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방법 논문

반결합, 염화철, 트롬빈의 결합으로 확립된 중증 뇌정맥동 혈전증의 새로운 쥐 모델

330 조회수

⸱

DOI:

10.3791/69961

⸱

2026년 2월 13일

 , 
1Department of Emergency, Xuanwu Hospital, Capital Medical University, 2Department of Neurology, The People's Hospital of Qingxian

이 논문에서

요약

중증 뇌정맥동 혈전증(CVST)의 새로운 쥐 모델은 반결찰과 염화철 및 트롬빈을 결합하여 구성되어 인간에서 중증 CVST의 병태생리적 기전을 보다 효과적으로 모방할 수 있습니다.

초록

뇌정맥동혈전증(CVST)은 주로 젊은 사람들, 특히 임산부에게 영향을 미치는 독특한 유형의 뇌졸중입니다. 약 60%의 CVST 환자가 심한 CVST로 정의되는 정맥성 뇌경색 또는 출혈을 겪습니다. 현재 국내외에서 다양한 방법으로 동물 모델에서 CVST를 유도하고 있습니다. 그러나 이러한 모델들은 중증 CVST의 병태생리학적 기전을 완전히 재현하지 못해 이 질환에 대한 기초 연구가 제한적입니다. 중증 CVST의 새로운 쥐 모델은 염화철 및 트롬빈과 반결합술을 통해 확립할 수 있습니다. 반결찰은 관류 스펙클 이미저(PSI)를 사용하여 상시상동(SSS) 결찰 전후의 관심 부위의 대뇌혈류(ROI)를 측정하여 달성했습니다. SSS의 반결설은 정맥동 내에서 정혈을 유도합니다. SSS 표면에 염화철을 국소적으로 발포하면 내피 손상이 발생하고, 부비동에 트롬빈을 직접 주입하면 국소적인 과응고 상태를 만듭니다. 이 접근법은 혈전증 형성의 세 가지 핵심 요소인 정지, 내피 손상, 과응고성을 효과적으로 모방합니다. 결과적으로 나타나는 모델은 여러 정맥동이 동시에 발생하는 상당한 혈전성 부담을 보입니다. 유도된 혈전은 최소 1주간 안정적으로 유지됩니다. 2,3,5-트리페닐테트라졸륨 염색(TTC) 염색은 이 모델이 최대 7일간 지속되는 대면적 정맥 뇌경색을 지속적으로 유발할 수 있음을 보여줍니다. 이 모델은 이전 모델들이 달성하지 못했던 간질 발작을 쥐에서 유도할 수도 있습니다. 혈액-뇌장벽의 붕괴는 에반스 블루(EB) 염색을 통해 관찰되었습니다. 따라서 반결합술과 염화철 및 트롬빈 투여를 결합하여 구축된 중증 CVST 모델은 인간에서 중증 CVST의 병태생리적 진행을 보다 정확하게 재현하여 안정성과 신뢰성을 입증합니다.

서론

뇌정맥동혈전증(CVST)은 동맥 뇌졸중과는 다른 독특한 뇌혈관 질환의 한 형태입니다. 젊은 층에서 더 자주 발생하며, 특히 임산부에서 발생률이3이며, 최근 몇 년간 꾸준히 증가하고 있습니다. 호주에서 실시된 역학 연구에 따르면 CVST의 연간 발생률은 백만 명당 13.0명에서 15.7명 사이입니다4. 미국에서는 CVST의 발생률이 나이가 들수록 증가하는 추세를 보입니다. 그럼에도 불구하고, 여성의 발병 최대 연령은 남성에 비해 낮습니다. 2021년부터 2023년 사이에 미국에서 응급실을 방문한 백만 명 중 43명이 CVST6 진단을 받았습니다. 임상 현장에서는 다발성 동성 혈전증이 가장 흔하게 관찰되는 형태로, 전체 사례의 약 57.14%를 차지합니다. 그 다음으로 상시상동(SSS; 16.19%), 횡동동(11.43%), 그리고 S상상동(8.57%)의 침범이 나타납니다. 주요 임상 증상으로는 간질과 동반될 수 있는 두통, 의식 장애, 국소 신경학적 증상 7,8,9가 있습니다. 하지만 이러한 현상들은 특정하지 않습니다. CVST 환자의 약 60%가 뇌정맥경색 또는 출혈을 겪으며, 이는 중증 CVST10,11로 분류됩니다. CVST 치료에는 항응고 치료와 외과적 개입이 포함되지만, 중증 CVST의 사망률은 여전히 34.2%로 높습니다. 이러한 높은 사망률은 중증 CVST의 기저 병태생리학적 기전이 아직 완전히 밝혀지지 않았기 때문일 수 있습니다. 따라서 중증 CVST의 적절한 동물 모델은 그 발병 기전, 병태생리적 진행 및 잠재적 치료 전략을 조사하는 데 필수적인 실험 도구입니다12.

