Saccharomyces cerevisiae에서 신생 및 성숙 전사체의 RNA 구조 비교 분석

Summary

RNA 2차 구조는 주로 구조 탐사 방법을 통해 성숙한 RNA에서 관찰되었습니다. 공동전사구조추적시퀀싱(CoSTseq)은 핵 런온을 구조 탐지와 결합하여 신생 RNA의 중합효소 위치를 연구하는 데 사용되었습니다. CoSTseq는 활성 전사 상태에서 RNA 내 RNA 2차 구조를 관찰할 수 있게 합니다.

Abstract

전사 과정에서 신생 RNA는 RNA 중합효소(Pols)를 배출하면서 염기쌍을 시작합니다. 이 염기쌍은 RNA 처리, 번역, 안정성 수준에서 유전자 발현에 중요한 영향을 미치는 RNA 구조의 형성을 가능하게 합니다. RNA 2차 구조를 연구하는 확립된 방법은 성숙한 전사체에 한정되어 있으며, 접힘 상태에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 더욱이, 신생 RNA의 비교적 낮은 존재도(< 1%)와 일시적인 특성은 분리와 특성 규명을 복잡하게 만듭니다. 공동전사 구조 추적(CoSTseq)은 비오틴-NTP 및 디메틸 황산염(DMS) 탐색을 이용한 전사 런온을 활용하여 신생 전사체의 Pol 위치와 염기쌍 상태를 동시에 획득합니다. Saccharomyces cerevisiae 에서 CoSTseq는 세 RNA Pols 중 어느 하나에 의해 전사된 초기 RNA의 3' 말단 근처의 서열 및 구조 정보를 제공합니다. 전사 실행 중, 활성 부위에 포함된 비오틴-NTP는 효과적으로 Pols를 정체시킵니다. 그 후 DMS 메틸산을 이용해 분리된 A, C, U 뉴클레오타이드를 처리합니다. 이후 비오틴 풍부화 및 주형을 바꾸는 역전사효소를 이용한 cDNA 합성을 통해 쌍말 시퀀싱과 Pol 위치에 따른 DMS 반응성 계산이 가능해집니다. CoSTseq는 DMS 탐침(DMS-MaPseq)과 병행하여 접힌 성숙 전사체의 포착도 가능하게 합니다. 여기서는 전사 실행, 라이브러리 준비, 데이터 분석을 포함한 병렬 CoSTseq 및 DMS-MaPseq에 대한 상세한 프로토콜을 제시합니다.

Introduction

RNA는 RNA 분자 내 염기쌍으로 인해 2차 및 3차 구조로 접힐 수 있으며, 이 구조들은 RNA 접힘을 안내하는 샤페론 역할을 하는 단백질에 의해 추가로 영향을 받을 수 있습니다^. RNA 구조는 매우 동적일 수 있으며, 세포 RNA는 열역학적 지형이 정의한 다양한 구조에 따라 다양한 RNA 구조를 형성하여 가능한 RNA 구조의 앙상블을 생성할 수 있습니다². 동적 구조 변화는 유전자 조절과 발현에 영향을 미칠 잠재력을 가지고 있습니다 ^3,4. 반대로 RNA는 기능과 밀접하게 관련된 매우 선호되는 구조를 채택할 수 있는데, 예를 들어 tRNA, 작은 핵 RNA, rRNA가 있습니다. 이러한 예시들은 강력한 조절 역할을 하는 성숙한 RNA를 강조하지만, 진핵생물 RNA 처리 과정은 전사와 종종 동시에 일어나며, 예: 선전 mRNA 스플라이싱, 3' 말단 절단, RNA 변형 등이 포함됩니다. 마찬가지로, RNA 접힘은 전사체가 성숙되기 전에 일어날 수 있으며, 이는^{다른 곳에서} 논의된 바와 같다.

RNA 서열이 2차 구조를 암호화할 수 있지만, 정확한 결정은 종종 시험관 내 또는 생체 내에서 실험적 검증이 필요합니다. DMS-MaPseq(디메틸 설페이트 돌연변이 프로파일링과 시퀀싱)와 같은 구조 특이적 화학적 변형 기법의 등장은 살아있는 세포에서 세포 RNA의 2차 구조를 규명하는 길을 열었습니다^. DMS는 세포에 도입되어 아데노신, 시토신, 그리고 소규모지만 우리딘의 왓슨-크릭 염기쌍 면을 메틸화하는데, 이들은 쌍이 없을 때만 접근할 수 있습니다. DMS에 의한 변형 후, 고충실도이자 매우 과정적인 역전사효소(Thermostability Group II Intron Reverse Transcriptase, TGIRT⁾⁷를 사용하여 변형된 염기를 최종 준비된 cDNA 라이브러리의 돌연변이로 재코딩할 수 있습니다. 이러한 돌연변이를 이용해 RNA의 뉴클레오타이드 수준에서의 접근성을 추론할 수 있습니다. 강력한 기법이긴 하지만, DMS-MaPseq 및 관련 방법들은 이미 완전히 접힌 성숙한 RNA 연구에 주로 사용되어 왔습니다^.

초기 RNA 조절 및 가공을 연구하기 위한 여러 방법이 개발되었습니다. 글로벌 런온 시퀀싱(GROseq)은 RNA-seq의 한계를 극복하기 위해 개발되었으며, RNA-seq는 세포 내 RNA 수준을 정상 상태로 측정할 수 있게 하여 전사, RNA 처리, RNA 수준에 영향을 미치는 분해 과정 전반에 걸쳐 평균을 내는 정보를 제공합니다. GROseq는 핵 런온에 브로모우리딘을 사용했는데, 여기서 RNA 중합효소(Pol)가 수십 염기의 해상도로 뉴클레오타이드를 신생 RNA에 첨가할 수^있었다. 정밀 런온 시퀀싱(PROseq)은 이 방법론을 기반으로 바이오틴-NTP를 이용해 염기쌍 해상도로 RNA Pols를 신생 RNA에 매핑하는 데 기반을 두었습니다. 여기서는 새로 합성된 RNA⁹의 3' 말단에서 Pol이 마지막으로 검출된 부위에 바이오티닐화-NTP가 첨가됩니다.

