단일 분자 FRET 분석법은 박테리아 sRNA와 mRNA 간의 Hfq 매개 어닐링을 정량적으로 분석하여 상호작용 속도론과 안정성을 측정할 수 있게 합니다. 대표적인 결과는 씨앗 길이, Hfq 결합 모티프, 모티프 간격이 RNA 이중형성에 미치는 영향을 보여줍니다.
연구 논문
단일 분자 FRET를 이용한 분석된 씨앗 길이와 결합 모티프가 Hfq 매개 sRNA-mRNA 어닐링에 미치는 영향
이 논문에서
요약
초록
박테리아 소규모 RNA(sRNA)와 그 mRNA 표적 간의 어닐링을 지배하는 규칙을 정의하는 것은 이 RNA들이 서열과 구조가 매우 이질적이기 때문에 어닐링을 규정하는 것이 어렵습니다. 개별 특징의 기여도를 분리하기 위해 씨앗 강도, Hfq 결합 모티프, 그 사이의 간격 등 주요 결정 요인을 체계적으로 변화시켰습니다. 이러한 특징들이 sRNA-mRNA 이중체 안정성에 미치는 영향은 단일 분자 포르스터 공명 에너지 전달(smFRET)을 사용하여 시험되었으며, 이는 밀리초 단위로 개별 RNA 분자를 모니터링할 수 있게 하고, 앙상블 분석법에서는 종종 가려지는 동적 이벤트에 접근할 수 있게 합니다.
우리는 짧은 씨앗 영역(4-5 bp)이 불안정하고 단명한 복합체를 형성하는 반면, 긴 씨앗(8-10 bp)은 안정적인 이중화를 형성함을 입증했습니다. Hfq 결합 모티프를 확장하거나 mRNA의 결합 부위 사이에 간격을 도입하면 상호작용 수명이 더욱 늘어났으며, 이는 Hfq 매개 어닐링 효율에서 모티프 강도와 공간적 배열의 중요성을 강조했습니다. 더불어, 이 접근법은 단일 분자 해상도로 RNA-RNA 상호작용 역학을 해부하고 RNA 샤페론 메커니즘을 탐구하는 견고하고 재현 가능한 틀을 제공합니다.
서론
박테리아 유전자 발현은 전사 후 단계에서 작은 RNA에 의해 광범위하게 조절됩니다. 이 짧은(보통 50-300 nt) RNA는 표적 mRNA와 염기쌍을 형성하여 작용합니다. 많은 경우, sRNA는 리보솜 결합 부위에 어닐링하여 번역을 억제하거나 RNase를 모집하여 mRNA 붕괴를 유도합니다 2,3. 이러한 상호작용은 유전학 및 생화학적 분석법을 통해 광범위하게 연구되었지만, 대부분의 기존 접근법은 RNA 수준이나 단백질 배출에 대한 정상 상태 효과를 간접적으로 유도하여 결합 역학을 해석하기 어렵게 만듭니다.
효율적인 표적 조절은 종종 RNA 샤페론인 Hfq, 즉 작은 헥사머 유사 Sm 단백질 4,5를 필요로 합니다. Hfq는 sRNA를 뉴클레아제6으로부터 차단하여 반감기를 연장하고, 표적 mRNA 7,8과의 어닐링을 촉진합니다. Hfq는 서로 다른 선호도를 가진 세 가지 뚜렷한 RNA 결합 표면을 통해 이러한 기능을 수행합니다: 원위 면은 mRNA에서 흔히 발견되는 AAN 모티프를 인식하고, 근위 면은 sRNA 말단체에 흔히 나타나는 U-풍부한 서열에 결합하며, 가장자리는 RNA 골격과 정전기적으로 상호작용합니다. 그러나 Hfq는 상호작용하는 RNA 전체 풀보다 훨씬 적은 양으로 존재합니다10,11. 이러한 명백한 한계에도 불구하고, 새로 합성된 sRNA는 전사 후 몇 분 이내에 표적을 찾아 조절을 유도합니다. 이 역설은 RNA-Hfq 상호작용이 매우 역동적이며, RNA가 안정적인 복합체에 결합되어 있지 않고 지속적으로 결합하고 해리한다는 것을 시사한다13,14. 이러한 일시적인 상호작용이 어떻게 신뢰할 수 있는 조절을 만들어내는지 이해하려면 개체군 평균이 아니라 개별 결합 사건에 대한 실험적 접근이 필요합니다.
sRNA와 mRNA 간의 상호작용은 불완전 상보적인 씨드 서열에 의해 매개되며, 이들은 종종 길고 구조가 강한 mRNA 내에서 일치 부위를 찾아야 합니다. 또한, sRNA 씨앗 영역과 mRNA의 Hfq 결합 부위 사이의 거리는 상당히15마일 달라질 수 있어 어닐링 과정을 더욱 복잡하게 만듭니다. Hfq는 표적 내 잠재적 결합 부위 간에 sRNA를 유연하게 전달함으로써 올바른 쌍 영역을 만날 가능성을 높여 이러한 문제를 극복합니다. Hfq 매개 쌍은 국소 mRNA 구조를 재설계하여 염기쌍 영역을 일시적으로 풀어내고 접근이 불가능한 서열을 노출시킬 수 있습니다. 그러나 이러한 재형성은 비생산적이거나 실패하는 어닐링 현상으로 이어질 수도 있습니다. 이러한 일시적 상호작용은 때때로 쌍 부위17 근처에 위치한 강한 Hfq 결합 모티프로 안정화될 수 있습니다. 이러한 유연성에도 불구하고, 모든 sRNA-mRNA 만남이 안정적인 이중결합을 이루는 것은 아니며, 어닐링 효율을 결정하는 요인들도 아직 잘 이해되지 않았습니다. 특히, 개별 서열 결정 인자가 결합 수명과 복합체 안정성에 정량적으로 어떻게 기여하는지는 여전히 불분명하다.
