방법 논문

초파리 배아 상피에서 코어 주름 부분 격지 접합 단백질을 규명하기 위한 면역염색 및 염료 침투 실험

DOI:

10.3791/69986

⸱

2026년 2월 27일

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Case Western Reserve University, 2Admissions Counselor, Case Western Reserve University

이 논문에서

요약

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이 프로토콜들은 대조군과 돌연변이 초파리 배아 상피에서 주름 격격 접합부의 조직 및 폐쇄 기능을 어떻게 특성화할 수 있는지 개괄합니다.

초록

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이 프로토콜의 목적은 초파리 배아의 외배엽에서 유래한 상피 조직에서 주름진 격격 접합부(pSJs)의 조직과 장벽 기능을 평가하는 것입니다. pSJ는 표피, 침샘, 기관, 후장 등 외배엽 조직의 외측막에 폐쇄 장벽을 형성하며, 척추동물 조직의 긴밀한 접합부와 기능적으로 유사합니다. 초파리에서는 pSJ 형성에 필요한 30개의 단백질이 확인되었습니다. 코어 pSJ 단백질은 처음에는 측막 길이를 따라 국소되지만, 배아 발생 16단계에서 접합부의 꼭대기 측면 부위, 즉 부착부 접합부의 바로 아래에 위치해 강하게 농축됩니다. 배아 발생 후반 15단계에 이르면 이 조직들은 완전히 기능하는 폐쇄 접합부를 갖게 됩니다. 본 논문은 대조군 및 돌연변이 배아에서 pSJ의 조직과 기능을 조사하는 데 사용할 수 있는 면역염색 및 염료 투과성 프로토콜을 설명할 것입니다. 이 프로토콜들의 성공적인 활용은 pSJ의 차단 기능을 입증하고, 미지의 유전자가 접합부의 핵심 성분을 암호화하는지 여부를 검증하는 데 활용될 수 있습니다.

서론

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상피 조직의 중요한 기능 중 하나는 유기체 내에서 서로 다른 영역을 구획화하는 것입니다. 이러한 독특한 환경을 조성하는 것은 장기 기능과 외부 위협으로부터 유기체를 보호하는 데 필수적입니다. 상피 세포 사이에 형성된 폐쇄 접합부는 해당 상피의 꼭대기와 기저 면을 사이에 용질이 세포 측으로 흐르는 것을 막아 이러한 환경을 구축하고 유지하는 역할을 한다. 척추동물 생물에서는 폐쇄 접합부를 타이트 접합부라고 하며, Drosophila melanogasster 1,3과 같은 무척추동물에서는 격격 접합부(sj)라고 부릅니다. 절지동물에는 조직 분포와초구조로 구분되는 두 가지 유형의 SJ가 있습니다. 주름진 격격 접합부(pSJs)는 표피, 침샘, 기관, 후장 등 외배엽에서 유래한 조직에서 발견됩니다. 이들은 세포 사이 세포 외 공간에 전자 밀도가 높은 사다리 형태의 배열이 부착 접합부 3,5 바로 아래에 위치하는 것으로 초구조적으로 특징지어집니다. 반면, 매끄러운 격격 접합부(sSJ)는 중장 및 말피기관 같은 내배엽 유래 조직에서 발견되며, 세포사이에 전자 밀도가 높은 중격을 보이지 않습니다.

초파리에 대한 유전학 연구는 pSJ 구조와 기능에 필요한 30가지 단백질을 확인했으며, 접합부에 존재하지만 그 형성이나 유지에 아무런 기능을 하지 않는 추가 단백질도 확인했습니다(7번 검토). 이 분석을 통해 과학자들은 SJ 단백질을 세 가지 범주로 분류했습니다. 핵심 SJ 단백질은 접합부에 존재하며 접합부의 형성과 유지에 필수적입니다. 코어 pSJ 단백질로 확인된 단백질은 17종으로, 여기에는 Coracle(Cora), Neurexin IV, Macroglobulin complement-related(Mcr), Kune-kune, 그리고 ATPasealpha 8,9,10,11,12가 포함됩니다. 접합부의 형성 및/또는 유지에 필요한 보조 pSJ 단백질로 9개의 단백질이 확인되었으나, 반드시 접합부에 존재하지는 않습니다. 이 클래스에는 Rab5, Rab11, 그리고 코일드13,14와 같은 단백질이 포함됩니다. 마지막으로, pSJ 상주 단백질은 pSJ에 국소하지만, 접합부의 형성과 유지에는 필수적이다. 이 그룹의 네 멤버 중 예로는 Discs Large와 Fasciclin III15,16이 있습니다.

