일회용 결찰 클립을 사용한 쥐의 소매 위절제술

요약

여기서는 일회용 결찰 클립을 이용해 마우스 슬리브 위절제술 모델을 만드는 프로토콜을 소개합니다. 이 모델은 낮은 수술 후 사망률, 짧은 수술 기간, 그리고 전통적인 봉합 기법과 비교할 만한 치료 결과를 보여줍니다.

초록

현재 마우스 모델의 슬리브 위절제술(SG)은 수작업 봉합에 크게 의존하고 있는데, 이는 기술적으로 까다로운 절차이며 수술 시간이 길고, 수술 전후 사망률이 높으며, 학습 곡선도 가파릅니다. 이로 인해 비수술 연구자들의 접근성이 제한됩니다. 이 병목 현상을 해결하기 위해 임상용 위장 수술에서 흔히 사용되는 일회용 결찰 클립을 사용한 단순화된 SG 프로토콜을 개발했습니다. 식이 유발 비만 C57BL/6J 마우스에서 클립 기반 접근법은 평균 수술 시간을 >50% 단축시켰으며(3.2± 20.9 대 3.2 대 43.9 ± 3.0분) 단축했으며, 전통적인 봉합술에 비해 12주 생존율을 유의미하게 개선했습니다. 이 방법은 지속적인 체중 감량, 포도당 내성 개선, 인슐린 감수성 증가, 간 지방증 감소 등 동일한 대사 결과를 달성했습니다. 특히, 이 모델은 마우스 용도로는 종종 구하기 어려운 특수 미세수술 기술이나 스테이플링 장치가 필요하지 않습니다. 특히 고급 외과 교육이 없는 연구자들에게 이 클립 기반 방법을 권장하며, 비만 수술의 기전적 연구에서 절차적 효율성과 재현성을 우선시합니다. 직접적인 임상적 번역 가능성을 원하는 외과의사에게는 봉합 기반 기법이 여전히 선호되지만, 수술 전후 관리가 더 엄격합니다.

서론

비만 수술은 극심한 비만과 그에 따른 합병증에 가장 효과적인 중재법으로 널리 인정받고 있습니다. 마우스 슬리브 위절제술(SG) 모델은 비만 수술과 관련된 병태생리학적 변화와 잠재적 메커니즘을 연구하는 데 유용한 도구입니다. 이 모델은 유전자 노크아웃이나 과발현과 같은 유전자 변형 마우스 품종을 사용할 수 있다는 점에서 유리합니다. 복제가 쉽고, 실험 조건을 엄격히 통제할 수 있으며, 실험적 조작을 용이하게 하는 마우스 모델은 임상 번역에 필수적입니다^.

기존 마우스 SG 모델은 봉합 기반 기술을 이용해 관형 위 주머니를 제작합니다. 이 방법론은 여러 정밀 수술 단계를 포함하며, 일반적으로 상당한 기술적 숙련도를 요구합니다. 대표적인 기법으로는 SG-단층 ^3,4와 SG-렘버트 ^5,6이 있으며, 평균 수술 시간은 약 30분에서 45분⁷분입니다. 따라서 10마리의 마우스 코호트에서 SG를 수행하는 데는 일반적으로 5-7.5시간의 수술 시간이 필요합니다. 여러 실험 코호트를 포함하는 연구에서는 누적 수술 세션이 2-3일 연속으로 이어질 수 있습니다. 장기적인 절차 일정은 수술 전후 상태의 물류적 제약과 변동성을 초래하여 실험 일관성과 수술 후 모니터링에 영향을 줄 수 있습니다. 연구진은 더 접근성 높은 마우스-SG 모델을 개발하기 위한 대안적 접근법을 모색해 왔습니다. 스테이플러 보조 (SG-스테이플러)^7,8 및 클립 기반(SG-클립)^9,10,11 접근법은 주목할 만한 개선을 나타냅니다. 이 방법들은 위 주머니 형성의 특정 측면을 간소화하고 수동 봉합에 따른 기술적 요구를 줄여, 다양한 수술 경험이 있는 연구 환경에서 더 널리 보행될 수 있도록 지원합니다. SG-스테이플러 기술은 적절한 크기의 스테이플링 장치가 제한적이기 때문에 쥐 모델에서 더 자주 사용되기 때문에 마우스 응용에서 실질적인 한계에 직면합니다. SG-클립 접근법과 관련해, 이전 연구에서는 일반적으로 1개에서 2개의 티타늄 클립과 보조 봉합사^{9, 10, 11}을 사용했습니다. 표준 티타늄 클립의 매끄러운 내부 표면은 조직 부착에 최적화가 불가능해 절차적 신뢰성과 위 완전성을 보장하기 위해 보조 고정이 필요합니다.