최근 Schärfen 등은 비오틴 런온과 DMS 탐침을 활용하여 S. cerevisiae¹⁰의 신생 전사체의 RNA 구조 결정을 가능하게 하는 Co-전사 구조 추적(Co-전사 구조 추적법, CoSTseq)을 개발하고 활용했습니다. CoSTseq는 활성 전사 과정에서 RNA 2차 구조를 결정할 수 있게 해줍니다; 이 프로토콜은 CoSTseq 실험 중 핵 런온과 DMS 프로빙이 어떻게 결합되는지 상세히 설명합니다. CoSTseq는 샘플 준비 시 신중한 관리와 CoSTseq 분석 시 데이터 품질에 대한 세심한 주의가 필요함을 고려하여, 이 프로토콜은 Illumina 플랫폼에서 쌍 끝 시퀀싱에 적합한 라이브러리를 생성하는 모범 사례를 상세히 설명합니다. CoSTseq 프로토콜은 신생 RNA와 성숙 RNA를 동시에 생성하며, 성숙 RNA는 DMS-MaPseq 데이터셋으로 분석하여 신생 RNA와 성숙 RNA를 엄밀히 비교할 수 있습니다(그림 1). 실험적으로는 효모 배양 유지와 핵 런온 및 DMS 탐사를 수행하는 데 필요한 시약에 대한 접근이 필요하며, 이는 아래 프로토콜에 자세히 설명되어 있습니다. 초기 RNA 수율은 CoSTseq 라이브러리 준비 및 데이터 분석의 성공에 매우 중요합니다; 따라서 적절한 인큐베이터와 성장 배양체로 형성된 성장 조건이 충분한 출발 물질을 확보하는 데 매우 중요합니다. 마지막으로, CoSTseq 데이터를 계산 분석하기 위해서는 고성능 컴퓨팅(HPC) 클러스터에 접근하는 것이 이상적입니다.

그림 1: 동일한 생물학적 샘플에서 CoSTseq와 DMS-MaPseq 라이브러리 제제 결합 개요. (A) 사르코실로 효모 세포벽과 핵막을 투과시키면, 핵 런온 반응 중 신생 RNA의 3' 말단에 비오틴-NTP가 통합됩니다. (B) DMS는 투과화된 세포 내 신생 및 성숙 RNA에 쌍을 이루지 않은 A 및 C 잔기(때로는 U)를 메틸화하며, 총 RNA는 페놀/클로로포름 추출로 얻습니다. 신생 RNA는 전체 RNA에서 스트렙타비딘 결합 자기 구슬에 의해 정제됩니다; TRIzol을 추출하면 구슬에서 새로 생긴 RNA가 방출됩니다. 동행적으로, 다아데닐화 mRNA를 포함한 구슬 상정액은 EtOH를 침전시킬 수 있습니다; 이 물질에서 mRNA는 올리고(dT) 비드 풀다운을 통해 분리될 수 있습니다. 폴리 A+ mRNA는 라이브러리 준비 전에 분해됩니다. (C) 템플릿 전환 역전사효소를 사용해 신생 또는 성숙한 RNA로부터 별도로 cDNA를 생성하고, 5' 및 3' 어댑터를 연결하여 N₇ UMI와 바코드를 도입합니다(CoSTseq에 대한 자세한 내용은 그림 2 참조). DMS-MaPseq와 CoSTseq 역전사 단계는 CoSTseq에서 사용되는 비오틴-NTP와 DMS-MaPseq에서 사용되는 N 오버행을 보완하는 오버행을 가진 서로 다른 이중이중 어댑터를 사용한다는 점에 유의하세요. 증폭에는 최소한의 PCR 사이클이 사용되어 라이브러리 내 바이어스를 제한하고, 어댑터 다이머를 제거하기 위해 크기 선택이 적용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

Protocol

참고: 시작하기 전에 표 1에 나열된 모든 버퍼가 준비되었는지 확인하세요. 모든 시약은 뉴클레아제가 없는 물에서 준비해야 합니다. 비분자생물학 등급의 화학물질/시약을 사용할 때는 완충제의 여과기 멸균이 권장됩니다. 1부터 4까지는 다음 사항을 미리 준비하세요:

1. 재료 및 시약 준비

1. 완전한 용해를 위해 최소 하루 전부터 10% 사르코실(v/v) 용액을 준비하세요. 0.22 μm 필터로 균질 용액을 필터 멸균합니다. 실험 당일에는 10% 사르코실을 0.5% 용액으로 만들어 얼음에 보관해 사용하세요.
2. 초원심분리기를 4°C까지 미리 냉각합니다. 훈풍 후드에서 열믹서를 30 °C로 설정하고, 2.5배 구조 프로빙 버퍼 알리코트를 예열합니다. 이 열믹서는 이후 DMS 처리에 사용될 예정입니다.
3. 훈풍 후드에서 열 블록을 65°C로 설정하고, RNA 추출을 위해 각 반응마다 650 μL 산성 페놀(클로로포름)을 데웁니다.
4. DTT와 2.5배 전사 버퍼를 혼합하여 최종 농도는 2 mM으로 만듭니다. DMS 처리 직후 즉시 사용할 수 있도록 담금액과 세척액을 새로 준비하고 미리 냉각하세요(표 1 참조).
5. RNA 추출 전에 효모 용해를 위해 20% SDS 40 μL 분량을 튜브에 분리합니다. 사용 전에 100 mM 염화아연(ZnCl2) 용액을 준비하고 필터 멸균하세요.
6. 출아 효모의 야생형 균주와 비교하여 신생 RNA 염기대조에 관한 특정 연구 질문을 해결하기 위해 필요한 결실, 고갈, 또는 노크인 효모 균주를 생성합니다. 적절한 효모 한천 플레이트(YPD, 드롭아웃, 항생제 플레이트)에 스트리킹을 하여 항상 신선한 균주를 살려내세요. 실험 시작 하루 전날부터 단일 군락에서 액체 배양을 시작하세요. 효모 균주의 성장 및 조작에 관한 자세한 지침은 Schärfen 등, 2025를 참고하시기 바랍니다.

2. CoSTseq용 효모세포 준비

1. 사전 배양 설정: 50mL YPAD 배지에서 세포가 중간 로그 단계(광 밀도(OD, 600 nm = 0.6)에 도달할 때까지 200 rpm에서 흔들 때까지 S . cerevisiae 균주 BY4741을 키웁니다. 필요하다면 배양물을 OD 0.2-0.3으로 희석하고 효모가 0.6 OD까지 도달하도록 하세요.
2. 효모 수확: 1.8 OD(~3 mL) 효모 배양물을 2,500 x g 에서 4 °C의 사전 냉각 원심분리기에서 3분간 돌려 추출합니다. 상정액은 폐기물에 버리세요. 10mL의 차가운 인산염 완충 생리식염수(PBS)를 재현탁하여 펠릿을 세척합니다. 다시 2,500 x g 에서 4°C에서 3분간 돌리세요. 상환액은 버리고 효모 펠릿은 얼음 위에 보관하세요.
3. 효모 세포의 투과화: 효모 펠릿을 10mL의 차가운 0.5% 사르코실에 조심스럽게 재현탁합니다. 세포를 재현탁할 때는 P1000 피펫터를 사용하고, 기포를 만들지 마세요. 투과성을 촉진하기 위해 얼음 위에 20분간 배양하세요. 투과된 효모 세포를 400 x g 에서 4 °C에서 5분간 먹이하세요. 투과화된 효모 세포를 뉴클레아제 무첨가물 100 μL에 재현탁합니다.