기능적으로 온전한 pSJ의 형성은 모든 핵심 pSJ 단백질이 완전히 발현되는 배아 발생 중간에 시작되는 다단계 과정입니다. 일부 핵심 pSJ 유전자는 모체에서 발현되지만, 모두12-17단계까지 강한 접합 발현을 보인다. 12단계에서는 핵심 pSJ 단백질이 측막 길이 전체에 국소화됩니다. 13-16단계 동안 핵심 pSJ 단백질은 엔도사이토스화되어 pSJ 부위의 측막으로 재순환됩니다. 이 과정에는 Rab5와 Rab11을 포함한 pSJ 보조 단백질이필요합니다. 16단계에 이르면 핵심 pSJ 단백질은 측막을 따라 pSJ 부위에 밀착적으로 국한됩니다. 이 관찰과 일치하게, 접합부의 완전한 폐쇄 기능은 배아 발생12의 후기 15단계에서 나타납니다. 이는 염료 투과성 분석법을 사용하여 가장 잘 입증할 수 있습니다. 접합부가 형성되기 전에, 로다민과 같은 형광 표지가 붙은 10 kDa 덱스트란 구슬이 세포 내 세포 간 공간을 통과할 수 있습니다. 표지된 덱스트란을 혈구에 주입하면, 기관, 침샘, 후장 등 관상피의 내강에 빠르게 축적됩니다. 15단계 말에 pSJ가 생리학적으로 조여지면, 주입된 덱스트란은 상피의 기저면에 제한되어 이 기관들의 내강(첨단 영역)에 축적될 수 없습니다.

핵심 pSJ 단백질들은 각 핵심 pSJ 단백질이 올바른 세포 내 위치를 파악하기 위해 다른 모든 핵심 pSJ 단백질의 존재를 필요로 한다는 특징을 공유한다18,19. pSJ 형성에서의 이러한 상호의존성은 핵심 pSJ 단백질의 특징이며, 이 글에서 제시하는 프로토콜의 근간입니다. 핵심 또는 보조 pSJ 유전자의 돌연변이는 배아 치사성을 초래하며, 16단계 배아에서는 다른 핵심 pSJ 단백질이 정상 첨단 측측 부위에 밀착되지 않고 외막을 따라 잘못 위치하는 것이 특징입니다. 반면, pSJ 거주 유전자의 돌연변이는 핵심 pSJ 단백질의 위치 오류로 이어지지 않는다15. 핵심 및 부속 pSJ 유전자 돌연변이에서 pSJ의 기능 장애는 16기 또는 17기 돌연변이 배아의 기관, 침샘 또는 후장 내강에 표지된 10 kDa 덱스트란이 축적됨에 의해 드러난다. 마지막으로, 코어 단백질과 보조 pSJ 단백질의 구별점은 세포 내 위치입니다. 핵심 pSJ 단백질은 형성되면 pSJ와 밀접하게 연관되어 있는 반면, 보조 pSJ 단백질은 접합부 조립에 필수적이지만 반드시 접합부에 존재하지는 않습니다. 보조 pSJ 단백질의 대표적인 예는 Rab5와 Rab11입니다. 두 단백질 모두 세포질 단백질로, 원형질에서 초기 엔도좀으로 화물을 재순환하는 엔도좀으로 이동시키고, 다시 원형질막으로 돌아오는 데 도움을 줍니다. 새로운 잠재적 pSJ 단백질이 핵심 성분인지 보조 단백질인지 구별하기 위해서는 일반적으로 특정 항체를 만들거나 형광 표지가 부착된 재조합 단백질을 발현하여 이러한 단백질들이 pSJ 성숙 과정의 여러 시점에서 어디에 위치하는지 파악하는 것이 도움이 됩니다.

이 프로토콜의 목적은 잠재적인 핵심 및 부속 pSJ 단백질과 pSJ 상주 단백질을 명확히 구분하는 데 있습니다. 여러 연구에서 pSJ 단백질이 발달 과정에서 형태발생과 첨단-기저 극성에 관여하는 추가적이고 비차단적인 역할도 밝혀졌습니다 17,20,21,22. pSJ 생물학에 대한 관심이 높아지고 더 많은 잠재적 pSJ 단백질이 발견됨에 따라, 여기서 제시된 간단하고 해석 쉬운 프로토콜은 연구자들이 이러한 단백질의 pSJ 조직과 차단 기능을 올바르게 특성화하는 데 도움이 될 것입니다. 문헌에서는 pSJ 단백질을 특성화하기 위한 다양한 실험적 접근법이 기술되었으며, 여기에는 광표백 후 형광 회복(FRAP)과 투과전자현미경 6,23이 포함됩니다. 이러한 접근법은 종종 매우 유용하지만, 여기서 제시된 면역염색 분석법은 비용이 많이 들고 시간이 많이 드는 초구조적 방법 없이 pSJ 단백질 위치를 빠르게 시각화할 수 있는 반면, 염료 투과성 분석법은 영상만으로는 달성할 수 없는 pSJ 무결성의 기능적 판독을 제공합니다. 또한, 이러한 검사는 고품질 형광 현미경과 기본적인 미세 주입 장비 같은 표준 실험실 장비를 사용하여 수행할 수 있습니다. 이 검사들은 초파리 16기 배아 분석에 최적화되어 있으며, sSJs의 조직이나 기능 평가에는 적합하지 않음을 유의해야 합니다.

