인간 피부의 림프관 3차원 시각화와 림프부종 중 림프관 구조 변화

요약

여기서는 세 가지 서로 다른 조직 정화 기법을 적용한 후 공초점 현미경 또는 광장 현미경을 사용하여 인간 피부의 림프관 구조를 3차원적으로 시각화하였습니다. 이러한 방법과 면역조직화학 염색을 결합하면 림프부종 진행 과정에서 림프관의 기능 변화에 대한 통찰을 제공합니다.

초록

모세혈관과 모혈관으로 구성된 피부의 림프관은 노폐물 제거와 면역 반응에 중요한 역할을 하며, 조직의 항상성을 유지하는 데 필수적입니다. 하지만 인간의 피부는 표피, 진피, 피하 지방의 세 층으로 이루어져 있어 콜라겐이 풍부한 조밀한 세포외 기질을 가지고 있어, 림프관 네트워크를 3차원으로 시각화하는 것이 어렵습니다. 이 한계를 해결하기 위해, 본 논문은 조직 정화 시약과 공초점 또는 광판 현미경을 결합하여 인간 피부 림프세포의 3차원 시각화를 위해 관심 있는 특정 분자와 실험 목적에 맞춘 세 가지 방법을 소개합니다. 림프 내피세포의 부착자 접합 분자를 면역조직화학을 표적으로 하여, 특히 2차 림프부종 환자에서 유래한 피부 조직에서 모세혈관 접합부의 단추-지퍼 형태 재형성과 같은 명확한 기능적 의미를 가진 구조적 변화를 평가하였습니다. 이 3차원 시각화 기법은 기존의 조직학적 조직 절편 분석으로는 알 수 없는 혈관 구조를 드러내어 림프관 구조와 기능에 대한 이해를 높입니다.

서론

림프관이 암 전이에 이미 잘 관여한다는 점을 넘어 피부 항상성 유지에 중요한 역할을 한다는 인식 이후로 그 기능에 대한 관심이 점점 커지고 있습니다 ^1,2. 림프관은 구조적으로 모세혈관과 집합혈관으로 나뉘며, 각각 고유한 특성을 가지고 있습니다. 림프 모세혈관은 림프 내피 세포가 형성하는 단층 구조로 구성되며, 간질액, 노폐물, 면역 세포의 초기 수집 부위 역할을 합니다. 반면, 집집형 림프관은 림프관 내피층을 둘러싼 평활근 세포가 이중층 구조를 가지며, 모세혈관망에 의해 수집된 림프액이 중심 순환으로 적극적으로 운반될 수 있습니다^. 마우스 모델은 특히 기관지 림프관의 구조적 특징을 밝히는 데 활용되었으며, 염증성 상태가 구조적 재형성을 유도하는 방식을 밝혀냈습니다^. 이전 연구들은 자외선에 의한 염증이 림프 모세혈관의 비정상적인 확장을 일으켜 체액 수집 기능을 저해한다는 것을 입증했습니다. 이 기능 장애의 분자 기전이 밝혀졌으며, VEGF-A 발현 증가와 VEGF-C 발현 감소가 이러한 구조적 변화를 촉진한다는 것을 구체적으로 보여주었다 ^5,6,7.

3차원 시각화 기법이^{마우스 모델의} 림프관 네트워크에 대한 이해를 크게 발전시^켰지만, 인간 림프관의 유사한 구조 분석은 여전히 도전적이었습니다. 이 분석 격차는 인간 조직 작업의 어려움, 즉 제한된 샘플 가용성과 포괄적인 3차원 영상 구현에 수반되는 기술적 문제에서 비롯됩니다. 특히, 피부는 표피, 진피, 피하지방으로 이루어진 3층 구조로 외부 환경과의 장벽 역할을 하며, 다른 연질 기관보다 더 큰 도전을 제기합니다. 더불어, 인간 피부는 마우스 모델에 비해 조직 두께가 더 높아 깊은 영상 침투를 방해하는 등 뚜렷한 분석 도전 과제를 제시합니다. 또한, 풍부한 세포외 기질 성분, 특히 콜라겐과 노화 관련 구조적 변화는 생쥐의 림프 영상을 혁신한 신흥 조직 제거 기술의 효과를 떨어뜨리는 광학 장벽을 만듭니다¹⁰.