여기서 우리는 smFRET를 이용해 서열 결정 인물의 단계적 조작과 어닐링 동역학의 직접 측정을 가능하게 하는 최소 재구성 단일 분자 시스템을 구축했습니다. 이 시스템에서는 초기에는 비효율적인 어닐링과 씨앗 강도, Hfq 결합 모티프 강도, 이들 부위 간 간격 등 주요 특징을 체계적으로 변경한 RNA 쌍을 설계하여, 개별 매개변수가 이중적 안정성에 미치는 영향을 분석하였습니다. 통제된 시험관 내에서 정의된 서열 특징을 분리함으로써, 네트워크 복잡성과 간접 조절 효과로 인해 생 체 내에서 해체하기 어려운 sRNA 표적 규칙의 기전적 해부를 가능하게 합니다.
프로토콜
이 프로토콜은 sRNA-mRNA 어닐링을 모니터링하기 위한 단일 분자 FRET 분석법을 설명합니다. 모델 RNA 설계, 합성, 슬라이드 패시베이션 및 기능화, 단일 분자 영상 촬영, 정량적 데이터 분석 절차를 포함합니다.
RNA 준비
sRNA와 mRNA 서열을 실 리코에서 설계하세요. 각 sRNA는 전사 말단자를 포함하며, U-풍부한 Hfq 결합 모티프와 표적 mRNA에 상보적인 씨앗 서열을 포함해야 합니다. 해당 mRNA에는 Hfq 결합 모티프이자 sRNA 씨앗 영역과 상보적인 서열로 작용하는 AAN 반복 과정이 포함되어야 합니다. Hfq 결합 밖의 서열은 AAN 모티프와 U-풍부한 경로는 의도치 않은 Hfq 상호작용을 방지하기 위해 무작위로 처리됩니다. mRNA의 3' 말단에 테더 상보적 서열을 추가하여 영상 촬영 시 표면에 고정화를 가능하게 합니다. 웹 서버를 통해 RNA구조를 사용해 테더 상보 서열을 제외한 RNA 2차 구조를 예측할 수있습니다. 웹 기반 분석을 위해 FASTA 서열을 RNA구조 웹 서버(https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb)에 업로드하고 '2차 구조 예측'을 선택하세요. 기본 매개변수(온도 37°C, 접힘 제약 없음)를 사용하세요. 계산 후에는 구조 다이어그램과 접힘 확률을 점검합니다. 씨앗 내 뉴클레오타이드나 Hfq 결합 모티프 내 염기쌍 확률을 예측한 영역은 폐쇄된 영역으로 분류되었습니다 >60%). 이 임계값을 초과하는 서열은 재설계되었습니다.
제조사 프로토콜에 따라 DNA 중합효소를 이용해 겹치는 올리고뉴클레오타이드를 확장하여 시험관 내 전사용 DNA 템플릿을 준비합니다. 프라이머 농도는 각각 3 μM이었습니다. 제조사의 권고에 따라 열사이클러 프로그램은 사용되었으나, 증폭 사이클 수가 8회로 줄어들어 프라이머를 연장하기에 충분했습니다.
T7 RNA 중합효소를 1× 전사 버퍼(80 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2 mM 스페르미딘, 10 mM NaCl)에 3시간 동안 3시간에서 하룻밤까지 RNA를 전사하고, NTP 각 1 mM, DTT 40 mM, MgCl2 30 mM 보충 처리합니다. 최종 농도인 30 mM에 EDTA를 첨가하여 반응을 멈춥니다. RNA 침전을 위해서는 3M NaOAc(pH 5.4)의 1/10 부피를 추가하고, 이어서 ≥99% 에탄올 2.5-3부피를 추가합니다. 충분히 섞고 -80°C에서 1시간 동안 배양하세요. 4°C에서 ≥20,000 × g에서 35분간 원심분리하여 RNA 펠릿을 채취합니다. 상청액을 제거하고, 70% 에탄올로 펠릿을 세척한 후 잠시 자연 건조하세요. RNA 펠릿을 8 M 요소 20 μL에 녹이고 90 °C에서 2분간 가열합니다. RNA는 8M 요소가 함유된 8% 폴리아크릴아마이드 겔에서 정제합니다. 관심 밴드를 절제하고 용출 버퍼(0.3 M 아세테이트 나트륨, pH 5.4, 1 mM EDTA)에서 밤새 RNA를 용출합니다. RNA는 에탄올 침전법으로 회수하고(DNA 침전 지침에 따라 따라), 펠릿을 뉴클레아제가 없는 물에 녹입니다.
