초파리 난자세포의 아센트로소체 미세소관 네트워크의 라이브 이미징 및 정량 분석을 위한 워크플로우

Summary

여기서는 라이브 영상과 자동 분석 도구를 결합하여 초파리 난모세포의 미세소관 역학을 분석하는 프로토콜을 소개합니다. 이 워크플로우는 성장, 방향, 속도, 공간 조직 등 미세소관 행동을 효율적이고 재현 가능하게 하며, 최적화 후 다른 세포 유형에도 적용할 수 있습니다.

Abstract

미세소관(MT) 세포골격은 세포 형태, 극성, 이동, 분열 등 많은 세포 기능에 필수적입니다. 중심체는 분열 동물 세포에서 주요 MT 조직 중심(MTOC) 역할을 하지만, 초파리 난모세포를 포함한 많은 분화 세포는 MT를 구성하기 위해 중심체(acentrosomal path)에 의존합니다. 증식 세포에서 MT 조직에 대한 광범위한 지식과 달리, 중심체 없이 MT가 어떻게 조립되는지에 대해서는 거의 알려진 바가 없습니다. 초파리 난모세포는 중심체의 MT 조직과 역학을 연구하는 강력한 모델을 제공합니다. 하지만 그들의 밀집된 MT 네트워크는 기존 영상에 도전을 줍니다. 실시간 영상은 MT 성장 및 방향을 실시간으로 시각화할 수 있지만, 표준화된 분석 방법은 여전히 제한적입니다. 여기서는 활성 MT 중합 부위를 표지하는 종단 결합 단백질 1(EB1)-녹색 형광 단백질(GFP)을 사용하여 초 파리 난모세포에서 MT 성장 역학을 분석하는 라이브 영상 기반 프로토콜을 제시합니다. 고해상도 Airyscan 공초점 현미경은 EB1 혜성 검출을 가능하게 하며, 맞춤형 피지 매크로와 Python 스크립트는 혜성 밀도, 속도, 길이, 방향을 효율적이고 재현 가능하게 정량화합니다. 우리는 대조군 난자와 냉기 유도 MT 탈중합을 받은 난자, 그리고 보존된 MT -말단 안정제이자 비중심체 미세소관 조직 중심(ncMTOC)의 핵심 구성 요소인 Patronin 돌연변이체(인간의 CAMSAP)를 비교하여 이 방법을 검증하여 MT 역학 장애에 대한 긍정적 대조군으로 사용하였습니다. 분석 결과, EB1 혜성의 전방 풍부도와 특성적 방향 편향 등 영역별 MT 역학이 드러났으며, MT 성장의 미세한 교란을 감지하는 워크플로우의 민감도를 확인하였습니다. 이 접근법은 난자세포에서 MT 행동을 연구하는 신뢰할 수 있고 사용자 친화적인 프레임워크를 제공합니다. 이 단계별 프로토콜은 이러한 맥락에서 MT 조절자를 연구할 수 있게 하며, 적절한 최적화를 통해 뉴런과 상피세포 등 다른 분화 세포 유형에도 적용할 수 있습니다. 더 넓게는 다양한 MT 구조가 특수한 세포 기능의 기초를 어떻게 이루는지 조사하는 기전론적 연구와 유전적 스크리닝을 지원합니다.

Introduction

미세소관(MT) 세포골격은 진핵생물 세포의 필수 구성 요소로, 세포 형태, 극성, 분열을 형성하고 유지하는 데 중요한 역할을 합니다. 성장과 수축이 특징인 MT 고분자의 동적 거동은 많은 MT 기반 공정에서 매우 중요합니다 ^1,2. 서로 다른 MT 배열의 조립은 MT가 핵생성되는 미세소관 조직 중심(MTOC)의 결합 작용과 MT의 안정성, 방향 및 동역학을 조절하는 다양한 MT 조절 단백질의 활성에 의존합니다 ^1,2,3. 가장 많이 연구된 MTOC는 중심체로, 세포 형태와 극성 조절, 유사분열 ^4,5에서 세포 형태와 극성 조절에 중요한 방사형 MT를 생성합니다. 그러나 신경세포와 상피세포처럼 유사분열 배출이나 분화 시 중심체의 MTOC 활성은 종종 감소하며, 난자와 같은 극단적인 경우에는 제거될 수 있습니다 ^6,7. 이는 종종 MT 세포 골격의 세포 유형별 재구성과 관련이 있으며, MTOC 기능이 다른 세포 부위(^2,3,8)에 할당되는데, 이를 일반적으로 비중심체체 MTOC(ncMTOCs)라고 부릅니다. 유사분열 세포에서 MT의 조직을 밝히는 데 상당한 진전이 있었지만, 유사분열을 벗어나거나 분화를 겪는 동물 세포에서 MT가 어떻게 핵생성, 안정화, 공간적으로 배열되는지에 대해서는 비교적 알려진 바가 적다^. 특히 생물체에서는 대부분의 세포가 분열하지 않습니다; 세포 주기를 벗어났거나 분화한 상태입니다. 따라서 이러한 맥락에서 MT 세포골격이 어떻게 조립되고 조절되는지 이해하는 것이 매우 중요합니다. 이 지식은 특수 세포 기능을 지원하기 위해 독특한 MT 아키텍처가 어떻게 확립되는지 밝혀내는 데 필수적입니다.

초파리 멜라노가스터 난모세포는 중심체의 MT 조직과 기능을 연구하는 강력한 시스템을 제공합니다. 난자 형성 중기에는 중심체 활성이^약화되고, MT는 난자 전측 피질에 국한된 ncMTOCs로부터 생성됩니다(그림 1B). 이 MT 네트워크는 모체 mRNA, 단백질, 소기관의 위치 지정에 필수적이며, 이는 미래 배아 축 형성과 발달에 매우 중요합니다^10,11. 이전 연구들은 난모세포의 ncMTOCs가 MT 마이너스 말단 단백질인 Patronin으로 구성되어 있으며, 이는 스펙트라플라킨 단백질인 Shot과 복합체를 이루며 피질 액틴 세포골격에 고정되어 있음을 보여주었다. MT는 카타닌과 같은 효소를 절단하여 생성된 짧은 MT 조각에서 성장하며, 이 분열체가 추가 MT 중합의 씨앗 역할을 할 수 있다고 제안되었다¹². 유사한 메커니즘은 뉴런¹³과 같은 다른 분화 세포에서도 제안되었으며, 중심체 활동이 감소하는 경우도 있습니다. 그러나 난자와 같은 복잡한 MT 네트워크를 절단하는 메커니즘은 아직 잘 알려져 있지 않습니다. 이러한 맥락에서 MT가 주로 절단 기반 재배열로 형성되는지, 아니면 절단과 신규 MT 핵생성의 조합으로 형성되는지는 아직 명확하지 않습니다. 난자 MT 네트워크의 복잡성은 잘 알려진 중심체 맥락 밖에서 MT가 어떻게 생성되고 조직되는지를 연구하는 데 이상적인 시스템입니다. 특히, 이는 영상 및 분석에도 도전 과제를 제기합니다. 난자 내 밀집된 MT 네트워크로 인해 기존 면역염색이나 정적 영상 기법으로 개별 MT를 분리하기 어렵습니다(^2,14).

라이브 이미징은 MT 중합 이벤트를 실시간으로 시각화할 수 있게 하여 MT 성장의 역학과 방향에 대한 중요한 통찰을 제공함으로써 MT 네트워크 연구 능력을 크게 향상시켰습니다. 이전 연구들은 플러스 엔드 마커^{14, 15, 16}의 라이브 영상을 사용하여 난자에서 MT 성장 역학을 성공적으로 분석했습니다. 그러나 많은 경우 MT 역학을 정량화하는 데 사용되는 이미지 분석 절차는 간략히 설명되거나, 맞춤형 또는 실험실별 구현에 의존하거나, 공개되지 않아 재현성과 광범위한 채택이 제한됩니다. 우리 방법은 이전 접근법을 기반으로 완전히 문서화되고 공개되어 있으며 사용자 친화적인 분석 파이프라인을 제공하여 데이터셋과 실험 조건 전반에 걸쳐 MT 성장 매개변수를 표준화할 수 있게 합니다. 이 프로토콜에서는 MT 역학을 중간 난자 발생 단계에서 영상화하는데, 이는 MT 세포골격이 중심체 MT 네트워크에 의해 조직되는 과정입니다. 성장 중인 MT는 MT 플러스 엔드 추적 단백질인 EB1-GFP를 사용해 시각화되며^, 고속 모드의 배열 검출기를 이용한 레이저 주사 공초점 현미경으로 획득됩니다. 우리 접근법의 새로움은 이미지 분석에 있습니다: 사용자가 관심 있는 영역만 선택하면 되는 완전 문서화되고 사용자 친화적인 단계별 파이프라인입니다. 이미지 처리 및 정량화는 맞춤형 피지 매크로와 Python 스크립트를 통해 가능하며, EB1 혜성의 효율적이고 재현 가능한 탐지와 성장 방향, 속도, 공간 구성 등 매개변수 추출이 가능합니다. 이 프레임워크는 실험 조건 간 MT 역학을 비교할 수 있는 표준화되고 접근 가능한 도구를 제공합니다.