현재 CVST 동물 모델 유도 방법은 일반적으로 다음과 같은 유형으로 분류할 수 있습니다: 영구 연결(13,14), 화학적 유도(15,16,17), 중재적 접근(18,19), 자가 제작 이식이식(20,21,22), 그리고 양극 전기응고(23,24). 이전 동물 모델에서 유도된 혈전은 지속 시간이 짧았고, 여러 정맥동 혈전과 대대면적 정맥 뇌경색을 동시에 유도할 수 없었다. 따라서 여러 정맥동을 동시에 포함하는 중증 CVST 모델 개발이 시급한 과제가 되었습니다. 반결속 기법과 염화철 및 트롬빈을 결합하면 중증 CVST의 새로운 쥐 모델을 확립할 수 있습니다. 더 나아가, 새로운 중증 CVST 모델은 정맥동 혈전 부담, 정맥성 뇌경색, 혈뇌장벽 파괴라는 세 가지 주요 측면을 통해 중증 CVST의 인간 병태생리학적 과정을 보다 정확하게 시뮬레이션합니다. 이 모델은 중증 CVST의 병태생리학적 기전과 치료 전략 연구에 적용 가능합니다. 이 새로운 쥐 모델은 앞으로 중증 CVST의 병태생리학적 기전 연구에도 활용될 수 있습니다.

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프로토콜

실험 프로토콜은 중국 베이징에 위치한 수도의과대학 동물실험 및 실험동물복지위원회(AEEI-2020-119)의 승인을 받았으며, 기관의 동물 관리 및 이용 위원회 규정을 준수하여 수행되었습니다.

1. 동물 준비

  1. 평균 체중 300± 10g인 건강한 성체 수컷 Sprague-Dawley(SD) 쥐를 무작위로 실험군 또는 가짜 수술군에 배정합니다. 모든 동물은 12시간씩 빛과 어둠을 번갈아 가며 돌봄을 받으며 자유롭게 먹이와 물을 제공했습니다.

2. PSI 적용

  1. PSI를 사용하여 모델링 과정 전반에 걸쳐 쥐의 SSS 내 뇌혈류(CBF) 변화를 지속적으로 모니터링합니다. SSS 내에서 고정된 원형 영역을 관심 영역(ROI)으로 선택하세요. 수술 중 ROI의 CBF 변화를 모니터링하여 반결찰 완료 여부와 혈전 유도의 성공 여부를 판단합니다.