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프로토콜

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1. 배아 단계

  1. 적절한 유전자형의 건강한 수컷과 암컷 파리를 교배하여 신선한 사과즙 접시에 효모 페이스트를 바른 배아 수집 케이지에 넣습니다. 배아 채취를 시작하기 전에 파리들이 알 수집 우리에 하루 이틀 적응하도록 두세요.
  2. 사과 주스 접시에 배아를 수집하여 16단계(산란 후 ~13시간(AEL)에서 25°C에서 16시간 AEL까지 발달시킵니다). 성체가 사과즙 접시에 수정란을 1-2시간 동안 낳게 한 후, 알을 채취 우리에서 분리한 후 25°C에서 13-16 AEL로 숙성시킵니다. 또는 25°C에서 하룻밤 배아를 채취한 후, 고정 전이나 고정 및 면역염색 후 영상 촬영 중 16단계 배아를 선택하기도 합니다.
    참고: 배아 병기 분류는 장 형태학으로 평가할 수 있으며, 이는 자외선 스펙트럼(즉, DAPI 채널)에서 자가형광을 통해 가장 쉽게 시각화됩니다. 16단계 배아에서는 장이 몸의 장축에 수직인 세 개의 평행하고 긴 타원형으로 나타납니다(그림 1H).

2. 배아의 고정 및 면역염색

  1. 나일론 메쉬(120mm 메시)로 배아 수집 바구니를 조립하세요. 나일론 메시로 바스켓 구멍과 나사산을 덮은 다음, 캡을 나사로 고정하세요.
  2. 붓과 배아 세척액으로 사과 주스 접시에서 배아를 부드럽게 떼어내세요. 배아 혼합물을 배아 수집 바구니에 붓고 증류수로 헹구세요.
    참고: 배아 채취 바구니 안쪽으로 물을 흘려보내고, 배아가 바구니 측면에 튀면 부착으로 인해 배아가 손실될 수 있습니다.
  3. 배아 수집 바구니와 배아를 50% 상업용 표백제(최종 농도 3.75% 차아염소산나트륨)가 담긴 트레이에 담가서 탈코리온화합니다. 배아를 표백제에 넣고 실온에서 3-5분간 담가두세요. 바구니를 표백제에서 분리하고 배아를 증류수로 헹구면서 다시 한 번 바구니 안쪽으로 물이 흐르도록 유도하세요.
  4. 고정 바이알은 신선한 4% 파라포름알데히드 용액과 헵탄을 같은 부피로 20mL 섬광 바이알에 첨가하여 준비합니다. 적절한 양의 파라포름알데히드를 화학 연기 후드에서 뜨거운(~90 °C) 1x 인산염 완충 생리식염수(PBS)에 용해하여 파라포름알데히드 용액을 만듭니다. 용해 과정을 빠르게 하기 위해, 10 mL PBS당 10 μL 14 N 수산화나트륨을 고정액에 첨가하여 포름알데히드가 용액에 녹아들 때까지 한 후, 14 N 염산 10 μL를 추가하여 pH를 중성으로 조정합니다.
    주의: 파라포름알데히드와 헵탄을 다룰 때는 항상 실험복, 고글, 장갑을 착용하며, 화학 훈기 후드 아래에서만 사용하세요. 파라포름알데히드는 발암물질이며 부식성이 있는 반면, 헵탄은 매우 인화성이 강하고 피부와 눈 자극을 줍니다.
  5. 배아 수집 바구니를 분해하고 탈코리온 배아와 함께 나일론 메쉬를 헵탄에 담가. 배아는 나일론에서 떨어져 나와 헵탄(상층)과 고정(하층) 사이의 경계면에 자리 잡습니다. 고정 바이알을 분당 240회전(RPM)으로 플랫폼 셰이커에 20분 동안 흔들어 고정 배아를 고정합니다.
  6. 화학 연기 후드에 파스퇴르 피펫으로 고정 바이알에서 고정액을 제거하세요. 수리액은 승인된 유해 화학 폐기물 용기에 폐기하세요. 같은 양의 메탄올을 넣고, 고정실을 닫은 뒤 5-10초 동안 격하게 흔듭니다. 고정된 배아는 비텔린 외피에서 떨어져 나와 메탄올 바닥(하층)으로 가라앉습니다. 비텔린 외피와 비텔린 외피에서 벗어나지 못한 배아는 인터페이스에 남아 2.7단계에서 제거됩니다.
    주의: 메탄올을 다룰 때는 항상 실험복, 고글, 장갑을 착용해야 합니다. 메탄올은 독성이 있고 인화성입니다.
  7. 헵탄은 파스퇴르 피펫으로 제거하여 승인된 유해 화학폐기물 용기에 버리세요. 그 후 대부분의 메탄올을 제거하고 배아를 작은 메탄올 웅덩이에 남겨두고, 메탄올은 유해 화학 폐기물에 버립니다. 메탄올 5mL를 넣고 배아를 돌려 안정시키세요. 메탄올 대부분을 다시 제거하고 이 과정을 두 번 더 반복합니다.
  8. 메탄올에 담긴 배아를 0.8mL 유리 배양관에 옮깁니다. 메탄올을 제거하고 블록 용액 750mL(PBS와 1% 일반 당나귀 혈청, 0.1% Triton X-100)를 추가하세요. 배아를 PBS에 3번 세척한 후, 상온에서 블록 용액에 30분간 부드럽게 배양하며 플랫폼 락커 위에서 부드럽게 섞습니다.
  9. 배아를 PBS에 한 번 더 세척한 후 블록과 1차 항체를 추가하세요. 코어 pSJ 단백질(예: Coracle)과 부착자 접합 단백질(예: E cadherin)에 대한 항체를 사용하세요. 배아를 1차 항체에서 4°C에서 하룻밤 또는 상온에서 3-4시간 동안 배양하고, 플랫폼 락커 위에서 부드럽게 혼합합니다.
  10. 1차 항체로 차단 부위를 제거하고 배아를 PBS에 세 번 헹구세요. 배아를 넣고 상온에서 플랫폼 록커 위에서 30분간 세척하세요.
  11. 배아를 PBS에 한 번 더 세척한 후, 차단액과 2.9단계에서 사용한 1차 항체에 특이적인 형광 표지된 2차 항체를 첨가합니다. 배아는 상온에서 3-4시간 또는 4°C에서 하룻밤 배양합니다.
  12. 2차 항체로 차단 부위를 제거하고 배아를 PBS에 세 번 헹구세요. 배아를 넣고 상온에서 플랫폼 록커 위에서 30분간 세척하세요.
  13. 배아를 다시 PBS로 헹구고, 파스퇴르 피펫을 사용해 현미경 슬라이드로 옮깁니다. 배아를 만지지 않도록 조심하면서도 작은 왓맨 종이 조각으로 과잉 PBS를 제거합니다. 배아를 마운팅 배지(상업적으로 판매되거나 90% 글리세롤, 10% 1 M Tris, pH 8.0, 0.5% n-propyl gallate 사용으로 만들어진 혼합체)로 덮으세요. 적절한 크기의 1.5번 커버 유리로 덮고, 가장자리는 매니큐어로 밀봉하세요.