본 논문에서는 이 방법을 적용하여 대조군 난자와 냉처리로 탈중합된 난자에서 MT의 성장을 비교합니다. 이는 프로토콜의 검증과 MT에서 후보 단백질의 역할을 해부하는 향후 연구를 지원하는 데 기여합니다.

Protocol

1. 파리 유전학

참고: 난자 내 MT를 시각화하기 위해 이 프로토콜은 공개된 형질전환유전자(Table of Materials)를 사용하여 MT 플러스 엔드 추적 단백질 EB1을 발현하고 GFP(녹색 형광 단백질) 태그¹⁹로 표시합니다. EB1-GFP는 성장하는 MT와 끝에 특이적으로 결합하며, 중합 방향을 따라 움직이는 형광 '혜성' 형태로 나타납니다^17,18. 이를 통해 난자 내 성장 방향, 속도, 공간 분포 등 MT 성장 역학을 시각화하고 정량화할 수 ^{있습니다.}

1. 모든 파리 품종은 표준 초 파리 사육 기법을 사용하여 25°C의 옥수수 가루-한천 배지에서 유지하세요.
2. UAS-RNAi 형질유전자를 가진 처녀 암컷 8–12마리를 교배하여 관심 단백질 발현을 표적으로 하는 5마리의 수컷 matα4-Gal4-VP16; EB1-GFP.
   참고: 유전적 교배를 단순화하기 위해, V32-Gal4 선(두 번째 염색체 삽입)과 EB1-GFP 선(세 번째 염색체 삽입)을 교차하여 파리 조직을 생성한다. EB1-GFP는 UASp 프로모터의 제어 하에 있기 때문에, V32-Gal4 드라이버는 EB1-GFP뿐만 아니라 원한다면 이후 교배에서 도입된 모든 UAS-RNAi 형질전환유전자의 발현을 유도합니다.
3. F1 자손(새끼) 부화 후, 원하는 유전자형(생후 1주일 미만)의 암컷 파리 10–15마리를 선택합니다.
4. 암컷과 2–3마리의 수컷을 먹이 표면에 소량의 효모 페이스트가 있는 신선한 바이알로 옮깁니다. 효모 페이스트는 난자 형성을 촉진하고 난자 방 발달을 촉진합니다. 수컷의 존재는 교미를 보장하며, 이는 난자 성숙과 산란을 촉진합니다. 플라이를 25°C에서 2일간 유지하세요.
   참고: MT 역학에서 특정 유전자의 역할을 조사하기 위해, UAS/GAL4 시스템²¹을 사용하여 단백질 녹다운을 달성할 수 있으며, 공개된 모체 구동체인 matα4-Gal4-VP16(V32-Gal4로도 알려짐)을 사용할 수 있습니다. 이 문서는 난형성 3–4 상태에서 생식계 내에서 Gal4 발현을 시작합니다. 앞서 설명한 바와 같이, 이 구동체는 EB1-GFP와 UAS-RNAi 구성체의 발현을 유도하여 게르마륨 단계 이후에야 관심 단백질의 고갈을 가능하게 합니다. 이 전략은 초기 유사분열 및 난자 특정화 과정에서 표적 단백질의 초기 기능을 우회합니다. 이러한 실험을 수행할 때는 앞서 설명한 대로 파리를 준비해야 합니다.

2. 난소 박리

1. 표준 플라이 패드에서 CO₂를 사용해 F1 암컷을 마취시키고, 한 명의 암컷을 선별해 해부합니다.
2. 선택한 암컷을 35mm 유리 바닥 접시(두께 0.13–0.15mm)에 직접 옮기고, 플라이 위에 이미지 오일 한 방울을 떨어뜨립니다.
3. 파리를 배 쪽이 위로 향하게 위치시키고(날개는 아래를 향하게 하세요). 핀셋 한 쌍으로 하부 가슴을 부드럽게 잡고, 두 번째 핀셋으로 복부 뒤쪽 끝에서 약간의 부위 큐티클을 집어 넣습니다.
4. 조심스럽게 생식기관을 구멍으로 빼내어 부드럽게 빼내세요.
5. 난소를 분리한 후 핀셋으로 오일 속에 부드럽게 밀어 넣어 난소를 분리하세요. 난소를 조작할 때는 영상 촬영에서 관심 대상인 더 취약한 중간 단계(6–9단계)를 손상시키지 않도록 난소를 항상 오래된 난자 방(13–14단계) 옆에 붙잡아 두어야 합니다(그림 1A, B).
6. 난소의 앞쪽 끝을 잡으세요. 여기에는 게르마리움과 초기 난자 방이 위치해 있습니다(그림 1A, B). 개별 난소를 분리하기 위해 천천히, 꾸준히 장력을 가하세요. 당기면서 다양한 발달 단계의 난자 방이 나타날 것입니다. 이 과정은 난소당 여러 번 반복하여 추가 난소를 분리할 수^{있습니다(시} 연은 영상 참조).
   참고: MT를 중합하기 위해 냉처리를 한 난자에 대해서는 앞서 설명한 대로 해부가 수행되었으나, 영상용 오일 대신 BRB-80 버퍼를 사용하였습니다. 해부된 난소는 BRB-80이 포함된 마이크로튜브로 옮겨져 얼음 위에서 15분²³분간 배양되었습니다. 인큐베이션 후, 난소를 영상 오일이 있는 유리 바닥 접시로 옮기고, 프로토콜은 3.1단계부터 재개되었습니다.

3. 실시간 영상

1. 유리 바닥 접시를 적절한 슬라이드 홀더를 사용해 현미경 스테이지에 올려놓으세요.
2. 영상 촬영을 위해 7단계 또는 8단계 난자 챔버를 선택하세요.
   참고: 이 단계의 난자 방은 난자 크기와 핵 위치를 바탕으로 식별할 수 있습니다. 난자세포는 개별 간호 세포보다 분명히 크며, 난자 방의 약 3분의 1(7단계)에서 절반(8단계)을 차지합니다. 난자 핵은 난자의 전쪽 피질, 간호 세포²⁴ 옆에 위치해 있습니다.
3. 외부 난포 세포층에 불연속성이 있거나 기계적 손상을 나타내는 난자 상자의 영상 촬영은 피해야 합니다. 최적의 이미지 품질을 위해서는 63배 대물렌즈(1.40 NA, 오일 침지)를 가진 신호 대 잡음비(SNR)의 고속 공초점 영상 시스템을 사용하세요. 나이퀴스트-섀넌 샘플링 기준을 반드시 준수하고 있는지 확인하세요.
4. 초점을 조절하고 적절한 노출을 결정하는데, 이는 사용되는 EB1 구조(예: 다른 프로모터나 형광 태그)와 현미경 시스템에 따라 다를 수 있습니다. 신호는 혜성 역학을 추적할 만큼 밝아야 하지만, 배경 형광에 의해 포화되거나 가려지지 않아야 합니다.
5. 488 nm 레이저를 GFP 형광체(10% 레이저 출력; 검출기 이득 = 750 V)를 여기하도록 설정하세요. GFP 형광포체에 적합한 500–550 nm 발광 창 또는 이에 상응하는 필터 세트를 선택하세요.
6. 최소 4분 길이의 타임랩스 영화를 500ms(2프레임/초)의 프레임 간격으로 확보하여 개별 MT 및 종료 지점을 추적할 충분한 데이터를 확보합니다. (보조 영상 1은 후속 MT 추적 분석에 적합한 대표적인 타임랩스 획득 사례를 보여줍니다.)
7. 기본 처리 필터 강도를 적용한 현미경 획득 소프트웨어의 배열 검출기 처리를 사용하여 획득한 이미지를 처리합니다.
   참고: 영상 오일에 담근 후 해리된 난소는 최대 90분간 생존 상태를 유지합니다. 이 기간 동안 난자 방은 뚜렷한 퇴행 징후 없이 촬영할 수 있습니다. 이 기간 후 새로운 암컷을 해부하고, 신선한 난자실을 준비^{하여 영상 촬영}을 해야 합니다.