3. 중증 CVST 쥐 모델 확립

  1. 쥐를 마취하는 것은 5% 엔플루란으로, 70% 아산화질소와 30% 산소가 혼합된 가스 혼합물을 마취 마스크를 통해 전달합니다. 수술 기간 내내 엔플루란 농도를 1%-2% 범위 내에 유지하세요. 마취된 쥐를 입체주행 프레임을 사용해 머리를 중앙선에 고정한 엎드린 자세로 눕히세요. 수술 기간 내내 체온을 37± 0.5 °C로 유지하며 온도 고정 온열 패드를 사용하세요.
  2. 쥐의 두개골 부위 중앙선을 따라 1.5cm 길이의 절개를 합니다. 피하 조직을 해부하여 두개골을 노출시킵니다.
  3. 현미경 시각화 하에서 고속 치과 드릴을 사용해 브레그마와 람다 사이에 세로 두개골 창(10 x 4 mm)을 만듭니다. 경막의 완전성을 유지하면서 SSS와 양측 대뇌 피질을 노출시킵니다. 두개골 드릴링 과정 중에는 경막과 피질에 열 손상을 방지하기 위해 드릴 비트를 자연식염수로 지속적으로 냉각하세요.
  4. SSS 노출 후에는 PSI를 사용해 SSS의 ROI의 CBF를 평가하고 해당 데이터를 기록합니다. SSS를 8-0 음경을 사용해 후방과 후리에서 반결찰합니다 현미경 관찰 하에 있는 폴리아마이드 봉합사.
    참고: SSS를 결찰할 때는 강도가 적당하고 과도하지 않아야 합니다. 그렇지 않으면 반결합 효과를 얻을 수 없습니다. 결찰술은 이상적으로 단일 연속 시술로 이루어져야 합니다. 반복적인 연결 시도는 SSS에 천공을 초래하여 모델 제작의 성공을 저해할 수 있습니다.
  5. PSI를 이용해 SSS의 결찰 부분에 위치한 ROI의 CBF를 평가하고, 반결속 전에는 CBF가 약 50%까지 감소했음을 확인합니다. 결과를 체계적으로 기록하세요.
  6. 빛이 차단되는 조건에서 7mm 길이의 3-0 실크실을 40% 염화철에 담가 SSS 연결 부위 표면을 5분간 덮어줍니다. 실크 실을 제거한 후에는 일반 식염수로 밭을 씻으세요.
  7. 1분 이내에 마이크로인젝터를 사용해 결찰된 구간의 부비동에 0.1 mL 트롬빈 용액(500 U/mL)을 주입합니다. 총 150 U의 트롬빈 용량을 위해 추가로 두 번 더 주사를 반복했습니다. 경막외 공간으로의 트롬빈 역류는 혈전증 저하로 이어지지 않았습니다.
    1. SSS에 트롬빈을 주입하기 쉽게 하기 위해 삽입 전에 미세 주입기 바늘을 부드럽게 구부려 주세요. 이 조정은 천공 시 바늘의 각도를 더 잘 제어할 수 있게 해주며, SSS를 통한 의도치 않은 침투를 방지하는 데 도움을 줍니다.
  8. 트롬빈 주사 후 PSI를 사용해 ROI의 CBF를 재평가하세요. 반결사 시술 후와 비교해 CBF가 유의미하게 감소했음을 확인하여 혈전증 유도에 성공했음을 나타냅니다. 추가 분석을 위해 체계적으로 데이터를 기록하세요.
  9. 뼈 창을 뼈 왁스로 봉합한 후 절개 부위를 봉합하세요. 수술 후에는 각 쥐에게 5 mg/kg의 케토프로펜을 피하 투여하여 수술 후 통증을 완화합니다.
  10. 가짜 수술 그룹에서는 추가 수술 없이 두개골 절개술만 시행합니다.

4. 정맥동성 혈전증 부담 및 뇌경색

  1. 모델 설립 후 1일, 2일, 7일 세 시점에서 정맥동 혈전증의 부담을 평가합니다. 쥐를 희생시키고 생리식염수로 심장 관류를 시행하는 시점이 다릅니다.
  2. 정맥동 혈전증 침범 정도를 육안적으로 평가하기 위해 두개골 절개술을 실시하세요. 혈전을 분리하여 정량적 분석을 받으세요. 뇌 조직을 절제하고 두께 2mm의 코로나 조각으로 절단하세요.
  3. 슬라이스를 2% TTC 용액에 담가 37°C 물욕에서 20분간 배양하여 염색을 돕습니다. 이후 ImageJ 소프트웨어를 사용해 뇌정맥경색을 육안으로 평가하고 경색량을 정량화하여 통계 분석을 수행합니다.
    경색 부피 = 경색 면적(제곱 mm x 두께 [2 mm]