다양한 조직 정화 물질들이 이전에 인간 피부 모세혈관을 시각화하기 위해 시험되었으며, 조직 적합성을 입증했습니다¹¹. 그 연구 이후 조직 정화 시약이 성공적으로 사용되어 인간 피부 림프관을 3차원에서 시각화했다¹². 림프관 내피세포의 부착 접합부에 집중하여 림프부종 진행과 관련된 림프관의 구조적 변화를 확인했다¹³. 이 글의 목적은 세 가지 피부 클리어 기법과 공초점 현미경, 광판 현미경, 면역조직화학적 염색을 결합하여 인간 피부 림프관 3차원 시각화 절차를 상세히 설명하는 데 있습니다. 본 연구에서는 절제 당일에 고정되어 동결-해동 과정을 거치지 않은 신선한 인간 피부 조직에만 집중하지만, 이러한 기법들은 질병과 노화 과정에서 림프관의 구조적 변화뿐만 아니라 관련 기능적 변화에 대한 통찰을 제공합니다.

프로토콜

인간 피실험체의 피부 샘플은 일본 치바 대학병원에서 채취되었습니다. 인간 대상 모든 절차는 치바 대학병원 기관심사위원회와 시세이도 글로벌 혁신센터의 승인을 받았으며, 모든 대상자는 서면 동의서를 제공하였습니다. 시약과 사용된 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 인간 피부 샘플의 전처리

1. 채취 시 절제된 표본의 피하 조직을 제거하세요.
   참고: 피부 절제와 획득 사이의 간격은 약 h였습니다. 운송 중 조직은 DMEM에 담그고 얼음찜질에 보관했습니다.
2. 표피와 진피를 분리하기 위해 표피 면이 아래로 향한 샘플을 60°C 핫플레이트에 45초간 올려놓으세요.
3. 즉시 표본을 얼음처럼 차가운 PBS에 담가세요.
4. 핀셋으로 표피와 진피를 분리하세요.
5. 피부 부위를 4% 파라포름알데히드 4°C에 16시간 고정한 후, 사용 전에 PBS로 세척하세요.
   참고: 고정 후 샘플은 4°C의 PBS에 보관되었고, 면역염색 단계가 몇 달 내에 시작되었습니다.
   주의: PFA 용액은 독성이 있습니다. 모든 준비 및 취급은 적절한 개인 보호 장비를 착용한 채 연기구 내에서 이루어져야 합니다.

