 감지는 플레이트 정렬 불일치나 샘플 누락 문제를 조작자가 감지할 수 있게 하며, 384웰 스탬핑 단계는 Z-정렬 문제를 식별할 수 있습니다. 마지막으로, 4시간 인큐베이션 타이밍(프로토콜 단계 7.10–7.12)을 엄격히 준수하고, 판이 불완전하든 처음부터 끝까지 판을 일관되게 읽는 것이 매우 중요합니다. 플라즈모닉 이동과 나노입자 군집은 시간에 따라 달라지는 현상이기 때문입니다; 지연이나 조기 측정은 CS-SINS 점수의 부정확성으로 이어질 수 있지만, 전체 판을 읽으면 HTP 형식에서는 일간 점수의 일관성을 보장합니다.

다특이 항체의 콜로이드 안정성이 점점 더 연구됨에 따라, CS-SINS와 같은 HTP 생물물리학적 분석법이 제공하는 방대한 데이터셋은 분자 안정성에 대한 조합적 효과를 더 잘 이해할 수 있도록 AI/ML 모델을 활용할 잠재력을 가지고 있습니다. 연구에 따르면 서열 다양성이 증가할수록 AI/ML 결과의 정확도를 높이기 위해 더 큰 데이터셋의 필요성이 증가합니다 41,42,43. 단일 특이체의 특성과 분자 기술자는 이중특이체 또는 삼특이체로 재포맷될 때 변할 수 있으며, 이는 화학적 분해 부유와 같은 속성에 대한 서열이나 모티프 특이적 고려가 아니라 전체 분자 전하 분포와 균형을 고려합니다.^{17, 18, 19, 20, 21, 22}. 특히 예측된 정전기 패치, 소수성, 용매 접근 가능한 표면적과 같은 구조적 특성은 서열 특이적 특성과 무관하게 집결과 안정성 예측을 개선하여, 예측 준비와 호환되는 여러 소형 데이터셋을 만듭니다 17,18,19,20,21,22. 분자의 생물물리학적 프로필을 대표하는 정점을 참조하는 CS-SINS 점수의 단순성은 AI/ML 모델 훈련에 적합합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
CLEARSEAL FILM 100PKCLEARSEAL	Fisher Scientific	500214
CO-RE II (50 μL Conductive Tips, 300 μL Conductive Tips, 300 µL Slim Conductive Tips)	Hamilton Company	235966, 235902, 235806
Eppendorf Tubes Snap Cap (5.0 mL, Microtube)	Eppendorf	30119401
Falcon Conical Centrifuge Tubes (15 mL)	Thermo Fisher Scientific	Falcon 352196
Goat antihuman Fcγ-specific antibody	Jackson ImmunoResearch Laboratories	109-005-008
Gold nanoparticles (20 nm)	Ted Pella Inc.	157051
Greiner Bio-One 384-well μClear Bottom Polystyrene Microplates – (SS & DLS assay plates)	Fisher Scientific	07-000-057
Greiner Bio-One MASTERBLOCK 96 Deep Well Conical Bottom 2 mL Storage Plate – (mastermix and reagent mixing plates)	Fisher Scientific	07-000-122
Hard-Shell PCR Plates normalization (96-Well, low profile, thin wall, skirted, white/clear HSP9601)	Bio-Rad	HSP9601	URL: https://www.bio-rad.com/en-us/sku/HSP9601-hard-shell-96-well-pcr-plates-low-profile-thin-wall-skirted-white-clear?ID=HSP9601
Histidine hydrochloride buffer sample (10 mM, pH = 6.0, sample and assay buffer)	Sigma	H8125; H6034	최종 농도 5 mM의 시약을 초순수에 준비하고, pH를 6.0으로 조절하고, 초순수로 최종 부피를 조절하고, 0.22 μm 필터로 여과
Matrix ScrewTop Tubes sample (500 μL)	Thermo Fisher Scientific	3744
MD100 or MD300 Xpress Mini Dialyzer (Xpress Micro Dialyzer, Scienova, 6-8 kDa, 96 pcs. in deep well plate (12 cartridges), sealing sheet) and dialysis reservoir/box (low volume dialysis cassettes)	Vivaproducts, Inc.	40789, 40076
Microcentrifuge tubes pure polypropylene (1.5 mL)	USA Scientific	1615-5500
Nalgene Disposable Polypropylene Robotic Reservoirs – (buffer trough)	Thermo Fisher Scientific	1200-2300
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membranes	Thermo Fisher Scientific	567-0020
Poly-L-lysine, >70,000 MW	MP Biomedicals	219454405	초순수에 5 mg/mL 스톡 용액을 준비
Positive and negative Controls (1 mg/mL dialyzed into 10 mM Histidine, pH 6)	Internally-produced commercial antibodies	N/A	~2 nm 스펙트럼 변위 및 250-300 nm의 DLS 크기의 양성 대조군; 스펙트럼 변위가 미미하고 완충액 대조군과 비슷한 DLS 크기
Potassium acetate buffer capture (20 mM, pH = 4.3, mAb conjugation buffer)	Fisher Scientific	P171-500	초순수에 10 mM의 시약 최종 농도를 준비하고, 아세트산으로 pH를 4.3으로 조절하고, 초순수로 최종 부피를 조절하고, 0.22 μm 필터로 여과
Zeba desalting columns (2 mL, 5 mL, or 10 mL)	Thermo Fisher Scientific	PI-89889; 89891; 89893