SG-스테이플러 및 SG-클립 모델의 특징을 바탕으로, 이 프로토콜은 일회용 결찰 클립을 사용해 개발된 쥐 SG 모델을 제시합니다. 이 클립들은 담낭절제술, 충수절제술 및 기타 위장관 수술에서 흔히 사용됩니다. 이 시술에서는 잔류 낭관, 충수근, 혈관 등 조직을 단단히 고정하여 추가적인 봉합 보강이 필요 없습니다. 쥐의 위 길이에 맞는 크기도 있습니다. 이 새로운 SG-클립 모델은 간단하고 신뢰할 수 있으며, 전통적인 봉합사 모델과 견줄 만한 치료 효과를 보여줍니다.

특히, 임상 수술 기법을 재현하거나, 봉합사의 생체역학적 또는 생물학적 효과를 연구하거나, 최대한의 해부학적 정밀도가 요구되는 연구에서는 봉합 기반 SG가 여전히 선호됩니다. 고급 미세수술 기술을 가진 연구자에게는 손재봉 방법이 인간 시술을 반영하여 번역 정확도에 더 적합합니다. 반면, 결찰 클립 모델은 실험적 엄격성을 유지하면서도 수술 전문성이 제한된 경우 다양한 연구 환경에서 마우스 SG의 적용 가능성을 넓히는 간소화되고 효율적이며 접근하기 쉬운 대안을 제공합니다.

프로토콜

이 프로토콜은 국제 동물복지 윤리 지침을 준수하며, 지난대학교 실험동물복지 및 윤리 위원회(승인 번호: 20240227-0073)의 승인을 받았습니다.

참고: 8주 된 수컷 C57BL/6J 야생형 쥐 30마리, 몸무게 22-25g이 특정 병원체가 없는 환경에서 20-26°C의 실온과 12/12시간의 낮과 밤을 번갈아 유지하였습니다. 고지방 식단에 4주간 적응한 후, 쥐들은 무작위로 SC(SG with clip), SS(SG with 봉합), SH(SH) 그룹에 배정되었으며, 각 그룹에 10마리씩 배정되었습니다.

1. 수술 전 준비

1. 2일간 액체식으로 바꾸고 수술 전에는 단식하지 마세요.
   참고: 수술 전 액체식으로 전환하면 쥐의 위에서 고형 음식이 배출되는 것을 촉진하여 수술 중 오염을 줄일 수 있습니다. 또한, 수술 후 액체 영양에 더 잘 적응하여 충분한 에너지 섭취를 보장합니다.
2. 마취 마스크가 장착된 수술대 위에 온열 패드를 고정하고 온도를 ~37 °C로 조절하세요.
3. 테이블을 75% 알코올로 닦으세요.
4. 100mL의 생리식염수 중 1mL를 추출하여 페니실린 가루를 녹입니다. 그 후 남은 99mL의 천연 식염수에 전체 용해된 페니실린 용액을 주입하여 800,000 IU/100 mL 농도의 페니실린 용액을 만듭니다.
5. 쥐를 3% 이소플루란과 0.5 l/min 산소로 약 30초간 마취한 후, 이소플루란 농도를 1.5%로 유지한 마취 마스크에 머리를 착용합니다.
6. 가슴과 복부 피부를 아네르디안 용액으로 소독하고 멸균 수건으로 덮으세요.