4. 이미지 처리

다음 워크플로우를 수행하여 MT 역학과 관련된 다양한 매개변수를 정량화하기 위해 그래프와 통계를 생성하세요. 매크로/스크립트를 통해 자동으로 또는 프로토콜(그림 2)을 따라 수동으로 모든 단계를 실행하세요. 이 워크플로우에서 사용되는 모든 피지 매크로, 추적 스크립트, Python 분석 코드는 보조 코딩 파일 1–7로 제공됩니다.

1. 이미지 전처리 - 1단계
   다음 단계들은 광표백을 보정하고 배경 잡음을 줄여 추적 시 신호 안정성을 보장함으로써 원시 타임랩스 이미지를 준비합니다. 첫째, EB1 가시성은 공간적 밴드패스 필터 역할을 하는 가우시안 차이(DoG) 필터를 사용하여 강화됩니다. 이 과정은 약간 흐릿한 이미지에서 심하게 흐릿한 이미지를 빼면서, 저주파 세포질 헤이즈와 고주파 픽셀 노이즈를 억제하면서 EB1 혜성의 회절 제한 신호를 분리합니다. 둘째, 시간 구배 필터를 적용하여 성장하는 MT 팁을 특별히 강화합니다. 이미지 스택은 시간 차원을 공간 Y축에 매핑하기 위해 재슬라이싱됩니다. 그 후 [-1 0 1] 핵을 가진 1차원 합성곱을 적용하여 각 픽셀의 시간 미분을 계산하며, 이동하는 혜성의 선행 가장자리가 가장 빠르게 증가하는 부분을 강조합니다. 그 후 스택은 원래 크기로 다시 슬라이싱되어 합성 이미지로 병합된 후 분석을 위해 내보냅니다.
   참고: 이 단계는 매크로 파일 File1.Step1_MTs_macro.ijm (보조 코딩 파일 1) 피지로 진입하여 매크로를 운영합니다.
   1. 필수 플러그인 설치 (일회성 설정)
      1. 피지를 출시하세요. 메뉴 바에서 플러그인 > 설치 로 이동하세요.
      2. 파일 브라우저에서 이 프로토콜에 포함된 File_7_Kalman_Stack_Filter_Compiled.jar (보조 코딩 파일 7) 파일을 선택하세요.
      3. 플러그인 저장 요청이 나오면, 목적지가 피지 설치 디렉터리 내 기본 플러그인 폴더인지 확인하고 저장을 클릭하세요.
      4. 설치를 완료하려면 피지를 재시작하세요.
         참고: 이 컴파일된 플러그인 버전은 피지 내장 버전과 동일하지만, 별도의 자바 개발 키트(JDK) 설치가 필요 없어 설정 과정을 간소화했습니다.
   2. 표백제 교정 및 노이즈 제거:
      1. 피지를 열고, Bio-Formats 임포터 플러그인으로 각 파일을 엽니다
      2. Simple-Ratio 표백 보정(배경 = 0)을 사용하여 표백 보정 플러그인을 실행하여 시간에 따른 형광 감쇠를 보정합니다.
      3. 칼만 스택 필터 컴파일드(acquisition_noise = 0.1; 바이어스 = 0.7)를 실행하여 무작위 광자 잡음을 억제하고 시간에 따른 진정한 신호 역학을 유지하세요
      4. 원한다면 결과 이미지 시간 크기를 잘라서 처리 시간을 줄일 수 있습니다.
         참고: 이 단계들은 디노이즈 이미지를 생성하며, 이후 1단계 끝(4.1.5)에서 채널 1로 나타납니다(그림 3A). 칼만 필터의 롤링 윈도우가 이 초기 프레임들을 부분적으로만 필터링하므로 처음 5에서 10프레임(타임포인트)은 제외하는 것이 권장됩니다.
   3. 가우시안(DoG)의 특징 향상 차이점:
      1. 4.1.2.4 버전의 이미지를 두 번 복제하세요(이미지를 우클릭한 후 복제 클릭).
      2. 가우시안 블러 플러그인을 한 사본에 저 시그마(σ = 1)로 적용하세요.
      3. 다른 사본에는 하이 시그마(σ = 8)를 사용해 가우시안 블러 플러그인을 적용하세요.
      4. 이미지 계산기 플러그인을 열고 로우 시그마 이미지에서 하이 시그마 이미지를 빼서 (= Low – High) 세부사항을 분리하세요.
      5. 배경을 제거하려면 피지의 Math > Detract를 사용해 값(DoG 임계값 = 100)을 선택해 실제 신호만 유지하세요.
         참고: 이 단계들은 가우시안 차분 이미지를 생성하며, 이는 이후 1단계 끝(4.1.5)에서 채널 2로 나타납니다(그림 3B).
   4. EB1-GFP 신호 증강:
      1. 4.1.2.4에서 이미지를 선택하고 Reslice 플러그인을 사용하세요: 상단, 보간 없음.
      2. 커널 [–1 0 1]의 Convolve 2D 플러그인을 사용해 MT 팁을 강화하세요.
      3. 같은 설정으로 Reslice 플러그인을 다시 사용해 원본 이미지 크기를 복원하세요.
      4. 참고: 이 단계들은 향상된 EB1-GFP 신호를 가진 이미지를 생성합니다. 이 이미지는 이후 1단계 끝(4.1.5) 끝에 채널 3으로 나타납니다(그림 3C).
      5. 채널 병합 및 이미지 내보내기:
         1. Merge Channels 플러그인을 사용해 MT EB1-GFP 이미지(4.1.2.4)와 가우시안 차이 이미지(4.1.3.5), 그리고 EB1-GFP 신호 향상 이미지(4.1.4.3)를 병합하세요. 합병 과정에서 추가 분석에 사용할 이미지가 채널 3에 배치되도록 하세요.
         2. 결과 파일을 .tif 파일로 저장하고, 명명 형식인 "filename"_processed.tif을 사용합니다. 하위 분석에 사용되는 이미지가 _processed.tif로 끝나도록 하세요
2. 관심 영역(ROI) - 2단계
   이 단계에서는 난자의 전후축을 따라 세 가지 ROI를 정의합니다: 전방(ROI1), 중간(ROI2), 후방(ROI3). 이 공간적 분할을 수행하면 난자의 다양한 영역에 걸친 MT 역학 분석을 할 수 있습니다.
   참고: 이 2단계는 매크로 파일 _processed.tif File_2_Step2_MTs_macro.ijm(보조 코딩 파일 2)을 피지로 드래그하여 실행하여 각 "파일명"에 대해 실행할 수 있습니다. 매크로는 사용자가 난자에 직사각형을 수동으로 그리도록 안내합니다. 폴리곤의 시작점(첫 클릭)에 가장 가까운 영역이 첫 번째 ROI에 해당합니다. 선택한 직사각형 영역은 자동으로 동일한 직사각형 ROI로 나뉩니다. 만약 ROI가 저장되지 않았다면, 다음 단계는 전체 이미지에서 실행됩니다.
   1. ROI의 정의:
      1. 플러그인 → 바이오 포맷 → 바이오 포맷 임포터를 통해 대상 파일을 엽니다.
      2. 폴리곤 도구를 사용해 원하는 지역을 가로지르는 관심 영역을 그려보세요.
      3. 선택한 지역을 ROI 매니저에 추가하세요(T 키를 누르세요).
      4. 필요한 ROI를 4.2.1 단계를 반복하세요.
   2. 측정 및 수출 면적:
      1. 첫 번째 ROI를 선택하세요
      2. Analyze → Measure를 실행하고, Area 값을 "filename"이라는 파일로 저장하세요_processed_RoiArea.csv
         참고: 파일 이름은 원본 이미지 이름과 일치해야 하며, 끝에는 다음으로 _processed_RoiArea.csv
      3. ROI Manager를 사용해 ROI를 저장하세요. 같은 파일명을 사용하세요. 단일 ROI에 대한 ROI 연장, 또는 여러 ROI에 대한 .zip 연장입니다.
3. EB1-GFP 혜성 탐지 및 추적 - 3단계
   TrackMate 플러그인²⁵ 를 사용해 EB1-GFP 혜성을 감지하고 시간에 따른 이동을 추적하세요.