형광 표지용 RNA를 준비하기 위해, 설명한 대로 시험 관 내 전사를 수행하며, 반응에 32 mM GMP를 보충하여 5' 일인산을 포함한 전사체를 생성합니다. RNA를 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필] 카보디이마이드 하이드로클로라이드19 (EDC)와 이미다졸로 처리하여 5' 말단에 아민기를 도입합니다. 제조사 지침에 따라 알렉사 플루오 555 또는 Cy3 NHS 에스터와 함께 탄산염-중탄산염 완충제(pH 8.5)에서 배양하세요. 크로마토그래피 스핀 컬럼을 사용해 변형된 RNA를 정제하고, 에탄올과 함께 침전한 후 펠릿을 뉴클레아제가 없는 물에 녹입니다. 나노드롭 또는 이에 상응하는 분광광도계를 사용하여 260 nm 및 염료 특이적 흡수 최대치에서 흡광도를 측정하여 분광광도측정 효율을 결정합니다. 비어-램버트 법칙과 형광체 제조사가 제공하는 해당 소멸 계수를 사용하여 RNA와 염료 농도를 계산하세요. 표지 효율은 염료와 RNA의 몰 비율로 정의되며, 일상적으로 100%에 근접했습니다. 표지된 RNA는 -20°C에서 저장할 수 있습니다.
3′-비오틴 모이에티와 5′-아미노 C6 링커를 가진 DNA 올리고뉴클레오타이드를 순서로 만듭니다. 위에서 설명한 대로 에탄올과 아세트산나트륨을 이용해 DNA를 침전시킵니다. 제조사 지침에 따라 탄산염-중탄산염 완충제(pH 8.5)에 Cy5 NHS 에스터를 표기하세요. 위에서 설명한 대로 표지된 DNA 분광광도학적으로 농도를 측정합니다. 표지된 DNA는 -20 °C에서 저장할 수 있습니다.
HFQ 정화
대장균 BL21 (DE3) Δhfq::cat-sacB 세포를 배양하는데, 이 세포는 IPTG 유도 촉진제에서 발현되는 Hfq 발현 플라스미드 pET21b-EcHfq입니다. Hfq는 친화성 태그 없이 표현되며; 천연 단백질은 표면에 노출된 히스티딘 잔기가 충분히 포함되어 있어 Ni2+ 친화 크로마토그래피로 정제할 수 있습니다. LB-밀러 배양지 1L에 100 μg/mL 암피실린을 37°C에서 보충하여 OD600 0.6까지 배양하였다. IPTG를 최종 농도인 1 mM에 첨가하여 Hfq 발현을 유도하고 37 °C에서 4시간 배큐합니다. 세포를 5,000 × g에서 10분간 원심분리하여 수확한 후, 펠릿을 50 mL의 용해 버퍼(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 500 mM NH4Cl, 250 mM MgCl2, 1 mM 2-머카토에탄올, 주의: 2-머카토에탄올은 독성이 있으니 연기 후드에서 다루세요). 50% 듀티 사이클 펄스 설정으로 얼음 위에서 초음파 검사를 하여 세포를 용해합니다. 얼음 위에 40초 간격으로 3번의 펄스를 적용하고, 펄스 사이에 1분씩 냉각 시간을 두세요. 용해액을 27,000 g × 4°C에서 20분간 원심분리합니다. 상청액을 85 °C에서 45분간 가열한 후, 같은 조건에서 다시 원심분리합니다. 생성된 상청액을 RNase A(30 μg/mL)와 DNase I(5 U/mL)로 1시간 동안 실온에서 부드럽게 흔들고 처리한 후 0.45 μm 필터로 여과합니다. 정제된 용해물을 NiSO4가 미리 충전된 친화성 크로마토그래피 컬럼에 적용합니다. 버퍼(50 mM 트리스-HCl, pH 8.0, 500 mM NH4Cl, 0.5 mM 2-머캅토에탄올)로 컬럼을 세척합니다. 동일한 버퍼를 사용해 10 mM에서 1m 사이의 선형 이미다졸 구배 농도를 사용하여 단백질을 용출합니다. Hfq가 포함된 분획을 모아 HiLoad 16/600 Superdex 200 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에 적재하고, HB 버퍼(50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 250 mM NH4Cl, 1 mM EDTA, 10% 글리세롤)로 적재합니다. 제조사의 지침에 따라 컬럼을 작동하세요. Hfq 정제에 대한 대표적인 SDS-PAGE 분석은 보충 그림 1에 나와 있습니다. 필요 시 원심 필터(3 kDa MWCO)를 사용해 정제 단백질을 농축합니다. 정제된 Hfq 알리코트는 -80 °C에서 보관할 수 있습니다.
단일 분자 실험
석영 슬라이드의 패시베이션20
각 긴 가장자리 근처에 직경 0.8mm의 평행한 구멍 다섯 개를 뚫은 석영 슬라이드를 준비하세요. 석영 슬라이드와 커버슬립을 헬렌달 염색 병(슬라이드 홀더)에 넣고 아세톤에 20분간 소닉테이션하세요(주의: 아세톤은 가연성 및 휘발성입니다; 훈풍 후드에서 작업하세요). 메탄올로 세척 단계를 반복하세요(주의: 메탄올은 독성 있고 가연성입니다. 핸들은 훈 후드에 보관하세요). 슬라이드를 물로 꼼꼼히 헹구고 1M KOH에 초음파 세척해 1시간 동안 하세요(주의: KOH는 부식성이므로 장갑과 안구 보호구를 착용하세요). 슬라이드를 물로 헹구고, 아세톤과 메탄올에 각각 20분씩 차례로 초음파 세척합니다. KOH 세척은 5M KOH를 1시간 동안 반복한 후 철저한 물 헹구세요(주의: 농축된 KOH는 적절한 보호 장비와 함께 다룰 수 있습니다). 슬라이드를 자연 건조시켜. 깨끗한 헬렌달 염색 병 세트를 준비하고 헥산으로 헹구세요(주의: 헥산은 매우 인화성이 강하며, 연기 후드에 보관하세요), 그리고 자연 건조시킵니다. 슬라이드를 슬라이드 홀더에 넣고 헥산으로 두 번 헹구세요. 슬라이드 홀더에 헥산을 75mL 추가하고, 헥산 표면 아래에 50 μL 디클로로로디메틸실란(DMDCS)을 조심스럽게 주입하세요(참고: DMDCS는 공기 노출을 피하세요). 슬라이드를 부드럽게 흔들며 1.5시간 동안 부화시킵니다. 헥산에 슬라이드를 헹구고 초음파 처리한 후 이 과정을 세 번 반복하여 잔여 DMDC를 제거합니다. 슬라이드는 자연 건조시킨 후 50 mL 튜브(예: 팔콘 튜브 또는 원뿔 튜브)에 진공 밀봉합니다. 준비된 슬라이드는 −20 °C에서 보관할 수 있으며, 추가 사용 전까지 가능합니다.