5. 혈액-뇌장벽(BBB) 투과성 파괴

  1. 수술 다음 날 모델군과 가짜 수술군 양쪽에서 무작위로 쥐를 선별하여 꼬리정맥을 통해 2% 에반스 블루(EB) 정맥 주사를 투여합니다.
  2. 주사 2시간 동안 성공적으로 투여된 후 쥐를 안락사시키고, 인산염 완충 생리식염수(PBS)를 좌심실에 관류합니다. 뇌 조직을 채취하여 두께 2mm로 절단하여 EB 침투 정도를 평가합니다.

6. 통계 분석

  1. SPSS 17.0 소프트웨어를 사용하여 통계 분석을 수행하세요. 측정 데이터를 표준편차± 평균으로 제시하세요. 그룹 비교에는 일방향 분산분석(ANOVA) 또는 독립 표본 t-검정을 사용하세요.
  2. 동일 그룹 내 여러 시점에서 측정된 연속 변수 분석의 경우, 반복 측정 ANOVA를 사용하여 시점 간 그룹 간 차이를 평가합니다. p-값이 0.05 미만일 경우 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.

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결과

모델링 과정
그림 1A는 화살표로 표시된 쥐의 SSS를 나타냅니다. SSS의 앞쪽과 꼬리부는 반결합(그림 1B)되었고, 이어서 염화철에 적신 실을 결찰된 부위 표면에 적용했습니다(그림 1C). 이후 트롬빈을 결찰된 마절에 주입하여 혈전증을 유도하였습니다. 화살표로 표시된 트롬빈 주입 부위는 검은색으로 변했습니다(그림 1D). 그림 1E-H의 흰색 원은 ROI를 나타냅니다. 그림 1E에서는 SSS 노출 후 ROI에서 강한 적혈류 신호가 관찰되었습니다.

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토론

반결찰과 염화철 및 트롬빈을 결합하여 구축한 새로운 중증 CVST 쥐 모델은 정혈과 내피 손상뿐만 아니라 혈액의 과응고 상태를 시뮬레이션할 뿐만 아니라, 혈전증 형성의 세 가지 요소를 시뮬레이션합니다. 더욱 흥미로운 점은 이 방법으로 개발된 쥐 모델이 간질 발작을 보일 수 있다는 것입니다. 간질 발작은 CVST 환자에서 약 12%에서 31.9%에서 발생하는 주요 임상 증상입니다. 특히, 피질 정맥혈전증과 정맥성 뇌경색을 동반한 중증 CVST 환자는 간질 발작 위험이 증가합니다26. 따라서 이는 인간 CVST의 병태생리학적 기전과 더 밀접하게 일치합니다.

SSS 연결과 트롬빈 주입을 결합한 모델에서는 Li 등14가 설명한 접근법이 매우 대표적이라고 여겨집니다. 이 방법은 SSS의 전후구를 영구적...

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공개 사항

저자들은 경쟁하는 재정적 이해관계가 없다고 선언합니다.

감사의 글

캐피털 의과대학 중증 뇌질환 연구소의 기술 지원에 감사드립니다. 이 연구는 베이징 자연과학재단(번호 7182064)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
2,3,5-트리페닐테트라졸륨 클로라이드시그마-올드리치
40% 염화철  톈진 즈위안 화학 시약 유한회사, 중국
에반스, 블루 시그마-올드리치
온열 패드와 nbsp;하버드 어퍼러터스 홀리스턴, 매사추세츠, 미국50-7061-f,nbsp;
고속 치과 드릴;대한민국 부산, 새신스트롱-207B
레이저 스펙클 미터  스웨덴 페리캠 PSI 시스템
현미경칼 자이스 주식회사, 독일 베를린
폴리아미드 봉합사 닝보 청허 마이크로 아파터러스 공장, 중국
입체 택시 프레임데이비드 코프 인스트루먼츠, 미국 캘리포니아주 투훈가
트롬빈창춘레이 윤상 제약 유한회사, 중국

참고문헌

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