   참고: 매크로 파일 _processed.tif File_3_Step3_MTs_macro_tracking.py(보조 코딩 파일 3)를 피지로 드래그하여 RUN을 눌러 각 "파일명"에 3단계를 적용할 수 있습니다. 그 다음 처리할 폴더를 선택하세요. ROI는 자동으로 로드되며, 각 파일에 대해 분석이 수행되어 해당 스팟 및 트랙 출력이 생성됩니다. 배치 처리 전에 2–3장의 대표 이미지를 분석하여 기본 검출기와 추적기 설정이 혜성의 크기와 역학에 적합한지 시각적으로 검증하는 것이 권장됩니다. 설정이 적절하다면 사용자는 관련 매개변수를 조정하여 EB1 팁을 정확히 추적할 수 있어 오음성과 오탐을 최소화할 수 있습니다.
   1. Plugins → Bio-Formats → Bio-Formats Importer를 통해 대상 파일을 엽니다
   2. TrackMate 플러그인을 열어보세요. T와 Z를 교환하라는 요청 시 YES를 선택하세요.
   3. 로그 감지기를 선택하세요. 입자 직경을 0.5 μm으로 설정하세요 (필요에 따라 조정)
   4. 품질 임계값을 30으로 설정하세요(필요에 따라 조정). 중간 필터를 사용해 서브픽셀 로컬라이제이션과 프리처리를 모두 활성화하세요.
   5. 추가적인 스팟 필터링은 제거하세요. 칼만 추적 방법 선택
   6. 초기 탐색 반경을 0.5, 탐색 반경을 0.7, 최대 프레임 간격을 2로 설정하세요(필요에 따라 조정 - 초기 탐색 반경 은 트래커를 시딩하고, 탐색 반경 은 프레임 간 이동 거리를 조절하며, 최대 프레임 간격 은 궤적에서 짧은 사라짐을 허용합니다).
   7. 나타날 트랙 필터링은 건너뛰세요. 트랙이 완성되면 Spots → CSV 내보내기에서 파일 이름을 "filename"으로 설정하세요_ROI01_spots.csv
   8. 참고: 파일 명칭은 분석된 ROI 수를 반영해야 합니다. 여러 ROI를 사용하는 경우, 각 출력 파일을 _ROI01, _ROI02 등과 같은 해당 식별자와 함께 저장하세요.
4. 데이터 시각화 및 정량적 분석 - 4단계
   Python 스크립트를 사용해 추적 데이터를 처리하고 혜성 수, 속도, 수명, 각도 일관성, 방향 등 주요 매개변수를 계산하세요. 이 스크립트들은 요약표(CSV 파일), 그래프, 통계 분석을 생성하여 MT 역학의 정량적 분석을 지원합니다(그림 4).
   1. 소프트웨어 환경 설정:
      1. Python (3.12) 배포판을 설치하세요. 다음 외부 Python 라이브러리가 설치되어 있는지 확인하세요( pip install pandas numpy scipy matplotlib seaborn ipython statsmodels 노트북을 통해): Pandas 및 NumPy (데이터 구조 처리 및 수치 계산용), SciPy 및 Statsmodels (특히 scipy.stats, 순환 통계 및 가설 검정용), Matplotlib 와 Seaborn (장미 그래프 및 통계 막대 차트 생성용), IPython (노트북 내 디스플레이 도구용), Jupyter 노트북 (노트북 사용용).
      2. 사용자 지정 분석 모듈(File_5_MTModule1.py 및 File_6_MTModule2.py – 보조 코딩 파일 5와 6)을 분석 노트북(파일 4_Step4_MTs_results.ipynb – 보조 코딩 파일 4) 옆 루트 디렉터리에 배치하세요.
      3. Python 터미널에서 "jupyter notebook" 명령어를 실행하여 Jupyter 노트북을 열고 파일 4_Step4_MTs_results.ipynb – 보조 코딩 파일 4 노트북을 불러오세요.
   2. 입력 데이터 및 매개변수 정의:
      1. 생물학적 복제를 실험 메타데이터에 매핑하기 위해 데이터베이스를 채우세요.
      2. 각 실험마다 다음과 같이 제공하세요: 기본 이름: 파일명에 포함된 고유 식별자 문자열, 조건: 실험 그룹(예: "대조군", "처리됨"), 보정 각도: ROI를 생물학적 축과 일치시키는 데 필요한 각도(예: 전방 = 0°).
      3. 매개변수 조정: 이미지 포맷과 dpi 내보내기, 색상 플롯, 각도 계산용 기본 빈 크기
      4. 데이터 필터링 매개변수를 설정하여 짧은 트랙을 제외하세요: 최소 트랙 길이: 이 길이보다 짧은 트랙은 버려집니다
   3. 분석 파이프라인 실행:
      1. 모든 코드 셀을 읽고 실행하여 원시 추적 데이터를 처리합니다. 스크립트는 데이터베이스 목록을 반복하여 다음과 같은 절차적 단계를 수행합니다:
         1. 각 기지 이름과 연관된 모든 ROI 전용 CSV 파일을 식별하세요.
         2. 최소 길이를 기준으로 한 필터 트랙(3프레임 이상 지속되는 궤적만 유지), 순간 속도를 계산하고, 총 변위를 계산하며, 기준 각도 보정을 모든 궤적에 적용합니다.
         3. 혜성 개수를 ROI 면적(메타데이터에서 로드)으로 정규화하여 혜성 밀도를 계산합니다.
      2. 처리된 데이터를 마스터 데이터셋(df_all)으로 집계하고, 각 ROI에 대해 평균 속도, 트랙 지속 시간, 각도 일관성 벡터 길이 등 일반 요약 통계를 계산합니다.
      3. make_combined_rose_panel 함수를 실행하여 그룹화된 장미밭을 생성합니다. 이로 인해 각 실험 조건 내 모든 ROI의 각도 분포를 나란히 비교할 수 있습니다. 스칼라 지표를 위한 막대 차트를 만들기 위해 create_comprehensive_analysis_plots_enhanced 실행하세요.
      4. 특정 방향 분석을 수행하기 위해 run_angle_analysis_pipeline 함수를 실행하세요:
         1. 트랙을 두 가지 전략으로 방향 빈으로 분류합니다: 카디널 빈닝(90° 너비의 4개 빈: 북쪽/전방, 동쪽/오른쪽, 남쪽/후방, 서쪽/왼쪽)과 앞/뒤쪽 빈(180° 전방 대 후방 2개 빈).
         2. 난자당 각 정의된 방향에서 움직이는 트랙의 비율을 계산하세요.
   4. 통계 분석 및 산출물 생성:
      1. 정의된 스칼라 지표들을 반복 계산하세요: 프레임당 평균 혜성 수, 평균 혜성 궤도 지속 시간, 평균 혜성 속도. 각 지표에 대해 다음과 같은 성능을 수행합니다:
         1. 실험 조건 간 독립적인 비교를 위해 Kruskal-Wallis 또는 Mann-Whitney U 검정을 수행하세요.
         2. ROI 전반의 일관성을 평가하기 위해 프리드먼 또는 윌콕슨 테스트를 수행하세요.
         3. 각 ROI 내에서 방향 선호도(예: 북쪽 대 남쪽)를 평가하기 위해 프랫 방법을 사용하여 프리드먼 및 윌콕슨 서명 순위 검정을 수행한다.
         4. 다음 결과를 결과 디렉터리로 내보내세요: 요약 CSV(metrics_table.csv, track_table.csv, roi_metrics.csv), 통계 보고서(예: 평균 혜성 velocity_mwu.csv), 그리고 플롯(고해상도 PNG 파일).
            참고: 4단계는 오직 Python에서만 실행할 수 있습니다. File_4_Step4_MTs_results.ipynb를 열고 모든 셀을 읽고 실행하세요. 각 셀에는 실행 명령어와 예상되는 결과가 포함되어 있습니다.