참고: DMS 표지는 세포벽 투과를 요구하지 않지만, 핵 실행 반응에서는 비오티닐화 뉴클레오타이드가 전사 부위에 도달하기 위해 투과화가 필요합니다. 이는 효모 세포벽과 핵막을 모두 투과시키는 사르코실 처리를 통해 이루어집니다. 더 나아가, 사르코실 처리는 새로운 전사 시작 사건을 방지하고 Pol II와 염색질^11,12에서 음성 신장 인자를 제거함으로써 런온 분석(run-on assay)을 용이하게 합니다. 샘플을 부드럽게 다루고 낮은 원심 속도(400 x g)를 유지하여 세포 파열을 방지하고 비오틴이 길게 늘어나는 전사체에 성공적으로 통합되도록 촉진합니다¹³.

3. 핵 런온 및 DMS 탐사

참고: 비오틴-NTP를 이용한 핵 주행은 RNA 폴의 활성 부위를 멈추게 하는 입체 장애를 도입하고, 신생 RNA의 선택적 농축을 위한 비오틴 손잡이를 제공합니다. 원하는 해상도에 따라 핵 런온은 1개, 2개 또는 네 개의 비오티닐화 리보뉴클레오타이드 모두를 사용하여 수행할 수 있습니다^. 9. 비용 효율성을 위해 여기서 설명한 워크플로우는 오직 하나의 비오티닐화 뉴클레오타이드(즉, 비오틴-CTP)만을 사용합니다.

1. 핵 런온 반응 설정
   1. 5 mM DTT를 새로 첨가한 2.5배 전사 버퍼 작업 용액을 준비하고, 2.5배 구조 탐침 버퍼를 30 °C로 예열합니다( 표 1 참조).
   2. 깨끗한 2 mL 튜브에 2.5배 전사 버퍼 120 μL, 10 mM ATP 3.75 μL, 10 mM GTP 3.75 μL, 10 mM UTP 3.75 μL, 1 mM Bio-CTP 7.5 μL, 10% 사르코실 15 μL 을 추가하고, 46.25 μL 무핵효소 물을 넣어 부피를 200 μL로 만듭니다.
   3. 튜브에 세포 100 μL을 추가하고, 30°C로 설정된 열믹서에서 2분간 500rpm에서 흔들어 배양합니다.
      참고: 이 단계는 매우 시간에 민감합니다. 신뢰할 수 있는 데이터를 생성하려면 샘플 수를 제한하려고 노력하세요. 일관성을 위해 샘플 간 타이밍을 교차시키는 것이 최선의 방법입니다.
2. DMS 처리: 배양이 완료되면 즉시 200 μL 예열된 2.5배 구조 프로빙 버퍼와 25 μL DMS 시약을 튜브에 동시에 첨가합니다. 부드럽게 두 번의 펄스로 소용돌이를 돌리고, 30°C에서 500rpm에서 흔들면서 4분간 열믹서에서 계속 부양합니다. 샘플 사이에 30초 간격을 두고 일관성을 유지하세요.
   참고: DMS 프로빙은 RNA 염기쌍 상태의 시간 해상도¹⁴ 를 즉시 허용하는 반응입니다. 지속적인 DMS 변형을 방지하기 위해서는 강한 환원제 β-머캅토에탄올을 사용하여 DMS 표지를 신속히 소집하는 것이 매우 중요합니다. 더불어, 남아 있는 DMS는 추출 시 RNA 회복을 방해합니다. 원심분리 전에 포화 이소아밀 알코올을 첨가하면 세포 펠릿¹⁵ 내 잔류 불용성 DMS를 제거할 수 있습니다. 이 단계는 매우 시간에 민감합니다. 신뢰할 수 있는 데이터를 생성하려면 제한된 수의 샘플로 작업하는 것이 필수적입니다.
   주의: DMS는 매우 독성이 강한 무색 액체이며 약간의 양파 같은 냄새가 납니다. DMS와 작업할 때는 극도의 주의가 필요합니다. 증기의 직접 접촉 및/또는 흡입은 눈, 입, 호흡기 괴사를 일으킬 수 있으며, 장기 손상을 포함합니다. 보호용 고글, 실험복, 적절한 장갑을 착용하세요. 가능하면 두 겹 장갑을 끼고, 노출 즉시 또는 DMS 사용 후 장갑을 교체하세요. 흡기구 후드 아래에서 DMS를 활용한 단계를 수행합니다. DMS 처리에는 전용 폐기물 용기를 사용하세요.
3. 담금과 세척
   1. 표 1에 언급된 대로 미리 정지 및 세척 버퍼를 준비하고 얼음 위에 올려두어 사용하세요. 1mL의 정지 버퍼를 추가하여 DMS 메틸화를 멈추세요.
   2. DMS 라벨이 붙은 샘플을 3,500 x g 에서 5분간 냉장 원심분리기에서 돌립니다. 폐기물을 적절한 폐기통에 버리세요.
   3. 펠릿에 세척 버퍼 1mL를 넣고 재현탁하세요. 3.3.2 단계를 반복합니다. 즉시 RNA 추출을 진행하세요. 효모 펠릿은 얼리지 마세요.
4. 페놀 클로로포름 추출
   1. DMS 표지된 효모를 600 μL RNA 용해 완충제에 재현탁한 후, 현탁액을 20% SDS 40 μL 튜브로 옮깁니다. 65°C에서 30초간 부양하고, 950rpm에서 흔들면 됩니다.
   2. 효모 용해액에 650 μL 미리 가열된 산성 페놀:클로로포름을 추가하고, 65°C에서 2분간 열을 가하고 950rpm에서 흔듭니다. 샘플을 얼음 위에 5분간 두세요.
      참고: 그동안 히트 블록이나 열믹서를 실온(RT)으로 바꾸세요.
   3. 원심분리기를 20,000 x g 에서 3분간 RT 온도로 돌립니다.
   4. 최상층을 새 튜브로 옮기고 650 μL 클로로포름을 추가하세요. 잠깐 보텍스. 다시 원심분리하여 700 μL 이소프로판올이 들어간 새로운 튜브에 상층을 채취합니다.
   5. 뒤집어 혼합 후 -20 °C 냉동고에서 30분간 배양하여 RNA가 침전되도록 합니다. 원심분리기는 20,000 x g 에서 45분간 4°C에서 가열합니다. 상원액은 버리세요. 펠릿을 750μL 75% 에탄올(EtOH)으로 세척하세요.
      참고: 이 지점은 프로토콜상 중단/일시정지입니다. 샘플은 75% EtOH에 담겨 -80°C에서 하룻밤 동안 보관할 수 있습니다.
   6. 20,000 x g 에서 3분간 돌린 후 상청액을 버립니다. RNA 펠릿을 자연 건조시키고 81 μL 무핵효소 물에 녹입니다. 260 nm 파장으로 설정된 분광광도계를 사용하여 RNA 수율을 정량화합니다. 위 부유액 1 μL를 적용하여 측정하세요. 필요하다면 RNA 샘플을 희석하세요. 다음 단계로 진행하려면 최소 80 μg 이상의 총 RNA가 있어야 합니다.
      참고: 필요 시 DMS 표지된 RNA는 -80°C에서 최대 2주간 저장할 수 있습니다.