유량 채널의 조립 및 기능화
간단한 플로우 채널은 쿼츠 슬라이드, 유리 커버슬립, 양면 테이프, 피펫 팁, 에폭시를 사용해 조립할 수 있습니다. 쿼츠 슬라이드의 구멍 사이에 얇은 양면 테이프를 붙이고 커버슬립을 위에 올려놓으세요. 긴 가장자리는 에폭시로 밀봉하세요. 피펫 팁에서 약 5mm 길이의 구간(좁은 팁과 넓은 칼라 모두)을 잘라내어 한 쪽은 구멍에 넣어 출구로, 다른 하나는 평행한 구멍에 넣어 입구 저장소를 만듭니다. 둘 다 에폭시로 고정하세요. 주입 전에 유입구 저장소가 누수되지 않고 액체를 유지해야 합니다. 용액을 채널을 통해 끌어들이려면, 1mL 주사기에서 출구에 튜브를 연결하세요.
표면을 기능화하기 위해 다음 시약으로 순차적으로 채널을 전처리하세요: 비오티닐화 BSA(0.2 mg/mL) 5분, Tween-20(0.2%) 10분, NeutrAvidin(0.1 mg/mL) 1분. 각 용액당 약 100 μL가 채널당 충분한 양입니다. 입구 저장소에 존재하는 액체보다 더 많은 액체를 끌어당기지 마세요. 이는 채널에 공기를 유입시켜 기포를 발생시킵니다. 각 단계 사이에 저장소에 소량의 용액을 남겨 채널이 건조해지는 것을 방지하세요. 각 단계 사이에 1× TNK 버퍼(10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 50 mM NaCl, 50 mM KCl)로 꼼꼼히 헹군다. 이 처리는 RNA 고정을 위한 비오틴-뉴트르아비딘 표면을 형성합니다.
고정 직전에 40 nM mRNA와 20 nM 비오틴화 Cy5 표지 DNA 테더를 혼합하여 mRNA-테더 듀플렉스를 준비합니다. 혼합물을 75°C에서 1× TNK 완충제(10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 50 mM NaCl, 50 mM KCl)에서 5분간 변성시키고, 37°C에서 15분간 재변성하여 20°C에서 평형을 맞춥니다.
샘플을 영상 버퍼(10 mM 트리스-HCl, pH 7.5, 50 mM NaCl, 50 mM KCl, 4 mM 6-하이드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로만-2-카복실산, 0.01% 옥타에틸렌글리콜 모도데실 에테르, 0.8% 포도당, 2 U/mL RNase 억제제)에서 50배 희석한 후 흐름 채널에 주입하여 mRNA를 고정시킵니다. 1분간 인큐베이팅한 후 영상 버퍼와 산소 세척 시스템(165 U/mL 포도당 산화효소 및 2170 U/mL 카탈라제)을 보충하여 광표백을 줄입니다.
sRNA-Hfq 복합체는 1:1 비율로 최종 250 nM 농도에 혼합하여 1× TNK 버퍼에 넣고 상온에서 5-15분간 배양합니다. 산소 청소 시스템이 포함된 영상 버퍼에서 복합물을 50배 희석한 후 영상 촬영 직전에 유동 채널에 주입합니다.
단일 분자 데이터 수집
EMCCD 카메라와 레이저를 켜서 프리즘 기반 전반사 형광현미경(TIRF)을 설치했습니다. 조립된 흐름 채널이 장착된 준비된 슬라이드를 현미경 스테이지에 장착하고 프리즘을 그 위에 올려놓습니다. 데이터를 수집하기 위해 단일 소프트웨어(https://github.com/Ha-SingleMoleculeLab)를 사용하세요. 소프트웨어에서 AutoScale을 선택하여 백그라운드 레벨을 결정하고, 얻은 값을 배경 필드에 복사하세요. 획득 프레임 속도를 100ms로 설정하세요. 532nm 레이저로 Alexa Fluor 555 또는 Cy3를, 633nm 레이저로 Cy5를 Excite 촬영하세요. 60×의 물 침수 목표를 통해 두 채널에서 동시에 배출물을 수집합니다. 각 영상마다 633 nm 여기 10프레임을 사용하여 시야 내 Cy5 표지 mRNA를 국소화합니다. 532nm 여기로 5분간 계속 녹화하세요. 획득을 마치고 633nm 여기 1초를 사용해 Cy5 광표백을 검증합니다. 이렇게 하면 .pma 동영상 파일이 생성되어 분석에 활용됩니다.