5. 통계 분석:

참고: 추적 데이터의 비가우스 분포로 인해 모든 비교에 대해 비모수 통계 검정이 사용되었습니다.

1. Mann-Whitney U 검정(두 그룹) 또는 Kruskal-Wallis 검정 후 사후 Mann-Whitney 비교(>2개 그룹)를 사용하여 실험 조건(예: 대조군 대 치료군) 간 독립적인 차이를 평가합니다.
2. 동일한 ROI 내에서 프리드먼 검정(전역 차이)과 윌콕슨 부호-순위 검정(쌍 단위)을 사용하여 지향적 선호도를 평가합니다.
3. 차이가 0인 동점은 Pratt 방법을 사용해 처리하세요.
4. 통계적 검정력을 보존하기 위해 쌍별 비교는 보정되지 않은 p-값으로 보고합니다. 제공된 스크립트를 사용해 원시 및 조정된 p-값을 모두 보고하며, 중요도는 0.05로 설정됩니다. 별도의 언급이 없는 한 모든 요약 통계는 평균 ± 표준오차(SEM)로 보고하세요.

Results

이 프로토콜은 EB1-GFP라는 활성 MT 중합 부위를 표시하는 추가 추적 단백질을 사용하여 난자 형성 중기 단계에서 초파리 멜라노가스터 난모세포의 MT 성장 역학과 극성을 성공적으로 분석하는 데 성공했다^17,18. 레이저 주사 공초점 현미경으로 영상화할 때, EB1-GFP는 밝고 점이 있는 '혜성'처럼 나타나며, MT 성장 방향에 따라 움직이는^17,18(그림 3A; 보조 영상 1). 이 혜성들을 추적하고 정량화함으로써 난자 내 MT 핵생성, 신장 및 조직을 정밀하게 평가할 수 있습니다. 이 워크플로우 프로토콜을 사용하여 대조군 난자와 MT 네트워크의 실험적 교란을 받은 난자에서 MT 역학을 평가하였습니다. 구체적으로, EB1 혜성 행동은 세 가지 조건에서 비교되었다: 처리되지 않은 대조군 난자, 냉처리된 대조군 난자, 냉처리된 이형접합 p아트로닌 돌연변이 난자구(^12,26). 냉처리는 MT 탈중합을 유도하여 회복 중 MT 재성장 평가를 가능하게 합니다. 이형접합 p아트로닌 돌연변이체(+/patr⁰⁵²⁵²) 난자를 MT 역학 장애에 대한 양성 대조군으로 포함하였다. Patronin은 보존된 MT -말단 안정제인²⁷이며, 난자¹² 및^{기타 조직에서} ncMTOCs의 핵심 구성 요소입니다. 이전 연구들은 MT 탈중합을 받은 파트로닌 돌연변이체가 재생 후 EB1 혜성 수가 유의미하게 감소하는 것을 보여주^었다. 따라서 이형접합 파트로닌 돌연변이를 포함함으로써 알려진 MT 재성장 결함 배경에 대해 이 방법을 검증할 수 있었습니다. 중심체가 감약되고 MT가 아센트로좀 경로를 통해 생성되는 7-8단계 난모세포를 영상화하였습니다.

이전 관측과 일치하게, EB1 혜성의 가장 높은 밀도는 난모세포 전방 영역에서 발견되었으며, 후방으로 갈수록 점차 감소^했다(그림 5B; 표 1; 보조표 1과 2). 진정한 MT 중합 사건과 정지 또는 평면 외 신호를 구분하기 위해, 이 프로토콜은 검출된 EB1-GFP 초점의 총 수와 운동성 초점의 하위 집합을 구별합니다. 움직이지 않는 부분은 정지하는 혜성 또는 주로 축 평면을 따라 움직이는 혜성을 나타내는 것으로 보인다(그림 5A,B). MT 궤도 길이와 성장 속도 분석은 이동 중인 EB1-GFP 혜성에만 대해, 궤도 길이와 속도 추정에 방해가 될 수 있는 정지 신호나 축 이동을 피하려 했습니다. 전체 EB1-GFP 초점과 운동성 분율은 전체 검출과 동적 행동을 직접 비교할 수 있도록 별도의 그래프로 제시되어 있습니다(그림 5A, B). 대조군 난자세포에서는 전부 영역에서 0.189 ± 0.02 SEM EB1 운동성 혜성/μm²(18.9 EB1 혜성/100 μm²)를 측정했으며, 중간 및 후방 영역에서는 각각 0.064 ± 0.02 SEM EB1 운동성 혜성/0.043 ± 0.043 SEM EB1 운동성 혜성/μm²를 측정했습니다(6.4 및 4.3 EB1 혜성/100 μm²)(그림 5B; 표 1; 보조표 1과 2). 같은 발달 단계의 EB1 혜성²⁸개를 측정한 이전 연구에서는 100μm^²당 48.54개의 EB1 혜성을 검출했으며, 이는 운동성 EB1-GFP 혜성에서 관찰된 값보다 높은 수치입니다. 그러나 측정된 값은 검출된 EB1-GFP 혜성 총 수를 고려하면 일관됩니다(그림 5A; 표 1; 보조표 1과 2). 그 연구의 재료 및 방법 섹션에서는 난자 영상을 찍기 위해 몇 개의 z-스택을 사용했는지는 명시되어 있지 않습니다. 따라서 분석에 여러 개의 z-스택이 포함되었을 가능성이 있으며, 이는 EB1-GFP 혜성 검출 증가에 기여했을 수 있습니다. 보고된 값에 영향을 줄 수 있는 또 다른 요인은 혜성 정량화를 위해 선택된 난자 영역입니다. 관심 지역이 EB1 혜성 밀도가 가장 높은 가장 앞쪽 극에 더 가깝게 선택되었다면, 여기 제시된 측정값보다 평균 혜성 밀도가 증가할 수 있었을 것입니다. 그럼에도 불구하고, 여기서 얻어진 결과는 동일한 규모이며, 앞서 보고된^14,15와 마찬가지로 EB1 혜성 밀도가 후방 지역으로 감소한 것을 일관되게 반영합니다.

냉기로 인한 MT 재성장 후, 대조군 난자세포는 비처리 대조군과 유사한 EB1 혜성 수치를 보여 견고한 MT 회복을 나타냈다. 반면, 이전 보고서들과 일치하는¹², 파트로닌 돌연변이체는 두 대조군에 비해 전방 영역에서 운동성 EB1 혜성(ROI1)의 수가 유의미하게 감소한 것으로 나타났습니다(그림 5B; 표 1; 보조표 1과 2). 중간 및 후방 영역(ROI 2, 3)의 혜성 수도 감소 추세였으나, 이러한 차이는 통계적으로 유의미하지 않았습니다(그림 5B). 여기서 관찰된 감소는 노코다졸 기반 검사¹²에서 보고된 것보다 덜 심각했습니다. 이는 단일 대립유전자만 돌연변이되는 이형접합 패트로닌 돌연변이를 사용하는 것을 반영하는 것으로 보입니다. 또한, 냉 유도 탈중합 프로토콜은 모든 MT를 완전히 분해하지 않을 수 있으며, 얼음에서 제거와 영상 사이에 5–15분 간격이 있어 데이터 수집 전에 MT의 핵생성과 재성장이 일부 가능할 가능성이 높습니다. 반면, 노코다졸 기반 분석은 현미경 UV 레이저¹²를 이용해 콜세미드 비활성화 직후 즉시 수행됩니다. 그럼에도 불구하고, 이 결과들은 이 프로토콜이 생물학적으로 관련된, 영역별 MT 조직 변화를 감지할 수 있음을 보여줍니다. 또한 난자 앞쪽에 위치한 ncMTOCs와 핵심 ncMTOC 구성 요소인 Patronin의 농축과도 일치합니다. 중간과 후쪽 영역에서 혜성 개체 수가 약해진 것도 이 단계에서 ncMTOCs와 Patronin이 후피질에서 배제된 발달 요인을 반영할 수^{있습니다.}