3. 면역염색된 배아의 영상 및 데이터 분석

  1. 최상의 결과를 위해서는 40배 오일 침수 대물렌즈가 장착된 공초점 현미경으로 배아를 촬영하세요. 제어 배아를 사용해 공초점에 레이저 세기와 게인을 설정하여 픽셀을 과포화시키지 않고 강한 형광 신호를 얻을 수 있습니다. 중장 형태학을 사용하여 선택되는 16단계 배아(즉, 배낭 인코딩 GFP를 발현하지 않는 돌연변이 배아를 식별하는 배아)를 식별합니다. 이 기관들은 분극되어 있고 긴 측면막을 가지고 있어 부착체 접합부, pSJ, 그리고 남은 측면 표면을 구분하기에 이상적입니다. 침샘 또는 후장 내강의 가능한 가장 큰 직경을 포함하는 Z 위치에서 상피세포의 전체 측막을 관찰하는 모습을 촬영하세요.
    참고: 그림 1C 에 나타난 예시는 HC PL APO 40x/1.3 CS2 오일 임머전 렌즈를 장착한 공초점 현미경에서 촬영되었으며, 561 nm 레이저는 레이저 세기 1.59, 이득 3.3, 638 nm 레이저는 레이저 세기 2.0, 이득 21.7을 가졌습니다( 재료표 참조).
  2. 최소 20개의 대조군 및 돌연변이 16기 배아에서 분극된 조직을 상상하세요. 부착 접합 마커가 막의 꼭대 외측 부위에 밀착되어 배아가 고정되고 적절히 염색되었는지 확인하기 위해 데이터를 기록할 수 있습니다. 다음으로, 측막을 따라 pSJ 마커의 분포를 기록합니다. 야생형 16기 배아에서는 부착자 접합부 바로 아래에 위치한 측막의 ~10-15% 부위에 pSJ 단백질이 강하게 풍부해지는지 관찰합니다.
    참고: 측막 길이에 pSJ 단백질의 10-20%만 잘못 위치해도 pSJ 조직 결함을 진단할 수 있습니다. pSJ 조직 결함은 모든 핵심 및 부속 pSJ 돌연변이 배아에서 강하게 침투하므로, 돌연변이 배아의 75-100%에서 명확히 잘못 위치된 pSJ 단백질을 보일 것으로 예상해야 합니다.

4. 염료 주입 준비

  1. 로다민 표지된 10 kDa 덱트론을 0.5 M 인산나트륨, pH 7.5, 5 mM 염화칼륨에 녹여 신선한 염료 용액을 만듭니다.
  2. 모세관관(1.0mm 외경 x 0.5mm 내경, 섬유 포함)을 바늘 풀러를 이용해 유리 바늘에 당겨 넣습니다.
    참고: 바늘 풀러는 개성이 뚜렷하며, 이상적인 바늘 설정은 날마다 다를 수 있습니다. 좋은 바늘은 점차 뾰족한 끝으로 가늘어지며, 그림 2A에 보이는 형태 사이에 위치해야 합니다. 왼쪽 바늘은 더 길고, 배아에 밀려 들어가면서 구부러질 수 있습니다. 이 문제는 바늘을 포인트에서 더 멀리 부러뜨리면 교정할 수 있습니다. 오른쪽 바늘은 좋지만 처음에 부러졌을 때 구경이 더 커져 배아에 너무 많은 액체가 밀려 들어갈 수 있습니다. 그럴 때는 더 가는 끝이 있는 새 바늘로 바꾸세요. 바늘 풀러의 조건에 따라 바늘이 적절한 모양을 만들 때는 여러 바늘을 동시에 당기는 것이 가장 좋습니다. 남는 바늘은 폼이나 테이프로 닫힌 용기에 보관하여 바늘을 독립적으로 고정할 수 있습니다.
  3. 마이크로매니퓰레이터의 바늘걸이에 바늘을 넣으세요. 마이크로매뉴퓰레이터를 역현미경 옆에 배치하세요(그림 2F). 바늘을 현미경 슬라이드와 최대한 평행하게 맞추고, 슬라이드 측면과 같은 Z면에 들어가도록 바늘을 내리세요.
  4. 현미경 슬라이드 옆면을 쳐서 바늘 끝을 부러뜨리세요. 바늘을 슬라이드 높이보다 높이 들어 올린 후 장전을 위해 빼세요.
  5. 모세관 튜브에 가장 작은 피펫 팁(P2 또는 P10 팁)을 사용하거나, 1.5mL 마이크로 원심분리관에 니저 바늘 뒷부분을 염료와 함께 넣어 모세관 작용으로 염료를 채웁니다.
  6. 채워진 바늘을 바늘 홀더에 다시 장전한 후, 현미경 슬라이드 표면에 있는 할로카본 오일 한 방울에 덱스트란의 흐름을 시험합니다.
    참고: 잘 부러진 바늘은 압력을 추가하지 않으면 누수가 없으며, 주사기의 플런저에 가하는 압력에 따라 유량을 조절할 수 있습니다.