4. 초기 RNA (CoSTseq)

참고: 페놀: 클로로포름 추출에서 얻은 총 RNA에는 DMS 표지된 성숙 RNA와 세 가지 중합효소 모두에서 나온 DMS 표지된 비오티닐화 신생 RNA가 포함되어 있습니다. 총 RNA에서 신생 RNA를 정제하기 위해, 다음 단계에서는 스트렙타비딘 구슬을 사용해 비오티닐화된 신생 RNA를 풍부하게 할 것입니다. 비오틴이 스트렙타비딘에 강한 친화력을 보이기 때문에(K_d = ^10-14 - ^10-15 M), 스트렙타비딘 구슬에서 RNA를 희출하기 위해 두 차례의 연속 RNA 추출(재료표 참조)이 수행됩니다. 효모 RNA의 1% 미만이 성장 조건에 따라 신생 RNA 비율이¹⁶번에 달라집니다.

1. 비오틴 풀다운
   1. 스트렙타비딘 자기 구슬의 제조
      1. 조성에 따라 표 1 에 표시된 대로 프리워시 버퍼 A와 프리워시 버퍼 B를 준비합니다. 스트렙타비딘 자기 구슬을 소용돌이로 균질화합니다. 총 RNA 80 μg 샘플당 44 μL의 균질화된 자기 구슬을 얻습니다.
         참고: 볼륨에 샘플 수를 곱하여 확대하세요.
      2. 자석 비즈를 자석 선반 위에 놓고 저장 용액을 제거하세요. 자기 비즈를 1mL의 프리워시 버퍼 A에 재현탁합니다.
      3. 실온에서 2분간 배양하세요. 상환액을 자화시키고 제거하세요. 세척을 반복하세요. 1mL 프리워시 버퍼 B로 1번 세척하고, 자화하여 상원액을 제거한 후 빠르게 결합 및 세척 단계로 진행합니다.
   2. 제본과 세탁
      1. 표 1에 표시된 대로 2배 결합 버퍼, 1배 결합 버퍼, 고염, 저염 워시 버퍼를 준비합니다.
      2. 원래 부피의 두 배(88 μL)인 2배 결합 버퍼를 추가하여 미리 세척된 구슬을 재현탁합니다. 80 μL 구슬을 80 μL 비티닐화 RNA 샘플이 들어 있는 멸균 1.5 mL 튜브에 옮깁니다.
      3. 구슬-샘플 혼합물을 로테이터 위에서 실온에서 20분간 회전시킵니다. 성숙한 RNA를 포함하는 흐름 과정을 자기 단계별로 수집하세요(침전 단계로 진행).
      4. 구슬 신생 RNA 복합체를 500 μL 고염 완충제로 2번 헹군다. 1x 결합액 500 μL 한 번 세척 후 저염 완충액 500 μL 세척 후 한 번 헹군 후 세척합니다.
2. RNA 시약 추출을 통한 용출
   1. 열믹서를 60°C로 예열하세요. 20,000 x g 에서 4 °C까지 속도를 낼 수 있는 원심분리기를 냉각합니다.
   2. 구슬 신생 RNA 복합체에 300 μL의 RNA 시약(재료표 참조)을 추가하고 재현탁합니다. 60°C에 맞춰 열믹서에서 5분간 배양하세요.
   3. 클로로포름 60 μL를 첨가하고 소용돌이로 3분간 RT에서 배양합니다. 14,000 x g 에서 5분간 예냉 원심분리기에서 돌립니다.
   4. 상부 수상을 새로운 수집관(~180 μL)으로 옮기세요. 유기상은 버리고 구슬과 남은 수상만 남깁니다.
   5. 추출을 반복하여 최종 360 μL 수상 부피를 수집관에 도달시킵니다.
   6. 수집관에 360 μL의 클로로포름을 추가하고 잠시 소용돌이를 사용하세요. 14,000 x g 에서 5분간 냉방 원심분리기에서 돌립니다.
   7. 상층을 약 350 μL씩 신선한 튜브로 옮깁니다. RNA에 900 μL 절대 EtOH와 1 μL 공석전을 첨가하여 침전시킵니다.
   8. 소용돌이가 일어나 -20°C에서 20분간 또는 밤새 -80°C에서 강수가 일어납니다.
   9. 미리 냉각된 원심분리기에서 20,000 x g 에서 20분간 원심분리기를 사용하세요. 상액을 조심스럽게 버리세요.
   10. 75% EtOH가 포함된 750 μL 용액으로 펠릿을 세척한 후, 20,000 x g 에서 5분간 다시 냉간 원심분리합니다.
   11. 펠릿을 10분간 건조시켜 잔류 EtOH를 제거합니다. RNA 펠릿을 3.75 μL 수소₂O에 용해합니다.
       참고: 용출된 RNA의 도트 블롯 후 스트렙타비딘-HRP 결합체로 프로빙하는 것이 비오틴 풀다운을 평가하는 가장 효과적인 방법입니다. 하지만 이 방법은 샘플 재료의 상당 양을 소모하여 라이브러리 준비에 필요한 재료가 부족합니다.
3. 상정액 침전
   1. 성숙한 RNA가 포함된 상상액에 2.5-3 부피의 EtOH를 첨가하여 침전시킵니다. -20°C에서 1시간 동안 강수가 내릴 수 있도록 하세요.
   2. 예냉된 원심분리기에서 20,000 x g로 45분간 회전시킵니다. 상정액을 조심스럽게 흡취하세요.
   3. RNA 펠릿을 75% EtOH 0.5mL로 세척하세요. 펠릿을 건조하여 뉴클레아제 무첨가 물 50 μL에 녹입니다. 튜브를 65°C의 열블록 위에 올려 RNA 펠릿의 용해를 촉진합니다.
   4. 이후 단계에서는 분광광도계를 사용해 RNA 농도를 측정하세요.