대조군 난모세포에서 EB1 궤적 길이 분석에서 난자 앞쪽 영역에는 더 긴 혜성 궤도(0.613 μm ± 0.04 SEM)가 있고, 중후쪽 영역에는 더 짧은 혜성(각각 0.463 μm ± 0.04 SEM 및 0.488 μm ± 0.05 SEM)이 나타났다(그림 5C; 표 1; 보조표 1과 2). 이 결과는 MT가 후극에서 전극보다 더 짧게 지속된다는 이전 데이터와 일치하며, 후극의 MT^{가 더 짧}다는 것을 시사한다. 냉처리된 이형접합 파트로닌 돌연변이 난자에서 전자혜성 길이는 냉처리된 대조군에 비해 전부 및 후방 영역에서 유의하게 감소하였습니다. 중간 지역에서도 유사한 통계적으로 유의미하지 않은 추세가 관찰되었습니다(그림 5C; 표 1; 보충 표 1과 2), 이는 MT 안정성의 부분적 감소를 시사합니다. 종합하여 이 결과들은 패트로닌이 마이너스 엔드 MT 안정제로서 알려진 역할을 지지하며, 파리가 손실되면 MT 방추가 짧아지는 초파리 배양 세포에서의 이전 관찰과도 일치한다^12,27. 이 발견들은 또한 MT 역학에서 미묘하지만 생물학적으로 의미 있는 교란을 감지하는 데 있어 이 프로토콜의 민감도를 강조합니다.

대조 난자에서 EB1 혜성 속도를 측정할 때, 분석은 전부, 중간, 후방 영역에서 각각 0.208 ± 0.01 μm/sec, 0.207 ±± 0.01 μm/sec의 평균 속도를 검출했습니다(그림 5D; 표 1; 보충표 1과 2), 이는 이전 연구^14,15와 일치한다. 대조군 난모세포는 전방에서 후방으로 이동하는 MT 성장 속도가 약간 감소하는 모습을 보였습니다. 이는 전외측 영역에서 ncMTOCs와 잠재적으로 다른 미확인 미세소관 관련 단백질(MAPs)의 농축을 반영할 수 있으며, 이들은 MT의 성장과 확장을 촉진하여 관찰된 후방 감소에 기여합니다. 냉처리된 난자에서 파트로닌 이형접합 돌연변이체는 대조군에 비해 MT 성장 속도가 약간 감소하는 경향을 보였으나, 이 차이는 통계적 유의성에 이르지는 못했습니다(그림 5D; 표 1; 보조표 1과 2). 이 발견은 파리 신경줄기세포에서 파로닌 돌연^변이를 발현하는 이전 관찰과 일치합니다.

ncMTOCs가 난자의 전외측 영역에 위치하고 후방에서 제외되면, 대부분의 MT는 마이너스 끝이 전외측 피질에 고정된 상태로 성장하게 됩니다. 따라서 난자 내에서 전후방향 구배가 형성되며, 이는 적은 방향 편향을 가집니다: 60%가 후쪽으로, 40%가 전방¹⁴로 성장합니다. 우리 프로토콜은 난자 내 모든 영역에서 대조군 난모세포의 편향을 성공적으로 감지했습니다(그림 5E). MT 방향의 편향은 앞서 보고된 대로 후쪽 영역에서 더 두드러졌으며,¹⁴. 특히, 이 후방 방향 편향은 대조군과 이형접합 파트로닌 돌연변이 난자에서 냉처리 후 사라졌다(그림 5E,F). 냉처리된 대조군 난모세포에서는 모든 영역에서 MT의 방향이 전방 방향으로 이동했다. 이 변화는 전방과 중간 부위에서 추세로 나타났고, 후방 부위에서는 통계적으로 유의미하게 나타났다(그림 5F). 후쪽 쪽 편향이 감소하는 한 가지 가능한 설명은, 냉간 처리 조건에서 새로 중합된 MT가 모터 단백질과 같은 MAP와 결합하는 데 시간이 걸릴 수 있기 때문이며, 이는 MT 안정화 및/또는 가교결합을 촉진합니다. 이러한 요인들의 지연 모집은 후방 지향 MT의 강화를 저해할 수 있습니다. 요약하자면, 이 프로토콜은 난자 내 MT 성장, 길이, 속도, 방향에 대한 민감하고 정량적인 분석을 가능하게 합니다. 이전 연구와 일치하여 영역별 생물학적으로 의미 있는 MT 역학 변화를 신뢰성 있게 감지하며, 이형접합 p아트로닌 돌연변이체에서 관찰된 것처럼 MT 행동의 미묘한 차이를 해소하는 민감도를 보여줍니다.

그림 1: 초파리 멜라노가스터 난소 난소 난자 발생 개요. 각 난소에는 12–16개의 난소가 있으며, 이들은 난자 생산 라인 역할을 합니다. 난자 발생은 생식세포에서 시작되며, 2–3개의 생식선 줄기세포가 비대칭적으로 분열하여 줄기세포와 딸세포를 생성하고, 딸세포가 분화를 시작합니다. 이 세포들은 4회의 유사분열을 거쳐 16세포로 이루어진 낭종을 형성하며, 고리관으로 연결됩니다. 이 세포들로부터 한 세포가 난자가 되고, 나머지는 간호 세포로서 난자의 성장과 발달을 지원하여 후방 끝에서 14단계 난자에 도달합니다. (B) 9단계 초파리 알 방 도면. MT는 난자¹²의 후쪽에서는 제외되는 전측 외측 피질에 국한된 ncMTOCs에서 생성됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 2: 프로토콜 워크플로우 다이어그램. 난소 박리와 실시간 영상 촬영부터 혜성 추적 및 정량 분석에 이르는 주요 단계에 대한 개요. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 3: 7–8단계 난자 처리로 생성된 대표 이미지. (A-E) 대조군, 대조군 냉처리된 난자, 이형접합 파트로닌⁰⁵²⁵² 의 7–8기 난자에 적용된 1단계의 이미지 처리 워크플로우를 대표하는 이미지입니다. 채널은 150프레임 타임랩스 영화에서 최대 2프레임 투사를 대표하는 이미지로, 프레임당 0.5초로 획득됩니다. (A) 채널 1은 해당 영상화된 난자로부터 잡음 제거 이미지를 생성하는 데 해당합니다. (B) 채널 2는 가우시안 이미지의 차분 생성에 해당합니다. (C) 채널 3은 EB1-GFP 혜성 신호가 증폭되어 혜성의 끝을 보여주는 이미지를 생성하는 데 해당합니다. (D) 채널 2와 3의 합병, 채널 2 처리 과정에서 생성된 혜성 팁을 시각화하는 데 도움이 됩니다. (E) 타임랩스 C에서 생성된 ET 1-GFP 혜성 궤적, 타임랩스 C에서 Temporal Color Code 플러그인을 사용하여 MT 역학을 설명함. 색상 코드는 20프레임(프레임 간 0.50초) 동안의 시간 투영을 나타냅니다. 스케일 바 = 10 μm. 이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하세요.

그림 4: STEP 4 Jupyter Notebook의 섹션 스크린샷. 노트북은 자명한 지침을 제공하는 마크다운 셀로 구성되어 있으며, 실시간 결과와 로그를 출력하는 코드 셀이 이어집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 5: 대조군 및 냉간 처리된 7-8단계 난자에서 EB1-GFP 혜성 역학 분석. 데이터는 대조군, 냉처리된 난자, 그리고 냉처리된 난자세포± ROI당 평균 SEM(ROI1–ROI3)을 나타냅니다. EB1-GFP 혜성 측정은 피지에서 처리된 타임랩스 이미지를 통해 얻어졌으며; 별도 언급이 없는 한, 분석은 채널 3에서 처리된 이미지에 대해 수행되었습니다. 전체 EB1-GFP 혜성 수는 채널 2 이미지(DoG 이미지)에서 분석되었습니다. 통계적 유의성은 Kruskal–Wallis 검정 후 Mann–Whitney 사후 비교 또는 Friedman 검정 후 Wilcoxon 매칭 쌍 검정을 사용하여 평가되었습니다(p < 0.05; p < 0.001; p < 0.0001). (A) EB1-GFP 혜성 총 수치를 나타내는 산점도(Scatter dot plot) (B) 운동성 EB1-GFP 혜성의 평균 수를 보여주는 산점도 그래프. (C) 평균 EB1-GFP 혜성 궤도 길이를 보여주는 산점도 그래프. (D) 평균 EB1-GFP 혜성 속도를 보여주는 산점도 그래프. (E) 대조군(n = 14), 대조군 냉처리(n = 12), patronin⁰⁵²⁵² 냉처리(n = 11) 난자 내 EB1-GFP 트랙의 방향을 보여주는 장미 플롯. 각 질환과 ROI는 각 질환별로 전부(A) 또는 후궁(P) 방향으로 방향을 둔 난자당 각 트랙의 평균 비율을 나타냅니다. (F) EB1-GFP 혜성 궤도 각도의 난자 앞뒤쪽 방향 평균 비율을 보여주는 막대 그래프. 퍼센트는 난자별 산출되었으며, 각 ROI 내 혜성 방향의 상대적 분포를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