2. 투명 시약과 결합된 전면 면역염색

1. 아이디스코 기법
   1. 표본을 대략 5 mm × 5 mm × 5 mm 크기로 다듬으세요.
   2. 시료를 5% 트리톤 X-100과 2.5% 트윈 20 PBS에 50rpm, 24°C로 설정한 궤도 셰이커에서 16시간 동안 투과성을 위해 옮깁니다.
   3. 표본을 24°C에서 1시간 동안 세척하며, 이 과정을 세 번 반복합니다.
   4. 시료를 신선하게 준비한 블로킹 버퍼 A(1% BSA, 0.1% Tween 20, 0.03% 아지드 나트륨 PBS)에 50rpm, 24°C로 설정된 궤도 셰이커에 72시간 동안 담근다.
   5. 표본을 포도플라닌에 대한 1차 항체(1:100)와 함께 37°C, 50rpm으로 설정된 궤도 셰이커의 차단 버퍼 A에서 72시간 배양합니다.
   6. 세척 버퍼 A(PBS 내 0.1% 트윈-20)로 24°C에서 1시간 동안 세척하며, 이 과정을 세 번 반복합니다. 그 후 시료를 세척 완충기 A에 50rpm, 4 °C로 설정한 궤도 셰이커에 72시간 동안 유지합니다.
   7. 샘플을 Alexa Fluor 647과 결합된 마우스 IgG에 대한 2차 항체(1:1000)와 함께 50rpm, 37°C로 설정한 궤도 셰이커의 차단 버퍼 A에서 72시간 동안 배양합니다.
   8. 1.6단계를 반복합니다.
   9. 표본을 50% MeOH와 함께 24°C에서 3시간 배양합니다.
   10. 표본을 70% MeOH와 함께 24 °C에서 3시간 동안 인큐베이팅하세요.
   11. 표본을 100% MeOH와 함께 24°C에서 16시간 배양합니다.
   12. 표본을 24°C에서 15분간 배양시키고, 이 과정을 두 번 반복합니다.
   13. 표본을 디벤질 에테르로 24°C에서 16시간 동안 제거하세요.
       참고: 이 시점에서 조직이 투명해지지 않았다면, 더 기다려도 큰 개선은 없을 것입니다.
   14. 라이트시트 현미경으로 표본의 이미지를 촬영하세요.
       참고: EC Plan-Neofluar 5×/0.16 대물렌즈가 장착된 라이트시트를 사용하세요; 조명(여기)을 63nm, 검출을 648nm로 설정; 스텝 크기가 5.8 μm인 Z-스택을 획득합니다.
       주의: 메탄올, 디클로로메탄, 디벤질 에테르는 위험합니다. 모든 준비 및 취급은 적절한 개인 보호 장비를 착용한 채 연기구 내에서 이루어져야 합니다.
2. 라피클리어 1.52 시약
   1. 표본을 대략 5 mm × 5 mm × 2 mm 크기로 다듬으세요.
   2. 시료를 2% Triton-X 100 PBS에 50rpm, 24°C로 설정된 궤도 셰이커에 16시간 동안 투과화를 위해 옮겨 넣습니다.
   3. 표본을 신선하게 준비한 블로킹 버퍼 B(5% 당나귀 혈청과 1% 트리톤-X 100 in PBS)에 50rpm, 4 °C로 설정된 궤도 셰이커에 16시간 동안 담그십시오.
   4. 표본을 포도플라닌과 VE-카데린에 대한 1차 항체(둘 다 1:100 비율)와 함께 50rpm, 4°C로 설정된 궤도 셰이커 내 차단 버퍼 B에서 72시간 배양합니다.
   5. 샘플을 세척 버퍼 B(3% NaCl, 0.2% Triton-X 100 in PBS)로 24 °C에서 1시간 동안 세척하며, 이 과정을 세 번 반복합니다. 그 후 시료를 세척 완충기 B에서 50rpm, 4 °C로 설정한 궤도 셰이커에 16시간 동안 보관합니다.
   6. 표본을 24°C에서 PBS로 1시간 세척하세요.
   7. 샘플을 알렉사 플루오르 647과 토끼 IgG에 각각 1:1000 비율로 접합된 마우스 IgG와 토끼 IgG에 대한 2차 항체와 함께 50rpm, 4 °C로 설정된 궤도 셰이커의 차단 버퍼 B에서 16시간 동안 인큐브합니다.
   8. 1.5단계를 반복합니다. 그리고 1.6.
   9. 표본은 Rapiclear 1.52 샘플 부피의 최소 5배 이상을 24 °C에서 16시간 동안 제거하세요.
      참고: 조직의 말초 부위가 1시간 이내에 제거되는 것이 관찰되었습니다.
   10. 투명화된 표본을 신선한 Rapiclear 1.52 시약이 있는 덮개 위에 놓은 폴리디메틸실록산 젤 챔버에 삽입합니다.
   11. 공초점 현미경으로 표본을 영상화하세요.
       참고: Plan-Apochromat 10×/0.45 M27 대물렌즈가 장착된 공초점 현미경을 사용하세요; 여기 거리를 633nm와 561nm, 검출 범위 641-754nm, 566-628nm로 설정하고, GaAsP 검출기를 사용했습니다; 3.15 μm의 스텝 크기를 가진 Z-스택을 획득합니다.
3. 입방 기법
   1. 표본을 대략 5 mm × 5 mm × 3 mm 크기로 다듬으세요.
   2. 표본을 50% CUBIC-L에 24°C에 24시간 동안 담가 제거 전처리를 합니다.
   3. 표본을 50rpm, 37°C로 설정한 궤도 셰이커에서 100% CUBIC-L로 옮겨 7일간 탈색 처리를 진행합니다.
   4. 표본을 PBS로 실온에서 24시간 세척하세요.
   5. 시료를 신선하게 준비한 차단 버퍼 A에 50rpm, 24°C로 설정한 궤도 셰이커에 72시간 동안 담그십시오.
   6. VE-카데린, 포도플라닌, CD31에 대한 1차 항체(각각 1:100, 1:100, 1:200)를 50rpm, 37°C로 설정된 궤도 셰이커의 차단 버퍼 A에서 72시간 배양합니다.
   7. 표본을 세척 완충제 A로 24°C에서 1시간 동안 세척합니다. 이 과정을 세 번 반복한 후, 시료를 50rpm, 4°C로 설정한 궤도 셰이커의 세척 완충기 A에 72시간 동안 보관합니다.
   8. 샘플을 알렉사 플루오 647, 568, 488에 각각 1:1000 비율로 접합한 마우스 IgG, 토끼 IgG, 양 IgG에 대한 2차 항체를 72시간 동안 50rpm 궤도 셰이커의 차단 버퍼 안에 인큐브합니다.
   9. 3.7단계를 반복하세요.
   10. 표본을 24°C에서 50% CUBIC-R+(M)로 16시간 동안 미리 투명하게 만듭니다.
   11. 표본을 24°C에서 100% CUBIC-R+(M)로 16시간 동안 제거하세요.
       참고: 이 시점에서 조직이 투명해지지 않았다면, 더 기다려도 큰 개선은 없을 것입니다.
   12. 공초점 현미경으로 표본을 영상화하세요.
       참고: Plan-Apochromat 20×/0.8 M27 대물렌즈를 장착한 공초점 현미경을 사용하세요; 여기 거리를 633 nm, 561 nm, 488 nm, 검출 범위 641-754 nm, 566-628 nm, 479-550 nm로 설정하고, GaAsP 검출기를 사용한다; 스텝 사이즈 0.78 μm의 Z-스택을 획득합니다.