5. 성숙한 RNA (DMS-MaPseq)

1. 폴리 A 선택
   참고: 폴리아데닐화 성숙 RNA는 올리고(dT) 비드 기반 친화성 포획을 통해 정제됩니다. 이 프로토콜은 Dynabeads mRNA DIRECT 정제 키트(재료 표 참조)를 사용하도록 최적화되어 있습니다. 초기 준비 단계로, 누클레아제가 없는 물 1mL를 80°C로 예열하여 용출하고, 히트 블록을 70°C로 설정합니다.
   1. 폴리 A 풀다운을 위한 RNA 준비: 침전된 RNA 50 μg를 전이하여 뉴클레아제가 없는 물로 최종 부피 300 μL로 끌어올립니다. RNA를 70°C에서 2분간 가열해 2차 구조를 파괴하고 즉시 얼음 위에 올려놓으세요. RNA를 300 μL 용해/결합 버퍼와 혼합한 후 잠시 소용돌이 보입니다.
   2. 자기 구슬 준비: 최소 30초 동안 소용돌이 작용을 하여 자기 구슬을 현탁시킵니다. 샘플당 100 μL 부유 구슬을 멸균된 1.5 mL 튜브에 옮깁니다. 자석화해서 저장 버퍼를 버리세요. 자기 구슬을 용해/결합 완합제의 같은 양에 세척한 후 자화한 후 상원액을 버립니다.
   3. 제본과 세탁
      1. 100 μL 미리 세척된 비즈를 준비된 샘플 RNA 600 μL 안에 추가합니다. 로테이터를 상온에서 5분간 계속 회전시키세요.
      2. 비즈를 마그네틱 랙에 올려 모아 플로우 스루를 버립니다. 비즈를 600 μL 세척 완충제 A로 세척하세요. 피펫으로 혼합하세요.
      3. 다시 한 번 구슬을 모아 워시를 버리세요. 300 μL 세척 완충제 B로 비드를 세척하고, 피펫으로 혼합하세요.
      4. 다시 한 번 구슬을 모아 워시를 버리세요. 구슬을 90 μL의 따뜻한 (80 °C) 물과 섞고, 90 μL 용해/결합 버퍼를 추가하여 결합을 허용합니다. 5.1.3.1-5.1.3.3 단계를 반복합니다.
   4. 용출: 구슬을 30 μL 따뜻한 (80 °C) 무핵효소 물에 재현탁합니다. 75°C에서 80°C에서 2분간 배양합니다. 비즈를 빠르게 자기장에 노출시키고 용액을 RNase 없는 튜브에 수집하세요. 용출을 반복하고 용출된 RNA를 수집합니다.
2. 단편화
   참고: mRNA의 단편화는 효소적 또는 화학적 방법 중 어느 쪽으로도 이루어질 수 있습니다. 여기서는 염화아연과 열을 이용해 파편화를 만듭니다. 특정 서열이나 구조 요소가 필요한 효소와 달리, 아연 이온은 루이스 산처럼 작용하여 2' 산소(친핵체)를 활성화하고 인산디에스터 골격을 절단합니다. 이로 인해 생성물 RNA 가닥¹⁷에 5' OH와 2',3' 고리형 인산염 에스터가 형성됩니다.
   1. 블록 온도를 94°C, 뚜껑 온도를 105°C로 설정한 채 열사이클러를 예열합니다. 54 μL 용출된 mRNA를 PCR 튜브에 넣습니다.
   2. 100 mM 염화아연 용액 6 μL(최종 농도 10 mM)를 추가하고, 2초간 보텍스를 사용한 후 즉시 예열된 열사이클러에서 94 °C에서 55초간 배양합니다.
   3. 배양 종료 시, 0.5 M EDTA 6.6 μL(최종 농도 50 mM)으로 분해 반응을 소결하고, 피펫을 위아래로 움직여 혼합한 후 튜브를 얼음 위에 신속히 올려놓습니다. 내용을 멸균된 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
   4. 분해된 mRNA에 150 μL 이소프로판올, 15 μL 3 M 아세테이트 나트륨, pH 5.2, 1 μL 공침전제를 첨가하여 침전시킬 수 있습니다.
   5. -20°C에 30분간 두세요. 20,000 x g 에서 45분간 미리 냉각된 원심분리기에서 돌립니다. 펠릿을 75% EtOH로 세척한 후 15 μL 무핵효소 물에 녹입니다.
3. PNK 치료
   참고: ZnCl2와의 화학적 단편화는 5' 및 3' 단을 생성하여¹⁷번 연결에 적합하지 않습니다. 따라서 화학적 분절 후 RNA는 폴리뉴클레오타이드 키나아제(PNK) 처리를 받아 5' OH를 인산화하고 3' 인산 말단을 탈인산화하여 어댑터¹⁸에 연결할 수 있습니다.
   1. 리보뉴클레아제 억제제 1 μL, 10x PNK 버퍼 2 μL, T4 PNK 2 μL 추가. 37°C에서 60분간 배양하세요. 반응을 멈추려면 뉴클레아제 무첨가물 30 μL, RNA 결합 버퍼 50 μL, Etoh 50 μL를 추가합니다.
   2. 스핀 컬럼 기반 RNA 정제 방법을 사용하여 오염물질을 제거하고 RNA를 농축합니다. 이는 상업적으로 구할 수 있는 키트(RNA 클린 및 농합 키트, 재료표 참조)를 사용하여 수행할 수 있습니다. 간단히 말해, RNA 결합 버퍼 2부피와 샘플 1부피를 혼합하고, 이 혼합물의 같은 부피를 100% EtOH와 혼합한 뒤, 신선한 수집관을 스핀 컬럼에 적재합니다. 이 샘플을 스핀하고 플로우 스루를 버리세요. 스핀 컬럼을 700 μL RNA 워시 버퍼로 세척하고, 400 μL RNA 워시 버퍼로 한 번 세척합니다. 흐름을 버리세요. 빈 컬럼을 1분간 돌려 세척 완충제가 완전히 제거되도록 하세요.
   3. RNA를 10 μL 따뜻한 무핵효소 물에 용출하세요.
      참고: 모든 원심분리 과정을 10,000 - 16,000 x g 에서 RT로 30초 동안 수행하세요.

6. 템플릿 전환 역전사 반응

참고: 비오틴 풀다운(4.2단계)에서 생성된 초기 RNA와 PNK 처리 후 분해된 mRNA(5.3단계)는 라이브러리 준비를 위한 다음 단계를 거칩니다( 그림 1 및 그림 2 참조). 간단히 말해, 합성 RNA 템플릿/DNA 프라이머 스타터 듀플렉스(R2 RNA/DNA 이중이중이중 어댑터)를 준비하여 템플릿 전환이 가능합니다. 이 헤테로듀플렉스는 역전사효소(RT)가 RNA에서 DNA 프라이머로 가닥을 전환하는 템플릿 전환을 가능하게 하는 짧은 상보적 서열을 제공합니다. 이를 통해 RNA에서 어댑터 서열로 원활한 cDNA 합성이 가능합니다. 이 프로토콜에 맞게 테스트되고 최적화된 인듀로 역전사효소가 사용되었습니다. 원한다면 CoSTseq 라이브러리 준비에 다른 템플릿 전환 역전사효소도 사용할 수 있으나, 사용자의 최적화가 필요합니다.