단일 분자 데이터 분석
맞춤형 IDL 스크립트를 사용해 원시 .pma 파일을 분석하여 기증자-수용체 채널 매핑을 수행하고 형광 강도 궤적을 추출합니다. 먼저, 532nm 또는 633nm 레이저로 여기 시 기증자와 수용체 채널 모두에서 감지되는 다색 형광 구슬을 사용해 보정 영상을 녹화합니다. 이 보정 영상을 사용해 기증자와 수용자 채널을 정렬하는 매핑 파일을 생성하세요. 결과 매핑 파일을 모든 실험 기록에 적용하여 해당 기증자-수용체 쌍을 식별하고, 형광 반점을 검출하며, 강도 시간 추적 데이터를 내보내 후속 FRET 분석에 활용합니다. 스크립트(https://github.com/Ha-SingleMoleculeLab)와 함께 상세한 단계별 지침이 제공됩니다.
스크립트 s_tr_E.m을 사용하여 MATLAB에서 처리 강도 추적을 수행합니다. 스크립트를 실행하고 .traces와 .pks 파일이 포함된 디렉터리에 입력하고, 이어서 파일 인덱스와 시간 해상도를 입력하세요. 표시 시 표시된 부분 식별에 사용되는 프레임 창을 선택하세요. 스크립트는 각 지점별로 기증 및 수용체 강도를 표시합니다. 키보드 명령어로 분자를 탐색하세요(b로 돌아가기, g로 지정된 분자로 점프). 도너 및 수용기 기준선(k)을 정의하고 누설 (l)를 필요에 따라 플롯을 클릭하여 수정하세요. s를 눌러 시간, 기증자, 수용체 강도를 포함한 .dat 파일로 수락된 트레이스를 개별적으로 저장하세요. 내보낸 파일을 하위 정량 분석에 활용하세요.
피크 파인더 프로그램을 사용하여 개별 smFRET 흔적을 분석하고, 정량화를 위한 결합 이벤트를 추출하며, 여기에는 드웰 타임 분석과 FRET 상태 분포가 포함됩니다. 프로그램을 실행하고 파일 메뉴를 통해 내보낸 .dat 추적 파일이 있는 폴더를 열어보세요. MATLAB 스크립트를 사용해 이전에 결정한 기저 값과 기증자-수용체 누출 값을 설정합니다. 다음으로, 모든 시각적 검증된 결합 이벤트가 선택 값 이상에 위치하도록 강도 임계값을 설정하여 자동 피크 검출을 안내합니다. 만약 노이즈로 인해 하나의 이벤트가 여러 피크로 나뉘면, 내장된 병합 기능을 사용해 수동으로 병합하세요. 피크 저장을 클릭하면 각 이벤트의 시작 시간, 종료 시간, 평균 FRET 효율을 포함하는 .csv 파일로 내보내야 합니다. 출력 파일은 피크 디렉터리에 저장되며, 각 이벤트의 프레임 해상도 FRET 값은 피크 프렛 디렉터리에 기록됩니다. FRET 효율은 수용기 형광 강도를 기증 및 수용체 강도의 합으로 나누어 계산하며, 배경 및 기증기 채널로의 누출을 보정한 값을 사용합니다. Cy5 광표백 여부를 수동으로 검사하며, FRET 효율이 급격히 감소하고 Cy3 강도가 증가하는 것으로 확인됩니다. 광표백이 발생할 때, Cy3 형광이 검출 가능한 한 결합이 지속된다고 가정하고, 해당 .csv 파일을 편집하여 피크 지속 시간을 보정합니다.
피크 프렛 파일에서 프레임 해상도 FRET 효율 값을 GraphPad Prism으로 가져오세요. 주파수 분포 함수를 사용하여 FRET 히스토그램을 생성하고, 가우시안 모델로 분포를 맞춰 우세한 FRET 집단을 식별합니다.
스프레드시트를 사용해 분리 시점에서 연관성을 빼어 개별 결합 이벤트의 잔류 시간을 결정합니다. 각 실험 반복에 대해 과도 사건의 비율(<10초)을 계산합니다. 통계 분석은 GraphPad Prism에서 수행되었습니다. 두 질환 간 비교는 비쌍 t-검정을 사용했고, 세 가지 이상의 조건 간 비교는 Tukey의 사후 검정과 일원 ANOVA를 사용해 분석하였습니다.
결과
씨앗 길이는 sRNA-mRNA 쌍의 동적 영역을 설정합니다
우리는 서열 특성이 Hfq 매개 어닐링을 어떻게 조절하는지 검증하기 위해 최소 단일 분자 분석법을 구축했습니다. 모델 RNA는 이전에 기술된 Hfq 의존성 sRNA-mRNA 쌍 구조를 따라 설계되었으며, mRNA에는 아데노신이 풍부한 Hfq-결합 모티프를, sRNA에는 우리딘이 풍부한 가장자리 결합 부위를 가지고 있습니다(그림 1A). sRNA는 5ʹ 말단에 Alexa Fluor 555(공여자)와 표지하고, mRNA-DNA 테더에 Cy5(수용체)로 표지하여 FRET를 통해 염기쌍 유도 근접성을 검출할 수 있게 되었습니다.
씨앗의 상보성을 4, 5, 8, 10 bp로 변화시키면 뚜렷한 동적 행동이 나타났다. 4-bp 씨앗에서는 상호작용이 주로 일시적이었고 이질적인 FRET 효율을 보여 불완전 염기쌍을 시사합니다(그림 1B-D). 반면, 8-bp 및 10-bp 씨앗은 관찰 창을 통해 자주 지속되는 안정적인 이중씨앗을 형성했다(그림 1C). 상호작용은 RNA 간 완전한 염기쌍을 나타내는 것으로 예상되는 높은 FRET 상태(EFRET ≈ 0.79-0.80, 그림 1D)를 만들어냈습니다. 5-bp 씨앗은 짧지만 명확한 결합 이벤트(EFRET ≈ 0.66)를 생성하여 RNA 서열 변형을 위한 실용적인 동적 범위를 제공했습니다(그림 1B-D). 따라서 모든 하류 검사에 대해 5-bp 상보성을 사용했습니다.