미터법	투자 대비	제어 (n=14)	제어 냉처리 (n=12)	패트로닌05252 냉처리 (N=11)
총 EB1-GFP 혜성 수 (#/μm²)	ROI 1 (전쪽)	0.667 ± 0.18	0.691 ± 0.20	0.570 ± 0.17
	ROI 2 (중간)	0.394 ± 0.11	0.532 ± 0.15	0.400 ± 0.12
	ROI 3 (후면)	0.353 ± 0.09	0.561 ± 0.16	0.378 ± 0.11
모틸 EB1-GFP 혜성 번호 (#/μm²)	ROI 1 (전쪽)	0.189 ± 0.02	0.175 ± 0.03	0.099 ± 0.03
	ROI 2 (중간)	0.064 ± 0.02	0.091 ± 0.02	0.056 ± 0.02
	ROI 3 (후면)	0.043 ± 0.01	0.104 ± 0.03	0.047 ± 0.02
EB1-GFP 혜성 궤도 길이 (μm)	ROI 1 (전쪽)	0.613 ± 0.04	0.621 ± 0.03	0.478 ± 0.07
	ROI 2 (중간)	0.463 ± 0.04	0.535 ± 0.03	0.410 ± 0.05
	ROI 3 (후면)	0.488± 0.05	0.543 ± 0.04	0.393 ± 0.05
EB1-GFP 혜성 속도 (μm/sec)	ROI 1 (전쪽)	0.208 ± 0.01	0.198 ± 0.01	0.188 ± 0.01
	ROI 2 (중간)	0.207 ± 0.01	0.199 ± 0.01	0.186 ± 0.01
	ROI 3 (후면)	0.202 ± 0.01	0.194 ± 0.01	0.177 ± 0.01

표 1. 분석된 난자에서 전후방 영역에 걸친 EB1-GFP 혜성 측정 요약. 측정은 대조군, 대조군 냉처리, 이형접합 파트로닌⁰⁵²⁵² 냉처리된 난자에서 얻어졌습니다. 관심 영역은 ROI1(전방), ROI2(중간), ROI3(후방)로 정의되었습니다.

보충 표 1. 실험 조건 간 EB1-GFP 혜성 측정의 통계적 분석. P-값은 각 ROI(ROI1-ROI3)에 대해 대조군, 냉처리된 대조군, 이형접합 파트로닌⁰⁵²⁵² 난자 간의 차이를 나타냅니다. 세 조건 간의 전역 비교는 Kruskal–Wallis 검정을 사용했고, 이어서 쌍별 Mann–Whitney 사후 비교가 진행되었습니다.  이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요

보충표 2. 각 실험 조건 내 ROI 간 EB1-GFP 혜성 측정값의 통계적 비교. P 값 은 대조군, 냉처리된 난자, 이형접합 파트로닌⁰⁵²⁵² 내에서 ROI1(전부), ROI2(중간), ROI3(후방) 간의 차이를 나타냅니다. 각 상태 내 ROI 간의 전반적인 차이는 프리드먼 검정을 사용하여 평가하였다. 이후 Wilcoxon 매칭 쌍 부호 순위 검정을 사용하여 ROI 간 쌍별 비교가 수행되었습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요

보조 영상 1. 대조 단계 7–8 난자에서 추가적인 추적 단백질 EB1-GFP의 타임랩스 영상으로, 이후 MT 추적 분석에 적합한 대표적 획득 결과가 입증되었습니다(그림 3 참조). 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요

보조 코딩 파일 1: File_1_Step1_MTs_macro.ijm. 이미지 전처리를 위한 Fiji/ImageJ 매크로입니다. 이 필터는 가우시안의 차분(DoG) 필터를 사용하여 광표백 보정, 칼만 필터링, 배경 뺄셈을 자동화합니다. 또한 시간 그라데이션 향상(재슬라이싱 및 1D 컨볼루션)을 적용해 MT 팁의 선도 가장자리를 날카롭게 하여 추적 정확도를 향상시킵니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요

보조 코딩 파일 2: File_2_Step2_MTs_macro.ijm. 반자동 관심 지역(ROI) 정의를 위한 Fiji/ImageJ 매크로입니다. 사용자가 난자 경계를 정의하도록 유도하고, 선택을 자동으로 등거리 구역(예시에서는 전방, 중앙, 후방 3개 구역)으로 분할하여 분석의 지역적 층화를 가능하게 합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요

보조 코딩 파일 3: File_3_Step3_MTs_macro_tracking.py. Piji/ImageJ 내에서 실행된 Python 스크립트로, Trackmate를 사용해 EB1 혜성을 자동으로 추적합니다. 이 시스템은 전처리된 이미지를 일괄 처리하고, 정의된 품질 매개변수를 사용하여 혜성을 감지하며, 이를 궤적으로 연결하고, 원시 좌표 데이터를 CSV 파일 형식으로 내보냅니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요

보조 코딩 파일 4: File_4_Step4_MTs_results.ipynb. 정량적 분석의 주요 인터페이스 역할을 하는 Jupyter 노트북입니다. 원시 추적 데이터를 불러오고, 분석 파이프라인을 실행하며, 장미 그래프, 통계 요약표, 혜성 밀도, 속도, 수명에 대한 비교 차트 등 모든 최종 출력물을 생성합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요

보조 코딩 파일 5: File_5_MTModule1.py. 데이터 추출과 기본 기하학적 계산에 사용되는 기본 유틸리티 함수를 포함하는 맞춤형 Python 모듈입니다. ROI 파일 찾기, 순간 속도 계산, 기본 각도 변위 계산 기능을 포함합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요

보조 코딩 파일 6: File_6_MTModule2.py. 고급 분석 및 시각화 기능을 포함하는 맞춤형 Python 모듈입니다. 이 데이터베이스에는 방향 분석 파이프라인(기수 기반 vs. 축 비닝), 강건한 통계 검정(프리드먼/윌콕슨 및 프랫 방법), 그리고 논문용 수준의 극(장미) 플롯 생성 알고리즘이 포함되어 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요

보조 코딩 파일 7: File_7_KalmanStackFilterCompiled.jar. 전처리 매크로의 노이즈 감소 단계를 위해 Fiji/ImageJ용 컴파일된 Java Kalman Filter 플러그인이 필요합니다. 이 독립 실행형 버전은 별도의 자바 개발 키트(JDK)가 필요 없어져 사용자의 소프트웨어 설정을 단순화합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요

Discussion

난자에서 MT 역학의 실시간 영상 촬영은 의미 있는 정보를 추출하기 위해 고품질 데이터셋과 정량적 분석이 필요하기 때문에 독특한 도전 과제를 제시합니다. 이전 연구들은 실시간 영상 접근법^{14, 15, 16}을 보고했으나, 이미지 분석 단계는 종종 매우 맞춤화되어 있으며, 프로토콜은 재현성을 위한 충분한 세부 정보를 제공하지 못합니다. 따라서 광범위한 영상 또는 계산 전문 지식이 없는 연구자들은 이러한 분석을 재현하는 데 장애물에 직면할 수 있습니다. 이러한 문제를 해결하기 위해 고해상도 Airyscan 라이브 이미징과 사용자 친화적이고 자동화된 매크로 및 스크립트를 결합한 간소화된 워크플로우가 개발되었습니다. 이 파이프라인은 EM 1 혜성의 효율적인 탐지 및 추적을 가능하게 하며, 이어서 MT 방향, 속도, 공간 조직에 대한 정량적 분석이 이루어집니다. 수동 개입을 최소화하고 명확하고 단계별 지침을 제공함으로써, 이 워크플로우는 난자세포에서 MT 역학 분석의 접근성과 재현성을 촉진합니다.