1. DNA/RNA 이중이중 어댑터 서열
   참고: DMS-MaPseq 샘플의 역전사에 사용되는 DNA/RNA 이중이중이중 어댑터는 Xu 등⁷ 에 나열된 것과 동일하며, Schärfen 등^(등)10이 참고한 것과 동일합니다.
   1. CoSTseq 샘플의 역전사에 사용할 DNA/RNA 이중이중 어댑터의 경우, 오버행 영역에 'G'가 있는 어댑터를 사용하세요. 이렇게 하면 G가 RNA의 3' 끝에서 비오틴-C를 포착할 수 있습니다. 다른 비오티닐화 NTP를 사용할 경우, 이형이중이중 DNA 프라이머를 편집하여 적절한 쌍 뉴클레오타이드를 오버행으로 설정하세요( 표 2 참조).
   2. DMS-MaPseq 어댑터의 경우, 단편화 후 3' 끝이 무작위가 될 수 있으므로 N 오버행이 하나인지 확인하세요. 다음 라이브러리 준비 단계에 대한 개요는 그림 2를 참조하세요.
2. DNA/RNA 하이브리드 템플릿 교환 준비: 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA로 구성된 버퍼에 1 μM R2 RNA 및 R2R DNA 프라이머를 준비합니다. 프라이머 혼합물을 82°C에서 2분간 배큐한 후, 0.1°C/s의 속도로 25°C까지 식힙니다. 혼합물을 나눠서 냉동해 나중에 사용하세요.
3. 템플릿 전환 역전사
   1. 다음 시약을 추가하고 상온에서 30분간 배양합니다: 5배 반응 버퍼 2 μL, 1 μM DNA/RNA 이중이중이중 샘플(CoSTseq 샘플은 단일 G 오버행을 포함하는 헤테로듀플렉스 사용; DMS-MaPseq 샘플은 무작위 N 오버행을 포함한 헤테로듀플렉스 사용), 효소 0.5 μL, RNase 억제제 0.5 μL, RNA 샘플 3.75 μL (또는 물을 추가하여 총 부피 7.75 μL 달성).
   2. 이 혼합물(dNTP 제외)을 RT에서 30분간 배양하세요. 그 후 반응에 10 mM dNTP 1.25 μL을 추가하고, 열순환기에서 다음 사이클 조건을 적용합니다: 25 °C 10분, 42 °C 10분, 50 °C 10분, 55 °C 10분, 60 °C 30분, 65 °C 20분, 75 °C 15분.
   3. RNase H 1 μL을 추가하고 37 °C에서 20분간 배양합니다. PCR 반응을 컬럼 기반 DNA 정제 방법으로 정제하여 남은 프라이머, 뉴클레오타이드, 효소를 제거합니다. 최종 부피 20 μL에 유출합니다.

그림 2: CoSTseq 라이브러리 준비의 상세 회로도 표현. 비오틴화된 3' 말단을 가진 신생 RNA는 비오틴-CTP와 상보적인 G 오버행을 포함하는 템플릿 스위칭 어댑터와 함께 배양됩니다. 분해된 성숙 RNA(DMS-MaPseq)에는 N-오버행이 있는 어댑터가 사용됩니다(그림 1 참조). cDNA 합성은 열안정 그룹 II 인트론 역전사효소(TGIRT)와 같은 매우 진행적인 역전사효소를 사용하여 수행되며, 이후 RNase H 처리를 통해 RNA 가닥을 분해합니다. 이후 5' App DNA/RNA 리가아제는 N₇ UMI 링커의 리보스 아데닐화 5' 말단(rA^pp)을 단일 가닥 cDNA의 3' OH와 연결합니다. N₇ UMI 어댑터는 차단된 3′ 끝을 포함하여 어댑터 간 자가 연결(self-ligation)을 방지합니다. 마지막으로, PCR 증폭은 겹치는 영역과 5′ 돌출부를 포함하는 프라이머를 사용하여 수행되며, 각 샘플마다 고유한 일루미늄 i5 및 i7 바코드가 할당되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