더 강한 Hfq 결합 모티프는 sRNA-mRNA 복합체의 안정성을 높입니다
다음으로, Hfq 결합 강도가 고정된 5-bp 상보성에서 결합 수명을 어떻게 조절하는지 질문했습니다. mRNA 모티프를 AAN4에서 AAN6로 확장하면 안정적인 복합체 형성 확률이 크게 증가했습니다(p < 0.001). 평균 수명은 7.5초에서 18초로 증가했고, 10초< 불안정 사건의 비율은 80± 2%에서 68.3± 2.9%로 감소했다(그림 2A-C).
그 후 Hfq 결합 모티프가 sRNA에 미치는 영향을 테스트했습니다. 가장자리 결합 부위를 UUAUUUUUU에서 CUUC(sRNA-SR, '짧은 가장자리')로 단축하면 매우 불안정한 상호작용이 발생했으며(AAN4와의 평균 수명은 1.9초), mRNA 모티프를 강화하는 것은 미미한 효과만을 보였습니다(AAN6 기준 평균 3.0초, 유의미하지 않음, 그림 2B, C). 따라서 양쪽 모두 생성된 복합체의 안정성에 기여하지만, 약한 sRNA-Hfq 접촉은 더 강한 mRNA 모티프의 이득을 제한합니다.
mRNA의 Hfq-부위와 씨앗 부위 사이의 스페이서는 더 오래 지속되는 복합체를 촉진합니다
Hfq는 AAN 영역에 결합된 상태를 유지하면서 가장자리 표면을 이용해 최적의 sRNA 쌍 부위16을 탐색할 수 있습니다. 이 특성은 mRNA의 두 결합 영역 간 추가 간격이 상호작용 안정성에 영향을 줄 수 있음을 시사합니다.
이를 검증하기 위해 Hfq와 sRNA 결합 부위(N15) 사이에 15-nt 단일 가닥 간격을 도입했습니다. 이 변형은 안정적인 어닐링 이벤트의 수명을 7.5초(AAN4)에서 47초(AAN4-N15)로 크게 늘렸습니다(p < 0.01)(그림 3A,B). 10초 미만으로 지속되는 결합 사건의 비율도 80± 2%에서 44± 6%로 감소했다(그림 3C). 이 데이터는 결합 모듈 간의 유연성 증가가 어닐링 중간체를 안정화하고 더플렉스 수명을 연장할 수 있음을 시사합니다.
데이터 가용성:
이 연구 결과를 뒷받침하는 모든 데이터, 즉 단일 분자 FRET 궤적, 처리 데이터셋, 분석 스크립트는 Mendeley Data 저장소에서 공개되어 있습니다: doi:10.17632/3z8fng2c8g.1
그림 1: sRNA-mRNA 상보성이 결합 효율성에 미치는 영향. (A) sRNA-mRNA 어닐링을 위한 smFRET 분석. Alexa Fluor 555 표지된 sRNA와 고정된 mRNA-Cy5-DNA 테더 복합체 간의 염기쌍은 높은 FRET 신호를 생성합니다. 모델 mRNA는 Hfq 결합 부위(AAC)4(파란색)와 sRNA 결합 부위(S5, 빨간색), 그 다음으로 다섯 개의 뉴클레오타이드와 RNA-DNA 하이브리드 영역을 포함합니다. sRNA는 가장자리 결합 부위(주황색)를 포함합니다. (B-D) 패널은 실험 조건(씨앗 길이)에 따라 그룹화됩니다. (B) 단일 mRNA 분자에서의 대표적인 sRNA 결합 이벤트. Alexa Fluor 555 표지된 sRNA(기증자, 녹색)와 Cy5-DNA 테더(수용체, 빨간색)의 형광 강도 미량이 나타났습니다. Cy5는 녹화의 첫 번째와 마지막 10프레임 동안 직접 흥분했다. (C) sRNA-Hfq에 결합된 50개의 대표 mRNA 분자를 묘사한 래스터그램. 각 가로 막대는 단일 sRNA-mRNA 상호작용을 나타냅니다. (D) 4 bp(N = 416 mRNA), 5 bp(N = 513 mRNA), 8 bp(N = 191 mRNA), 또는 10 bp(N = 105 mRNA) 상호보완 영역을 포함하는 sRNA와 상호작용에 대한 FRET 효율의 히스토그램. FRET 효율은 0.1초 간격의 개별 결합 이벤트에 대해 기초 및 누출 보정된 기증자 및 수용체 강도를 기준으로 계산하였다. 가우시안 적합도(파란색)는 우세 FRET 집단을 나타내며, E_FRET 값 계산에는 사용되지 않았습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
그림 2: Hfq-결합 모티프 길이가 sRNA-mRNA 상호작용에 미치는 영향. 모든 변이체에서 염기쌍 영역은 5 bp 길이입니다. (A) sRNA-Hfq 복합체에 결합된 50개의 대표성 mRNA를 보여주는 래스터그램. 각 가로 막대는 단일 상호작용을 나타냅니다. 위의 만화 다이어그램은 mRNA의 (AAC) 반복 횟수와 sRNA의 가장자리 결합 영역 길이가 변하는 RNA 설계를 보여줍니다(SR = "짧은 가장자리"). 그림 1A와 같은 색칠 방식입니다. (B) sRNA-mRNA 결합 수명의 산점도. 각 점은 하나의 결합 사건을 나타냅니다. 평균 수명(빨간색 가로선): mRNA-AAN4 + sRNA 7.5초(N = 188 mRNA), mRNA-AAN6 + sRNA 18초(N = 142 mRNA), mRNA-AAN4 + sRNA-SR 1.9초(N = 85 mRNA), mRNA-AAN6 + sRNA-SR 3초(N = 149 mRNA). (C) 10초 미만의 결합 사건 비율을 보여주는 막대 그래프. 오차 바는 두 독립적인 데이터셋의 표준편차를 나타냅니다. 다중 비교를 위한 Tukey의 사후 검정을 이용한 일원 ANOVA에 의한 통계 분석. p < 0.001, ****p < 0.0001; 중요하지 않다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