5. 배아 착상 및 염료 주입

  1. 중장 형태를 병기 마커로 사용하여 16기 또는 17기 배아(대조군 및 돌연변이)를 선택하세요.
  2. 22 x 22 # 2 두께의 커버슬립을 사용해 사과 주스 접시에 움푹 들어간 선을 그어보세요. 약 25개의 단계화된 배아를 사과 주스 접시에 정렬시키고, 배 끝이 선에 닿게 하고 배면은 위를 향하게 합니다.
  3. 양면 테이프를 22 x 22 #2 커버슬립에 붙이세요. 테이프를 배아 라인에 대고 커버슬립을 가볍게 문지르면 배아를 플레이트에서 양면 테이프로 옮기세요(그림 2B).
  4. 커버슬립을 현미경 슬라이드에 부착하려면 할로카본 오일 한 방울을 넣고 모세관 작용으로 결합을 만듭니다. 커버슬립을 슬라이드 쪽, 서리가 낀 부분과 반대편에 더 가깝게 배치하세요. 배아를 건조제가 든 용기나 실험실 작업대 위에서 3-5분간 10-15분간 건조합니다(그림 2C-E). 배아를 완전히 할로카본 오일로 덮으세요.
    참고: 배아는 건조 후 약간 덜 팽팽해지지만 심하게 이완되지는 않습니다. 그림 2E 에 나타난 배아들은 상대습도 42%인 방에서 21.2 °C에서 15분간 자연 건조되었습니다.
  5. 배아가 들어간 슬라이드를 배아가 위를 향한 상태로 역현미경에 장착하세요(대물에서 멀어지게). 마이크로매니퓰레이터를 바늘이 배아의 뒤쪽 끝을 향하도록 정렬하여 배아와 가능한 한 평행한 각도로 맞추세요(그림 2G). 마이크로매니퓰레이터의 z축을 조정하여 바늘 끝이 배아의 중간 지점(등복축을 따라 정렬)되도록 합니다.
  6. 단계를 빠르게 바늘 안으로 이동시켜 바늘 끝이 배아의 혈구에 들어가도록 하여 배아를 주입합니다. 10, 25 또는 50 mL 주사기로 소량의 염료(~0.2-0.5 nL)를 주입하세요. 바늘을 빠르게 빼고 단계를 다음 배아로 옮긴 뒤 이 과정을 반복하세요. 10분 안에 가능한 한 많은 배아를 주입하세요.
    참고: 바늘은 배아 안쪽 약 25% 지점에 삽입하는 것이 중요하며, 염료가 앞장 및 후장 내강과 연속된 주변 유리 공간에 직접 주입되지 않도록 해야 합니다. 주입한 염료는 배아를 '부풀리는' 것처럼 보여서 더 탁한 모습으로 보이게 해야 합니다. 과다 주사하면 조영제와 혈림프가 주사 부위에서 나오는 기포가 생기므로 피해야 합니다.
  7. 추가로 할로카본 오일을 추가하고 배아를 22 x 22 #2 커버슬립으로 덮으세요. 추가된 할로카본 오일은 두 커버슬립 사이에 더 균일한 층을 형성하여 배아가 으깨지는 것을 방지합니다.

6. 영상 및 데이터 분석

  1. 형광 화합 현미경 또는 공초점 현미경(10배 또는 20배 공기 대물렌즈 중 하나)으로 영상 촬영을 수행하세요. 공초점 Z 스택 촬영에서는 배아 깊이의 약 4분의 1(배측 배추 축을 따라 )을 촬영하면 라벨이 붙은 덱스트란이 기관과 후장 내강에 들어갔는지 확인할 수 있습니다(침샘을 보기 위해서는 더 깊은 단면이나 배아를 복측면으로 재배치하는 것이 필요합니다).
    참고: 그림 3 에 표시된 예시들은 561 nm 레이저의 경우 HC PL APO 10x/0.4 CS2 건식 렌즈를 장착한 공초점 현미경에서 레이저 세기 2.0, 이득 13.6을 사용했습니다. 24개의 z 슬라이스가 2.4nm의 z 단계 크기로 얻어졌습니다( 재료표 참조).
  2. 주입된 배아를 10분간 숙성시킨 후 기관, 침샘, 또는 후장 내강에 라벨이 붙은 덱스트란이 축적되었는지 검사합니다. 각 배아의 유전자형과 단계, 그리고 라벨링된 덱스트란이 어떤 관식 기관에 축적되는지 기록하세요. 주변염 공간도 염료로 강하게 염색된 배아는 의도치 않게 그 공간에 주입된 배아일 수 있습니다.