7. 쌍말단 태그 시퀀싱을 위한 최종 cDNA 라이브러리 준비를 위한 5' 어댑터 연결법

1. 5' 엔드 어댑터 준비
   1. 5' 말단 어댑터를 RNA 리게아제 기반 반응(예: Mth RNA 리가아제, 재료표에 나열됨)으로 다음 반응 성분으로 아데닐화합니다: 10x 5'-DNA 아데닐화 반응 완충제 8 μL, 1 mM ATP 8 μL, 100 μM R1R DNA(이 경우 고유 분자 식별자 또는 UMI를 포함하는 TruSeq 프라이머), 8 μL Mth RNA 리게아제, 뉴클레아제 프리 물 52 μL 투여.
      참고: N₇ UMI 어댑터 설계에 관한 자세한 내용은 표 2 와 그림 2를 참조하십시오.
   2. 이 반응을 65°C에서 1시간 배양한 후 85°C에서 5분간 배양합니다. 제조사 지침에 따라 EtOH 침전법 또는 실리카막 스핀 컬럼 기반 DNA 정화 방법을 사용하여 cDNA를 분리하기 위해 제품을 정제하십시오.
   3. EtOH 침전의 경우, DNA는 -20 °C(최소 20분)에서 아세테이트나트륨(pH 5.2)을 사용해 최종 농도 0.3 M, 그리고 95%-100% 냉 EtOH 2x-2.5x 2x를 사용해 침전할 수 있습니다. EtOH 침전 반응을 4°C의 사전 냉각 원심분리기에서 최대 속도로 15분간 원심분리한 후, 70% EtOH로 펠릿을 세척한 후 다시 원심분리하여 자연 건조합니다. 펠릿을 40 μL 무뉴클레아제 물에 재현탁(또는 스핀 컬럼을 사용할 경우 용출)합니다. 장기간 -20°C에서 보관하세요.
2. 5' 어댑터 연결법
   1. 단일 20 μL 반응 부피에 대해 다음 성분들을 10 μL cDNA에 첨가합니다: 10x NE 버퍼 2 μL 2 μL, 50 mM_MnCl2 2 μL 2 μL, 7.1단계 아데닐화 어댑터 4 μL 10 μM (100 ng/μL)
   2. 이 반응을 65°C에서 1시간 배양한 후 90°C에서 3분간 배양합니다. minElute PCR 정제 키트를 사용해 반응을 세척하고, 최종 부피인 20 μL 무핵효소 물에 용출합니다.
3. 파일럿 테스트를 통한 cDNA 라이브러리의 최소 PCR 증폭
   1. 진행하기 전에 고유 바코드가 포함된 인덱스 프라이머 10μM 재고를 준비하세요. 각 고유한 CoSTseq 또는 DMS-MaPseq 샘플은 원활한 후속 분석을 위해 고유한 바코드가 연관되어야 합니다. 표 2의 프라이머 서열을 참조하세요. 순방향과 역방향 개별 바코드 포함 프라이머는 1:1 혼합물로 결합하여 바코드 프리믹스로 저장할 수 있습니다.
   2. 7.2단계의 PCR 제품 2 μL 사용, 고충실도 PCR 버퍼 2.5 μL(예: 상업용 HiFi 버퍼), 0.375 μL dNTP(10 mM), 바코딩 프리믹스 0.75 μL (또는 개별 i5 및 i7 고유 바코드 프라이머 0.375 μL), 고충실도 핫스타트 DNA 중합효소 0.25 μL (예: 상업용 HiFi 핫스타트 효소)를 추가합니다. 6.625 μL 무핵효소 물.
   3. 이 반응을 95 °C에서 인큐베이션하고, [98 °C 15초, 62 °C 30초, 72 °C 30초 72 °C]를 23회 반복하며, 72 °C에서 1분간 배큐 종료. 최적의 사이클링 수를 결정하려면 1% 아가로스 젤을 사용해 보세요.
      참고: 낮은 사이클 조건을 테스트하기 위해, 낮은 사이클 종료(예: 15 또는 16 사이클 종료)에 샘플을 준비하여 아가로스 겔 위에 검사하여 사이클링 길이에 따른 아가로스 겔 내 cDNA 라이브러리 도말 강도를 비교할 수 있습니다.
4. 라이브러리 증폭을 위한 최종 PCR
   1. 7.2단계에서 얻은 PCR 제품 18 μL을 사용하여, KAPA HiFi PCR 키트에서 다음 물질을 추가합니다: 고충실도 PCR 버퍼 22.5 μL, dNTP 3.375 μL (10 mM), 바코딩 프리믹스 6.75 μL (또는 개별 i5 및 i7 고유 바코딩 프라이머 3.375 μL), 고충실도 핫스타트 DNA 중합효소 2.25 μL, 뉴클레아제 프리 물 59.625 μL
   2. 이 반응을 95 °C에서 인큐블하고, 7.3단계에서 결정된 사이클 수만큼 [15초 98 °C, 30초 62 °C, 30초 72 °C]를 반복합니다. 72°C에서 1분간 배큐를 마칩니다.
5. 크기 선택
   1. 패러마틱 비즈 기반 정제(예: AMPure XP 또는 동등한 제품)를 사용하여 PCR 제품에 대한 크기 선택을 수행합니다. 비즈 부피의 1.3배(예: 50 μL PCR 반응 시 65 μL 비드 슬러리)를 사용하고, 균질할 때까지 잘 섞습니다. 구슬이 샘플을 10분간 실온에서 결합하게 하세요.
      참고: 이 1:1.3배 샘플 대 비드 비율은 프라이머 어댑터 다이머를 제거할 수 있게 하며, 남아 있는 DNA 조각이 150 bp 이하에서 800 bp 이하로 유지되도록 보장합니다.
   2. 비즈를 방해하지 않고 상원액을 제거하고, 제조사 프로토콜에 따라 80% EtOH로 비즈를 세척하세요.
   3. 최종 산물을 11 μL로 용출합니다. 1 μL 용량을 아가로스 겔에 투여하여 라이브러리를 검증합니다. 최종 결과물을 시퀀싱을 위해 제출하세요.

8. 데이터 분석

참고: CoSTseq 패키지와 분석 코드는 GitHub(https://github.com/NeugebauerLab/CoSTseq)에서 확인할 수 있으며, 분석 워크플로우는 그림 3에 나와 있습니다. 이 파이프라인은 CoSTseq와 DMS-MaPseq 시퀀싱 데이터를 모두 처리하도록 설계되었습니다. CoSTseq는 사용 가능한 CPU 코어^{수를 19}개로 최적화하여 분석을 쉽게 병렬화하는 생물정보학 워크플로우인 Snakemake를 사용합니다. 워크플로우는 Snakefile로 정의되며, 이는 실행할 분석을 정하는 일련의 규칙으로 구성되어 있습니다. GitHub 패키지를 설치할 때 제공되는 Snakefile을 변경할 필요는 없습니다.

1. 원본 데이터가 저장된 위치에 맞게 올바른 파일 경로로 설정 파일(.yaml 파일)을 조정하세요. 이 설정에는 어댑터 서열로 가는 경로와 관련 샘플 이름이 포함되어야 합니다. 설정 파일을 변경하여 Snakefile에서 정의한 특정 분석을 실행하세요.
2. 분석을 시작하려면 원시 쌍 엔드 리드를 fastq.gz 형식으로 다운로드하세요. fastp²⁰ 을 사용하여 어댑터 시퀀스를 다듬고, Phred 점수가 최소 20인 리드에 대해 품질 필터를 처리합니다. STAR²¹ 을 사용해 이 리드를 참조 게놈에 정렬하여 BAM 파일을 생성합니다.
3. 추가 확인으로, 통합 유전체 뷰어(IGV) 브라우저에서 CoSTseq 분석 파이프라인을 실행한 후 생성된 BAM 파일을 시각화하세요. IGV를 사용하면 BAM 파일은 관심 있는 유전자의 모든 부분에 대한 리드를 쉽게 해석할 수 있어야 하며, 이는 읽기가 초기 RNA임을 나타냅니다. 예상대로, 성숙한 RNA 리드는 성숙하고 효율적으로 스플라이된 전사체에서 유도된 것으로 예상되므로 인트론 영역에서 최소한의 커버리지를 보일 것입니다.
4. fastp 출력(웹 브라우저에서 열 수 있는 .html 파일)을 사용해 중복 리드의 추정 비율을 산출하세요. CoSTseq 리드는 매우 중복될 수 있어 다음 단계의 중요성을 강조합니다.
5. UMICollapse²²를 사용하여 동일한 UMI와 정렬을 가진 리드를 압축하는 중복 제거를 하여 고유 리드만 보존하고 PCR 편향을 완화합니다. 결과 파일은 중복 리드가 없고 BAM 형식이어야 하며, rRNA에 정렬된 리드는 비-rRNA 유전자와 관련된 리드와 분리되어야 합니다.
6. 모듈형 CoSTseq 파이프라인의 마지막 주요 구성 요소로는 맞춤형 Python 구현을 사용하여 돌연변이 개수를 계산하고 각 뉴클레오타이드에 대한 커버리지 읽기를 합니다. 이 구현을 설명하는 함수들은 GitHub의 소스 코드에서 찾을 수 있으며, Snakefile에서는 입력, 출력, 매개변수 및 이 데이터를 생성하는 함수들이 .pkl 형식으로 저장되어 있습니다.
   참고: CoSTseq 분석 파이프라인을 통해 수행할 수 있는 다양한 분석이 있으나, 개인 맞춤형 분석 필요에 따라 매개변수 최적화가 필요할 수 있습니다. CoSTseq에 적용된 유용한 방법 중 하나는 HDProbe로, 돌연변이율의 유전체 비교를 가능하게 하는 R 패키지입니다^. 요약하자면, HDProbe는 모든 복제체의 데이터를 필요로 하며, 대조군과 비교해 돌연변이율의 유의미한 차이를 체계적으로 분류할 수 있습니다. 추가로 수행할 수 있는 분석 유형으로는 실험적 DMS 반응성에 기반한 구조 예측이 있습니다. 이는 RNA구조 패키지²³을 사용하여 수행할 수 있습니다.