결과

표피가 있는 것과 없는 투명한 인간 피부 조직의 빛 투과율 차이
그림 1은 Rapiclear 1.52 시약으로 투과성 후 표피가 있는 인간 피부와 없는 표피 표본의 대표적인 사진을 보여줍니다. 표피 제거는 강력한 빛 흡수자인 멜라닌을 제거함으로써 조직의 투명도를 높여주며, 샘플 아래 검은 선이 더 잘 보이는 것으로 확인됩니다.

인간 피부의 림프관 3차원 거시적 시각화
iDISCO 기법을 이용한 조직 제거와 경광 시트 현미경을 결합함으로써, 주요 림프관 표지자인 포도플라닌의 면역염색을 통해 인간 피부 조직의 림프관 3차원 거시적 시각화가 이루어졌습니다¹⁴ (그림 2). 이 방법은 상세한 구조적 특징보다...

토론

생물 조직 내 림프 네트워크의 3차원 시각화는 그 구조적 특성과 생리적 기능, 그리고 병리학적 변화를 이해하는 데 매우 중요합니다. 이 프로토콜은 인간 피부 조직에 최적화된 세 가지 뚜렷한 조직 클리닝 방법을 제시하며, 각각 특정 관찰 목적에 맞춰 맞춤화되어 있습니다.

표피 제거는 조직 투명도를 감소시키고 조직학적 평가를 방해하는 멜라닌을 제거하는 데 중요한 단계로 간주됩니다¹⁹. 이와 일치하게, iDISCO를 이용한 표피 보존 상태에서 인간 피부 샘플을 면역 염색했을 때 특히 표피 바로 아래에서 약한 신호가 나타났으며, 이는 항체 침투와 표피 쪽에서의 레이저 투과가 저해되었음을 시사합니다. 또한, 이 프로토콜에서는 짧은 열 자극을 통해 표피를 제거하였습니다. 이 방법은 디스파스²⁰과 같은 효소 방식보다 피부 조직 구조와 세포막 단백질...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
항-CD31 항체	R& D 시스템즈	AF806	1:200 희석
항포도플라닌 항체	다코	M3619	1:100에서의 희석
항-VE-카데린 항체	세포 신호 전달 기술	#2500	1:100에서의 희석
큐빅-L	도쿄 화학 산업	T3740
CUBIC-R+(M)	도쿄 화학 산업	T3741
DMEM, 저혈당, 피루브산염	서모피셔 사이언티픽	11885084
당나귀 항마우스 IgG (H+L) 고도로 교차흡착된 2차 항체, Alexa Fluor 647	서모피셔 사이언티픽	A-31571	1:1000에서의 희석
당나귀 항-토끼 IgG (H+L) 고도로 교차흡착된 2차 항체, Alexa Fluor 568	서모피셔 사이언티픽	A10042	1:1000에서의 희석
당나귀 항양 IgG (H+L) 교차흡착 2차 항체, Alexa Fluor 488	서모피셔 사이언티픽	A-11015	1:1000에서의 희석
라피클리어 1.52	선진 연구소	RC152001
자이스 라이트시트 Z.1 현미경	칼 자이스
ZEISS LSM 880 공초점 레이저 주사 현미경	칼 자이스