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결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기서 제시된 프로토콜은 16기 초파리 배아의 외배엽 조직에서 pSJs의 조직과 기능을 조사하는 데 사용됩니다. 이 프로토콜은 pSJ에게만 적용되며 sSJ를 심문하는 데 사용할 수 없습니다. 16단계 배아에서 다른 pSJ 단백질을 pSJ 영역에 위치시키지 못하고 16단계에서 폐쇄 접합부를 형성하지 못하는 유전자 돌연변이는 핵심 pSJ 유전자 또는 보조 pSJ 유전자에 속합니다. 두 가지 주요 차이점은 야생형 배아에서 기능적 접합부가 형성되면 암호화된 단백질이 세포 내 pSJ에 국소화되는지 여부입니다. 이 경우 해당 단백질은 핵심 pSJ 단백질로 분류됩니다. 이 원리를 입증하기 위해, 우리는 먼저 야생형 배아에서 배아 발생 13단계에서 16단계까지 핵심 pSJ 단백질의 위치가 어떻게 성숙하는지 보여준다(그림 1A-D). 여기서는 침샘에 초점을 맞추는데, 침샘은 윗부분이 샘의 내강을 향하는...

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토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기서는 형광 현미경 기능을 갖춘 소규모 실험실에서 수행할 수 있는 두 가지 비교적 간단한 분석법을 사용하여 핵심 및 보조 pSJ 단백질을 식별하는 프로토콜을 제시합니다. 첫 번째 검사는 고정된 돌연변이 배아의 공초점 영상을 이용해 성숙한 분광 상피에서 pSJ의 분자 조직을 조사합니다. 두 번째 분석은 16단계 생체 배아에 염료 표지된 10 kDa 덱스트란 분자를 주입하여 pSJ의 폐쇄 기능의 무결성을 검사합니다. 이러한 프로토콜의 단순성과 pSJ 조직 및 기능의 결함이 핵심 및 보조 pSJ 돌연변이를 완전히 진단할 수 있다는 점은, FRAP이나 전자현미경과 같은 더 노동 집약적이고 기술적으로 도전적인 접근법보다 유리하게 만듭니다. 이 프로토콜들은 초파리의 배아 발생 중 pSJ의 조직과 기능에 특이적으로 적용되며, sSJ나 후기 발달 단계에는 적용되지 않습니다.

핵심 및 보조 pSJ 돌연변이 후기 배아에서 모든 핵심 p...

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공개 사항

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저자들은 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