그림 3: 모듈식 CoSTseq 분석 파이프라인의 분석 단계와 예상 출력. 분석 단계로, 기대되는 출력 파일과 콘텐츠를 포함한 기존 도구 사용 권장 CoSTseq 분석 파이프라인 외에 권장 사용 방법을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

Results

이 섹션은 이 프로토콜에 설명된 CoSTseq 워크플로우와 분석을 구현하여 생성된 실제 결과를 제시합니다. 첫째, 이 절은 성공적인 도서관 준비에 대한 품질 평가 후 시퀀싱 전후 예상되는 결과를 설명합니다. 시퀀싱 전에 연구자들은 테스트 PCR과 TapeStation 분석을 통해 비오틴 농축 후 RNA의 존재를 확인할 수 있습니다. 이는 CoSTseq 라이브러리 준비 중 신생 RNA의 성공적인 분리를 나타냅니다. 예를 들어, 시퀀스 분석 후 데이터 품질 평가는 읽기 커버리지 시각 검사와 이후 맞춤형 Python 기반 분석을 통해 충분한 데이터가 확보되어 후속 분석을 가능하게 합니다. 이 단계에서 평가되는 주요 특징으로는 인트론 영역 커버리지, 중복 리드 비율, 뉴클레오타이드당 시퀀싱 깊이, 평균 리드 길이 등이 있습니다. 이러한 지표들은 데이터셋의 분석 경계를 명확히 하고 결과를 과도하게 해석할 위험을 줄여줍니다. 둘째로, 이 섹션은 몇 가지 잠재적인 분석 접근법을 설...

Discussion

RNA는 염기쌍 형성 속도가 합성 속도보다 더 빠르기 때문에 공동전사적으로 접히기 시작합니다^{24, 25, 26, 27}. 초기 RNA 접힘에 대한 현재 우리의 지식은 원핵생물 RNA의 단일 분자 연구, 시험관 내 탐침, 또는 실리코 접근법에서 나왔습니다. 이 프로토콜에서는 CoSTseq의 상세한 워크플로우가 제시되어 있습니다; 이 기술은 S. cerevisiae¹⁰ 에서 RNA 중합효소 위치에 대해 신생 전사체의 공동 전사 접힘을 생체 내에서 검출할 수 있게 합니다.여기 프로토콜은 품질 관리 단계에 중점을 둔 데이터 분석 개요를 제공합니...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10mM ATP	인비트로젠	18330019
10mM 비오틴-11-CTP	예나 생명과학	NU-831-바이오옥스
10mM GTP	인비트로젠	18332015
10mM UTP	인비트로젠	18333013
10X NEBuffer 1	뉴잉글랜드 바이오랩스	B7001S	7.2.1단계에서 사용
10배 인산염 완충식염수(PBS)	깁코	70011-044
SDS 20%	RPI	L23100-500
산성 페놀: 클로로포름	암비온	AM9722
크기 선택을 위한 AMPure XP 비즈	벡먼 쿨터와 nbsp;	A63880	7.5.1 단계에서 크기 선택에 사용됨
박토 펩톤	깁코	211677
백토 효모 추출물	깁코	212750
비신	시그마 올드리치	B3876-100G
클로로포름	시그마 올드리치	319988
D-(+)-포도당	시그마 올드리치	G5767-500G
디프코 아가르	BD 디프코	214010
디메틸 설페이트	시그마 올드리치	D186309-5ML
다이나비즈 및 무역; MyOne 스트렙타비딘 C1 비즈	인비트로젠	65001	4.1절에서 비오틴 풀다운에 사용됨
다이나비즈 및 무역; mRNA DIRECT™ 정화 키트	인비트로젠	61011	5.1절에서 폴리 A 선택에 사용됨
EDTA, pH 8, 0.5M	시그마 올드리치	03690-100ML
에탄올	시그마 올드리치	E7023-500ML
글리코블루	인비트로젠	AM9516	4.2.7 및 5.2.4 단계에서 사용된 공중 침전
인듀로&레그; 그리고 nbsp; 역전사효소	뉴잉글랜드 바이오랩스	M0681S	6.3.1단계에서 사용된 RT 효소
아이소아밀 알코올	시그마 올드리치	W205710-1KG-K
이소프로판올	JT-베이커	9084-05-01
KAPA 하이파이 핫스타트 PCR 키트   그리고 nbsp;	로슈	07958889001	PCR 반응을 위한 7.3.2 및 7.4.1에서 사용된 고충실도 DNA Pol
염화마그네슘	시그마 올드리치	SLCM2154
MinElute PCR 정제 키트	치아겐	28004	6.3.3 및 7.2.2 단계에서 DNA 정화에 사용됨
Mth RNA 리가제	뉴잉글랜드 바이오랩스	M2611A
올리고 클린 & 집중기	자이모 리서치	D4060	7.1.2 단계에서 DNA 올리고 정화를 위해 권장됩니다
아세트산 칼륨 & nbsp;	시그마 올드리치	236497-500G
염화칼륨	JT 베이커	3040-01
수산화칼륨	아반토르	6984-04-01
RNA 클린 & 컨센트레이터-5	자이모 리서치	R1014	PNK 치료 후 5.3.2단계에서 사용한 RNA 정화 키트
RNaseOUT™ 재조합 리보뉴클레아제 억제제	써모피셔 사이언티브	10777019	PNK 치료 중 5.3.1단계에서 사용된 RNase 억제제
사르코실	IBI 사이언티픽	IB07080
아세테이트 나트륨	퀄리티 바이오컬리컬	351-035-721
염화나트륨	시그마 올드리치	S5150-1L
수산화나트륨	마크롱	7708-10
SUPERase· 인&트레이드; RNase 억제제 (20 U/μ L)	써모피셔 사이언티브	AM2696	6.3.1단계에서 사용된 RNase 억제제
T4 폴리뉴클레오타이드 키나제	뉴잉글랜드 바이오랩스	M0201S
온도 안정성 5피트 앱 DNA/RNA 리가제	뉴잉글랜드 바이오랩스	M0319L
트리스-HCl, pH 7.4, 1M	써모 사이언티픽	J60202. K2
트리톤 X-100	테크노바	T1105
트리조르와 무역; 시약	인비트로젠	15596-026	4.2절의 초기 RNA 용출에 대해; 4절에서는 "RNA 시약"이라고도 불립니다
β-머캡토에탄올	시그마 올드리치	M6250-1L