난소 해부와 샘플 준비는 매우 중요한 첫 단계입니다. 난자는 기계적 손상을 방지하기 위해 신중하게 해부해야 하며,^{생존 시간을 유지}하기 위해 영상 촬영 시간은 90분으로 제한해야 합니다. 단계 선택은 중요합니다: 난자 형성 중반 이후에는 난자가 크기가 커지고 세포질에 노른자가 축적되어 9단계 이후에는 EB1 신호의 시각화가 점점 어려워집니다. 따라서 9단계 이후의 영상 촬영^{은 권장되지} 않습니다. 또한 재현 가능한 정량화를 위해서는 가능한 경우 크기가 비슷한 난자를 선호하는데, 이는 정의된 관심 영역이 샘플 전방과 후방 위치에 동일하게 대응하도록 보장하기 때문입니다.

온도 조절은 재현성을 위해 필수적입니다. 파리 재고는 정상 배달 조건(25°C)에서 유지되어야 정상 발달과 일관된 EB1-GFP 발현을 지원하며, 특히 온도 변화에 민감한 GAL4/UAS 시스템을 사용할 때 더욱 그렇습니다. 영상 중 온도 안정성도 매우 중요하며, 변동이 MT 역학에 영향을 줄 수 있습니다. 온도 조절 챔버가 필수는 아니지만, 획득 시 온도 변동을 피하는 것이 권장됩니다.

이미지 획득을 위해 고감도와 향상된 SNR 덕분에 획득 후 노이즈 제거 필요성을 최소화한 배열 검출기 공초점 이미징이 선택되었습니다. 가능한 한 높은 수치 구경 대물렌즈와 적절한 굴절률 매칭을 결합하여 측면 및 축 해상도를 극대화해야 하며, 이는 밀집된 네트워크에서 개별 혜성을 해독하는 데 매우 중요합니다. 또한, 혜성 추적의 정확도 손실을 피하기 위해 XYZ와 시간에서 나이퀴스트-섀넌³⁰ 샘플링 기준을 따라야 합니다. 동등하게 중요한 것은 z축을 따라 영상면을 신중하게 선택하는 것입니다. 너무 깊게 촬영하면 빛 산란으로 인해 형광이 손실되고, 피질 표면으로만 획득을 제한하면 EB1 혜성의 전체 역학을 포착하지 못합니다. 가장 유익한 데이터는 중간 z-위치에서 얻어집니다. 핵이 선택한 평면 내에 위치한 난자세포는 피해야 하는데, 핵 구획이 세포질의 큰 부분을 대체하고 EB1 트랙이 없어 검출 가능한 혜성 수가 줄어들기 때문입니다.

배열 검출기 기반 공초점 영상에 최적화되어 있지만, 이 분석 파이프라인은 하드웨어에 구애받지 않고 회전 디스크 공초점 현미경과 같은 다른 방식과 호환됩니다. 하지만 사용자는 NA 또는 SNR이 낮은 시스템은 매크로의 전처리 매개변수(예: 노이즈 내성/DoG 시그마)를 조정해야 하며, 이 경우 본 연구에서 제시된 값에 비해 혜성 탐지 밀도가 감소할 수 있음을 유의해야 합니다. 그럼에도 불구하고, 절대값은 시스템마다 다를 수 있지만, 실험 조건과 예상되는 ROI 간의 상대적 추세는 견고하게 유지될 것입니다.

난자의 큰 3D 구조를 고려할 때, 2D 영상은 MT 네트워크의 광학 단면만 포착합니다. 따라서 z축을 따라 가파르게 움직이는 혜성들은 초점면을 벗어날 수 있으며, 이는 궤도 수명과 절대 속도가 과소평가될 수 있습니다(속도 벡터의 xy 성분만 측정됨). 하지만 난자 전체의 고속 3D 체적 영상 촬영은 더 작은 시야각(FOV), 짧은 노출 시간, 더 빠른 검출기 응답 시간이 필요해 SNR이 감소하고 여러 z-슬라이스에 걸쳐 획득 시간이 분산되어 빠른 EB1 혜성 추적에 필요한 시간적 해상도가 저하됩니다. 움직이지 않는 혜성과 초점 어린 인위팩트를 완화하기 위해, 초점면을 통과하는 일시적 점들을 제거하기 위해 3프레임 트랙 제외< 합성곱 및 최소 트랙 지속 시간 필터가 적용되었습니다. 더불어, 이 기하학적 한계는 실험 조건 전반에 걸쳐 균일하게 적용되기 때문에, 혜성의 밀도, 속도, 방향에서 관측된 상대적 차이는 여전히 견고하게 유지됩니다. 빛 필드 현미경과 같은 신흥 기법들은 이상적으로는 전체 3D 구조를 동시에 포착할 수 있지만, 아직 널리 보급되지는 않았습니다. 그럼에도 불구하고 모든 MT 동역학 매개변수에 대한 측정값은 이전 보고서와 일치하여, 이 프로토콜이 다양한 실험 환경에서 MT 역학을 조사하는 데 적합함을 나타냅니다.

이 프로토콜의 매크로를 사용하기 전에 소프트웨어 매개변수가 올바르게 최적화되었는지 확인하기 위해 처음 몇 장의 이미지를 수동으로 처리하는 것이 권장됩니다. 영상 해상도, 배율, 신호 대 잡음비, 프레임 속도, 데이터가 단일 평면 또는 z-스택인지 등 모든 요소가 추적 정확도에 영향을 줄 수 있습니다. 결과 트랙을 시각적으로 검사하면서 매개변수를 반복적으로 조정하여 오탐과 거짓 음성을 최소화합니다. 최적화가 완료되면 재현성을 보장하기 위해 데이터셋 전반에 걸쳐 매개변수를 일관되게 적용하세요.

마지막으로, 생물학적 해석에 관한 몇 가지 제한점도 주목해야 합니다. EB1-GFP는 성장하는 MT 플러스 말단을 선택적으로 표지하므로, 전체 MT 집단이 아닌 활성 MT 중합 부위를 보고합니다. 영상 기간 동안 안정적이고 비중합성 MT는 이 방법으로 검출되지 않습니다. 이 제한은 대부분의 MT가 매우 동적이기 때문에 중간 난자 형성 난자세포에서는 덜 제한적이지만, 뉴런³¹과 같이 상당한 안정된 MT 집단을 가진 다른 세포 유형에 프로토콜을 적용할 때는 고려해야 합니다.

결론적으로, 이 워크플로우는 초파리 난자세포의 MT 역학에 대한 고해상도 정량적 분석을 가능하게 합니다. 최적화된 해부, 배열 검출기 공초점 라이브 영상, 자동화 분석 도구를 통합함으로써, 심점체 맥락에서 MT 조절자를 연구할 수 있는 엄격하면서도 접근하기 쉬운 방법을 제공합니다. 주로 난자세포에서 검증되었지만, 이 접근법의 원리는 최적화 시 신경세포나 상피와 같은 비분열 세포 등 다른 세포 유형에도 적용 가능하여, 유전적 스크리닝과 MT 조직의 기전 연구를 위한 확장 가능한 플랫폼을 제공합니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
듀몽 #5 겸자	파인 사이언스 툴즈	11252-20
EB1::GFP	프랑스 CNRS, 자크 모노 연구소 앙투안 기셰 박사로부터		유전자형: w; +/CyO; UASp-EB1::GFP/TM3
유리바닥 페트리 접시	맷텍	P35G-1.0-14-C
Matα 4-Gal4-VP16	블루밍턴 초파리 가축 센터	7062	유전자형: w[*]; P{w[+mC]=matalpha4-GAL-VP16}V2H
오일 10S, 볼탈레프	VWR 케미컬스	24627.188
패트로닌 돌연변이	블루밍턴 초파리 가축 센터	16647	유전자형: y[1] w[67c23]; P{y[+mDint2] w[+mC]=EPgy2}Patronin[EY05252]/CyO
W1118	블루밍턴 초파리 가축 센터	3605
Airyscan 2가 장착된 자이스 LSM 980	자이스