그림 3: Hfq-및 sRNA 결합 부위 사이의 스페이서 길이가 sRNA-mRNA 상호작용에 미치는 영향. 모든 변이체에서 염기쌍 영역은 5 bp 길이입니다. (A) sRNA-Hfq 복합체에 결합된 50개의 대표성 mRNA를 묘사한 래스터그램. 각 가로 막대는 하나의 결속 이벤트를 나타냅니다. 위의 만화 도표는 해당 RNA 설계를 보여줍니다. N15 = 15 nt 스페이서, 무작위 시퀀스. 그림 1A와 같은 색칠 방식입니다. (B) sRNA-mRNA 결합 수명의 산점도. 각 점은 하나의 결합 사건을 나타냅니다. 평균 수명(빨간색 가로선): mRNA-AAN4 + sRNA 7.5초(N = 188 mRNA), mRNA-AAN4-N15 + sRNA는 47초(N = 289 mRNA). (C) 10초 미만의 결합 사건 비율을 보여주는 막대 그래프. 오차 바는 두 독립적인 데이터셋의 표준편차를 나타냅니다. 비쌍 t-검정을 통한 통계 분석. **p < 0.01. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
보조 그림 1: 대장균 정제 과정. Hfq 발현 및 정제에 대한 SDS-PAGE 분석. (상단) 정제 과정에서 Ni2+ 친화성(HiTrap) 컬럼에서 수집된 샘플로, 유도 전, 유도 후, 펠릿, 용해액, 부하, 흐름 통과, 세척 분획, 용출된 피크 분획을 포함합니다. (아래) HiLoad 16/600 Superdex 200 컬럼에서 크기 배제 크로마토그래피 후 최대 분획의 SDS-PAGE. Hfq는 단량체(~11 kDa)와 헥사머리(~66 kDa) 형태가 나타난다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.
토론
이 연구는 특정 RNA 서열 특징이 Hfq 매개 sRNA-mRNA 어닐링의 효율성을 어떻게 결정하는지 분석하기 위한 최소한의 단일 분자 분석 방법을 확립합니다. 씨앗 길이, Hfq 결합 모티프 강도, 결합 모듈 간 간격을 변화시켜 각 매개변수가 단일 분자 해상도에서 이중적 안정성에 어떻게 기여하는지 직접 정량화했습니다. 집단 평균화된 효과를 보고하는 앙상블 측정과 달리, 이 접근법은 개별 결합 및 해리 사건을 직접 해결하여 운동학적 이질성과 일시적 상호작용을 측정할 수 있게 합니다. 우리의 결과는 짧은 씨앗 영역도 일시적으로 참여할 수 있는 반면, 긴 씨앗은 수명이 길고 안정적인 이중성을 형성한다는 것을 보여줍니다. 이 발견들은 박테리아 sRNA 의 자연 씨앗 영역이 일반적으로 6-12개의 뉴클레오타이드에 걸쳐 있으며 완전상보적 이중(21,22,23)을 형성하는 경우는 드물다는 이전 생체 및 앙상블 데이터와 일치합니다.
또한 mRNA와 sRNA Hfq 결합 모티프 모두 이중적 안정성에 강한 영향을 미친다는 사실도 발견했습니다. mRNA에서 AAN 모티프를 연장하면 결합 수명이 늘어났고, sRNA 가장자리 결합 부위를 단축하면 결합 수명이 현저히 불안정해졌습니다. 이는 Hfq의 원위 면이 아데노신 풍부한 mRNA 모티프를 고정하고, 가장자리가 상보 영역의 효율적인 정렬을 촉진하기 위해 우리딘이 풍부한 sRNA를 모집하는 협력적 모델을 뒷받침합니다. 일반적으로 생산적인 조절 결과만 감지하는 유전적 또는 리포터 기반 분석과 달리, 이 시스템은 결합 안정성과 하위 효과를 정량적으로 분리하여 개별 서열 특징이 물리적 상호작용 수명을 어떻게 조절하는지 직접 비교할 수 있게 합니다. 강한 가장자리 결합 모티프는 sRNA-mRNA 쌍을 위해 구조적 재배열이 필요할 때 특히 중요하며, 이는 Hfq17에서 RNA 보유를 촉진합니다. 이 가장자리는 또한 sRNA-Hfq 복합체16에 의한 mRNA의 측면 주사를 촉진하는 것으로 여겨지는데, 이는 표적 부위가 Hfq 결합 영역에서 멀리 떨어져 있을 때 특히 중요할 수 있습니다. 결합 부위 사이에 15 nt 간격을 두는 결과는 씨앗과 Hfq 모티프 간의 추가적인 유연성이 쌍의 안정성을 높이고, 가닥 교환 시 입체 제약을 줄여 쌍 안정성을 높인다는 것을 보여줍니다.