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이 연구에 사용된 파리 자원을 제공해 주신 블루밍턴 초파리 자원 센터에 감사드립니다. 연구에 사용된 항체를 제공해 주신 발달 연구 하이브리돔 뱅크에 감사드립니다. 또한 케이스 웨스턴 리저브 대학교 생물학과에 대해 유전형 분석 및 배아 분류를 위한 배아 분류 및 단계별 분류에 사용해 준 것과, 염료 주입 실험을 위한 DMi8 역형 형광 현미경을 사용해 준 것에 대해 감사드립니다. 이 연구에서 제시된 염료 주입 실험에 사용된 여러 바늘을 뽑아주신 CWRU 의과대학 유전학 및 유전체과학 교수 헬렌 살츠에게 감사드립니다. 이 프로젝트는 국립과학재단(IOS 2111069)의 보조금으로 REW에 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
바늘용 모세관 (Boro 1 X 0.5/섬유)FHC30-30-1
공초점 현미경라이카스텔라리스 5 
주입용 22 x 22 두께의 유리 덮개를 사용하세요피셔 사이언티브12-540-B
영상 촬영용 커버 유리 22 x 30 두께 1.5코닝2980-233
면역염색을 위한 배양관 (6 x 50 mm) & nbsp;피셔 사이언티브14-958-A
배아 수집 케이지제네시 사이언티브59-100
형광 입체 현미경라이카MZ10 F
할로카본 오일 (700)제네시 사이언티브59-131
헵테인피셔 사이언티브H350-4
역형광현미경라이카DMi8
배아 탈핵을 위한 메시 바구니제네시 사이언티브46-101
메탄올피셔 사이언티브A412-4
마이크로매니퓰레이터나리시게MN151
현미경 슬라이드피셔 사이언티브12-544-2
바늘 풀러데이비드 코프 악기모델 720
일반 당나귀 혈청잭슨 면역연구(Jackson ImmunoReseaerch)017-000-121
나일론 메시 (120 um)제네시 사이언티브57-102
대물렌즈 HC PL FLUOTR 10X/0.32 PH 1라이카11506537
대물렌즈 HC PL APO 10x/0.40 CS2라이카15506407
대물렌즈 HC PL APO 40x/1.30 CS2라이카15506358
페트리 판 60 x 15 mm코닝351007
플랫폼 로커글로브 사이언티픽GTR-FS
1차 항체 (코라클)DSHBC566.9
1차 항체 (코라클)DSHBC615.16
1차 항체 (E 카데린)DSHBDCAD2
1차 항체(Mcr)CWRU 병동 실험실기니피그 다클론
로다민은 10 kDa 덱스트란으로 표기되어 있습니다분자 프로브D1824
2차 항체 (당나귀 안티기니피그 Cy3)잭슨 면역연구(Jackson ImmunoReseaerch)706-165-148
2차 항체(당나귀 항생쥐 Cy2)잭슨 면역연구(Jackson ImmunoReseaerch)715-225-151
2차 항체 (당나귀 항쥐 Cy5)잭슨 면역연구(Jackson ImmunoReseaerch)712-175-150
탁상용 셰이커뉴브런즈윅 사이언티픽C2 플랫폼 셰이커
테고셉트 (메틸 4-하이드록시벤조에이트)TCIH0216
트리톤 X-100피셔 사이언티브BP151500
고정용 바이알 (20ml WHEATON 액체 섬광 바이알)피셔 사이언티브03-341-73C
왓맨 3MM  크로마토그래피 용지피셔 사이언티브05-716-6H
<강>플라이 주식<강>전체 유전자형<강>주식 번호<스트롱>출처
코르4w*; P{neoFRT}43D cora4/CyO52232BDSC
W1118w[1118]5905BDSC
Solution<강>레시피
10배 PBSNaCl 90g, Na2HPO4 20g, NaH2PO4 8.3g을 혼합합니다. H2O와 dH20을 1L에 섞습니다. 필터를 멸균합니다. 면역염색 세척 단계에서는 dH2O로 1배로 희석하세요.
10% 트라이톤 X-100 용액플랫폼 록커에 1ml Triton X-100과 9ml dH2O를 섞어 녹일 때까지 섞으세요. 실온에서 보관하세요.
표백제 50%배아를 탈코리온화하기 전에 상업용 표백제 10ml(7.5% 차가염소산나트륨)와 물 10ml를 섞으세요.
사과 주스 접시15g 초파리 한천을 725ml dH2O에 삶으세요. 설탕 25g과 사과 주스 250ml를 넣고 잘 섞을 때까지 섞습니다. 용액을 55도까지 식힌 후 1.3g 테고셉트를 넣고 부드럽게 섞으세요. 60 x 15 크기의 페트리 플레이트에 부어 식힙힙니다. 4도에서 보관하세요.
차단 해법15개의 원뿔형 튜브에 1X PBS 100 ul과 100 ul 100% Triton X-100, Normal Donkey Serum 100 ul을 섞어 15개의 원뿔형 튜브에 넣으세요.
배아 세척 용액70g NaCl과 2ml Triton X-100을 dH2O에 섞어 10X 배아 세척액을 만드세요. dH2O로 1배로 희석해 작용을 원합니다.
수정전자레인지에 1X PBS 10ml를 예열하세요. 0.4 g 를 더합니다; 파라포름알데히드와 피펫을 섞으려고 합니다. 14N NaOH 10 ul을 첨가해 빠르게 녹여. 녹을 때까지 90도 히트 블록 위에 올려놓으세요. 고체 파라포름알데히드가 사라지면 14N HCL 10ul을 추가해 pH를 중성으로 조정합니다. 파라포름알데히드를 사용할 때는 항상 실험복, 장갑, 고글을 착용하세요.
매체 장착글리세롤 9ml와 1M 트리스 염기 pH 8.0을 섞으세요. n-프로필-갈레이트 0.05g 추가, nbsp; 섞고 가열해서 녹여요. 에펜도르프 튜브에 0.5ml를 분리해 넣습니다.
로다민 덱스트란 용액로다민 표지된 10 kDa 덱트론을 0.5M 인산나트륨, pH 7.5 및 5 mM 염화칼륨에 녹여 신선한 염료 용액을 만듭니다.
효모 페이스트상업용 효모(레드 스타) 50g에 자당 한 꼬집, 그리고 충분한 물을 섞어 걸쭉한 반죽을 만듭니다. 4도에서 보관하세요.