자연 시스템을 넘어, 이 결과는 합성 또는 조작된 sRNA 설계에도 관련이 있습니다. 기존 설계 전략 대부분은 씨앗 영역이나 일반적인 스캐폴드 최적화에 초점을 맞추지만, 우리 데이터는 Hfq 결합 모티프와 목표 영역 간 간격과 같은 추가 결정 요인을 강조합니다. 서열 특징이 통제되고 모듈화된 방식으로 도입되기 때문에, 이 분석법은 설계 규칙을 검증하기 위한 체계적인 실험 틀을 제공합니다. 이 원리는 규제 효율이 향상된 인공 sRNA의 향후 구축을 안내할 수 있습니다.
이 접근법은 RNA-RNA 상호작용의 정량적이고 재현 가능한 분석을 가능하게 하지만, 한계도 존재합니다. 이 분석법은 완전 상보적인 영역을 조사하지만, 대부분의 생리적 sRNA-mRNA 상호작용에는 인식과 조절에 영향을 줄 수 있는 불일치와 돌출이 있습니다. 이 방법은 sRNA-mRNA 결합 수명을 측정하지만, 번역 억제나 mRNA 붕괴와 같은 후속 조절 결과를 직접적으로 다루지는 않습니다. 향후 이 분석법의 적응 방식으로는 불일치하는 씨앗 영역, 다양한 GC 함량, 또는 리보솜과 퇴화체를 포함해 이러한 요인들이 결합 반응학을 어떻게 형성하는지 체계적으로 탐구할 수 있습니다.
공개 사항
저자들은 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
단일 분자 기기 접근을 촉진해 주신 사라 우드슨 교수님께 감사드립니다. 이 연구는 폴란드 국립과학센터(2022/46/E/NZ1/00462 to EMM)와 EMBO 설치 보조금(IG 5730-2024 to EMM)의 지원을 받았습니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.45 & μ; M 필터 | 밀리포어 | HABG04700 | |
| 5 mL 하이트랩 컬럼 | 시티바 | GE17-0408-01 | |
| 아세톤 | 머크 | 270725 | HPLC 등급 |
| 아크릴아마이드: 비스-아크릴아마이드 용액 | 머크 | A2792-100ML | |
| ALEXA555 NHS 석시니미딜 에스터 | 서모 피셔 | A20009 | |
| 아미콘 울트라 원심 필터 (NMWL, 3 kDa) | 머크 | UFC900308 | |
| 염화암모늄 | 머크 | 1330-500G | |
| 암피실린 | 머크 | A9518-5G | |
| ATP | 라인갈 케미컬스 | K054.1 | |
| 베타-머캅토에탄올 | 머크 | M3148-500ML | |
| 바이오-BSA | 머크 | A8549-10MG | |
| 바이오-젤 P-30을 사용한 바이오스핀 컬럼 | 바이오 래드 | 7326231 | 표지된 RNA 정제를 위해 |
| 카탈라제 | 머크 | C9322 | |
| CTP | 라인갈 케미컬스 | K057.4 | |
| Cy3 HNS 에스터 | 시티바 | PA13105 | |
| Cy5 NHS 석시니미딜 에스터 | 시티바 | PA15101 | |
| DDT | 서모 피셔 | R0861 | |
| 디클로로디메틸실란 | 머크 | 440272 | |
| DNA 올리고머(테더) 5′-아미노 링커 C6 | 열과학 | 해당 없음 | |
| 드나스 I | 써모 사이언티픽 | 18047019 | |
| 일상 운송 | 열과학 | PG82079 | |
| EDTA | 머크 | ED2SS-1KG | |
| EMCCD 카메라 및 nbsp; | 안도르 | ||
| 에탄올 | 머크 | 1085430250 | |
| 포도당 | 머크 | D9434-1KG | |
| 포도당 산화효소 | 머크 | G2133-50KU | |
| 글리세롤 | 머크 | G5516-1L | |
| GMP | 머크 | G8377 | |
| GTP | 라인갈 케미컬스 | K056.4 | |
| 수염 | 머크 | 1.00318 | |
| 헥산 | 서모 피셔 | 045652.M1 | |
| HiLoad 16/60 Superdex 200 크기 제외 컬럼 | 시티바 | GE28-9893-35 | |
| IPTG | 머크 | 420322-1GM | |
| KCl | 머크 | P9541-1KG | |
| 코 | 머크 | 484016-1KG | |
| 염화마겐슘 | 머크 | M8266-1KG | |
| 메탄올과 nbsp; | 머크 | 34885-M | HPLC 등급 |
| 뉴트라비딘 | 서모 피셔 | 31000 | |
| 황산니켈 | 머크 | 1067261000 | |
| 니콜 | 머크 | P8925-1G | |
| Q5 중합효소 | NEB | M0491S | 시험관 내 전사 템플릿 제작에 사용 |
| RNase A | 열과학 | EN0531 | |
| RNasin Plus | 프로메가 | N2611 | |
| 아세테이트 나트륨 | 머크 | S7545-100G | |
| 염화나트륨 | 시그마-올드리치 | S3014-1KG | |
| 스퍼미딘 | 머크 생명과학 | S2626 | |
| 트리스 베이스 | 써모 사이언티픽 | 17926 | |
| 트롤록스 | 머크 | 238813-1G | |
| 요소 | 머크 | U1250-5KG | |
| UTP | 라인갈 케미컬스 | K055.3 |
참고문헌
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