참고문헌

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  1. Farquhar, M. G., Palade, G. E. Junctional complexes in various epithelia. J. Cell Biol. 17, 375-412 (1963).
  2. Lord, B. A., DiBona, D. R. Role of the septate junction in the regulation of paracellular transepithelial flow. J. Cell Biol. 71 (3), 967-972 (1976).
  3. Noirot-Timothée, C., Smith, D. S., Cayer, M. L., Noirot, C. Septate junctions in insects: comparison between intercellular and intramembranous structures. Tissue Cell. 10 (1), 125-136 (1978).
  4. Rouka, E., et al. The Drosophila septate junction beyond barrier function: review of the literature, prediction of human orthologs of SJ-related proteins and identification of protein domain families. Acta Physiol. 231 (1), e13527(2021).
  5. Poodry, C., Schneiderman, H. The ultrastructure of the developing leg of Drosophila melanogaster. Roux Arch. Dev. Biol. 166, 1-44 (1970).
  6. Tepass, U., Hartenstein, V. The development of cellular junctions in the Drosophila embryo. Dev. Biol. 161 (2), 563-596 (1994).
  7. Rice, C., De, O., Alhadyian, H., Hall, S., Ward, R. E. Expanding the junction: new insights into non-occluding roles for septate junction proteins during development. J. Dev. Biol. 9 (1), 11(2021).
  8. Baumgartner, S., et al. A Drosophila neurexin is required for septate junction and blood-nerve barrier formation and function. Cell. 87 (6), 1059-1068 (1996).
  9. Fehon, R. G., Dawson, I. A., Artavanis-Tsakonas, S. A Drosophila homologue of membrane-skeleton protein 4.1 is associated with septate junctions and is encoded by the coracle gene. Development. 120 (3), 545-557 (1994).
  10. Hall, S., et al. Macroglobulin complement-related (Mcr) encodes a protein required for septate junction organization and paracellular barrier function in Drosophila. Development. 141, 889-898 (2014).
  11. Nelson, K. S., Furuse, M., Beitel, G. J. The Drosophila claudin Kune-kune is required for septate junction organization and tracheal tube size control. Genetics. 185 (3), 831-839 (2010).
  12. Paul, S. M., Ternet, M., Salvaterra, P. M., Beitel, G. J. The Na⁺/K⁺-ATPase is required for septate junction function and epithelial tube-size control in the Drosophila tracheal system. Development. 130 (20), 4963-4974 (2003).
  13. Nilton, A., et al. coiled and crimpled are three Ly6-like proteins required for proper localization of septate junction components. Development. 137 (14), 2427-2437 (2010).
  14. Tiklova, K., Senti, K. A., Wang, S., Gräslund, A., Samakovlis, C. Epithelial septate junction assembly relies on melanotransferrin iron binding and endocytosis in Drosophila. Nat. Cell Biol. 12 (11), 1071-1077 (2010).
  15. Bilder, D., Schober, M., Perrimon, N. Integrated activity of PDZ protein complexes regulates epithelial polarity. Nat. Cell Biol. 5 (1), 53-58 (2003).
  16. Woods, D. F., Bryant, P. J. The discs-large tumor suppressor gene of Drosophila encodes a guanylate kinase homolog localized at septate junctions. Cell. 66 (3), 451-464 (1991).
  17. Hall, S., Ward, R. E. Septate junction proteins play essential roles in morphogenesis throughout embryonic development in Drosophila. G3 (Bethesda). 6 (8), 2375-2384 (2016).
  18. Genova, J. L., Fehon, R. G. Neuroglian, Gliotactin, and the Na⁺/K⁺-ATPase are essential for septate junction function in Drosophila. J. Cell Biol. 161 (5), 979-989 (2003).
  19. Ward, R. E., Lamb, R. S., Fehon, R. G. A conserved functional domain of Drosophila coracle is required for localization at the septate junction and has membrane-organizing activity. J. Cell Biol. 140 (6), 1463-1473 (1998).
  20. De, O., et al. Septate junction proteins are required for cell shape changes, actomyosin reorganization and cell adhesion during dorsal closure in Drosophila. Front. Cell Dev. Biol. 10, 947444(2022).
  21. Laprise, P., et al. The FERM protein Yurt is a negative regulatory component of the Crumbs complex that controls epithelial polarity and apical membrane size. Dev. Cell. 11 (3), 363-374 (2006).
  22. Laprise, P., et al. Neurexin IV and the Na⁺/K⁺-ATPase form a novel group of epithelial polarity proteins. Nature. 459 (7250), 1141-1145 (2009).
  23. Oshima, K., Fehon, R. G. Analysis of protein dynamics within the septate junction reveals a highly stable core protein complex that does not include the basolateral polarity protein Discs large. J. Cell Sci. 124 (Pt 16), 2861-2871 (2011).
  24. Hartenstein, V. Atlas of Drosophila Development. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1993).
  25. Lamb, R. S., Ward, R. E., Schweizer, L., Fehon, R. G. Drosophila coracle, a member of the protein 4.1 superfamily, has essential structural functions in septate junctions and developmental roles in epithelial cells. Mol. Biol. Cell. 9 (12), 3505-3519 (1998).
  26. Davis, M. J., Talbot, D., Jemc, J. Assay for blood-brain barrier integrity in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (151), e60233(2019).
  27. Laprise, P., et al. Epithelial polarity proteins regulate Drosophila tracheal tube size in parallel to the luminal matrix pathway. Curr. Biol. 20 (1), 55-61 (2010).
  28. Batz, T., Förster, D., Luschnig, S. The transmembrane protein macroglobulin complement-related is essential for septate junction formation and epithelial barrier function in Drosophila. Development. 141 (4), 899-908 (2014).
  29. Behr, M., Riedel, D., Schuh, R. The claudin-like Megatrachea is essential in septate junctions for epithelial barrier function in Drosophila. Dev. Cell. 5 (4), 611-620 (2003).
  30. Wu, V. M., et al. Sinuous is a Drosophila claudin required for septate junction organization and epithelial tube size control. J. Cell Biol. 164 (2), 313-323 (2004).
  31. Wu, V. M., et al. Drosophila Varicose, a member of a new subgroup of basolateral MAGUKs, is required for septate junctions and tracheal morphogenesis. Development. 134 (5), 999-1009 (2007).
  32. Jaspers, M. H., et al. The claudin Megatrachea protein complex. J. Biol. Chem. 287 (44), 36756-36765 (2012).
  33. Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448 (7150), 151-156 (2007).
  34. Zirin, J., et al. Large-scale transgenic Drosophila resource collections for loss- and gain-of-function studies. Genetics. 214 (4), 755-767 (2020).

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