2. 외과 절차

1. 정중 복강 절개술: 피부를 상골 돌기에서 약 2cm 아래 들어 올리고 정중선을 따라 1.5cm 절개를 합니다. 백선을 따라 근육이 없는 부분을 견인기가 들어갈 만큼(약 1.5cm) 절개하세요.
2. 위 외부화: 젖은 면봉을 사용해 대장과 소장 일부를 골반강 쪽으로 밀어 넣습니다. 무딘 핀셋으로 복부 절개 부위를 부드럽게 들어 올리고, 젖은 거즈로 잘라낸 새 구멍 수건으로 덮으세요. 간위인대, 위비장인대, 위동과 췌장의 부분 혈관 연결을 신중하게 박리한 후 전기응고제로 절개합니다.
   참고: 위 외부화 및 절개 시 추가 드레이프나 적시에 적시 젖은 솜뭉치를 설치하면 위 내용물로 인한 오염을 효과적으로 줄일 수 있습니다.
3. 위 더 큰 곡률을 따라 절제 범위를 결정하는데, 식도에서 3mm 떨어진 기저부와 유문에서 근위부에 3mm 떨어진 곳입니다.
4. SC 그룹에 대해:
   1. 일회용 결찰 클립과 부착기를 절단 부위 범위에 배치합니다; 클램프 위치가 식도와 유문에서 떨어지는 거리를 신중히 재정한 후 클램프를 합니다.
      참고: 절단 전에 절제선은 조수와 운영자가 협력하여 정확한 절제 마진을 확보해야 합니다.
   2. 위 주변에 젖은 솜뭉치를 미리 놓아 위 내용물이 누수되는 것을 방지합니다; 그 후 결찰 클립의 큰 곡률 쪽에서 위 조직의 약 80%를 빠르게 절단했습니다.
   3. 절개 부위를 Anerdian 면봉으로 세 번 소독하고 식염수 면봉으로 한 번 닦아내세요(그림 1).
5. SS 그룹에 대해:
   1. 위체를 절단 범위에 맞게 클램프로 고정하세요.
   2. 위 주변에 젖은 솜뭉치를 미리 놓아 위 내용물이 누수되는 것을 방지합니다; 그 다음 안과 가위를 사용해 곡률이 큰 쪽의 위 조직 약 80%를 빠르게 절단합니다.
   3. 겸자를 열고 위 내용물을 식염수 면봉으로 깨끗이 닦으세요.
   4. 6-0 흡수성 외과 봉합사를 단일 층 연속 기법으로 두 번 봉합합니다. 첫 번째 연속 봉합은 절개 가장자리에 수직으로 2-3mm 간격으로 삽입하여 위벽 전체 두께를 통과하고 반대쪽 등거리에서 나오게 하여 시행합니다. 초기 실밥은 수술용 매듭으로 고정하고, 조직이 주름이나 틈을 방지하기 위해 균일한 장력 아래 2mm 간격으로 교대로 봉합을 이어가며, 3-4번 스쿼터로 마무리합니다.
   5. 두 번째 연속 봉합은 오프셋 패턴을 사용해 첫 번째 봉합과 평행하게 하여 덮개를 강화하고 교합 간격과 장력을 일정하게 유지하면서 겹침이나 비틀림을 방지하세요.
      참고: 솜뭉치나 거즈가 붉어지면 특히 위 절개 부위에서 상당한 출혈이 있음을 나타냅니다; 봉합 전에 절개 부위의 적절한 전기응고가 있어야 지혈을 달성할 수 있습니다.
   6. 절개 부위를 Anerdian 면봉으로 세 번 소독한 후 생리식염수 면봉으로 한 번 닦아내세요(그림 2).
6. SH 그룹에 대해:
   1. 위를 클램프 작업만 하고 10분 후에 해제하세요.
   2. 위를 복강에 올바른 위치로 되돌려 5-0 수술적 봉합으로 고유근과 피부를 봉합한 뒤 멸균하고 시술을 종료하세요.
      참고: 모든 마우스는 수술 후 체중과 음식 섭취량을 효과적으로 모니터링하기 위해 1주일 이내에 수술을 받았습니다.

3. 수술 후 관리

1. 쥐들을 순수 산소 유도 상자에 넣으세요. 약 2분 후에 깨어날 수 있습니다. 쥐를 제거하고 온열 패드 위에 올려놓으세요. 의식과 호흡 상태를 면밀히 관찰한 후, 움직일 수 있을 때 다시 케이지로 돌려보내세요.
2. 포도당 식염수 용액(포도당 5%, 염화나트륨 4.5%)을 20 mL/kg 용량으로 피하 주사 한 번 투여합니다.
3. 수술 후 의식을 회복하기 직전에 4 mg/kg(농도: 0.4 mg/mL)의 멜록시캄을 피하 주사로 투여합니다. 이 주사를 3일 연속으로 24시간마다 반복하세요.
4. 수술 후 처음 3일간 애보트 영양 용액과 고지방 식단을 제공하세요; 수술 후 4일째에는 식수로 영양 용액을 마시는 것으로 대체하세요.
5. 감염을 예방하기 위해 수술 후 3일 연속으로 페니실린(30,000 U/kg)을 근육 주사로 투여하세요.
6. 일반적인 상태에 대해 매일 쥐를 관찰하고 필요시 신속한 증상 치료를 제공하세요.

4. 감지 표시기

참고: 마우스에서 4주간 생존하고 중대한 수술 후 합병증이 없었다면 성공적인 수술로 간주됩니다.

1. 수술 시 수술 기간과 무게를 기록하고, 각 그룹의 체중, 음식 섭취, 사망률, 심각한 합병증 발생 여부를 수술 후 12주 동안 매주 모니터링합니다.
2. 12주차에 복강내 포도당 내성 검사(ipGTT), 인슐린 내성 검사(ITT), 소장 통과 검사와 같은 대사 및 장 이동 평가를 수행하세요.
   1. ipGTT용: 빠른 마우스를 12시간 동안 사용하세요. 꼬리 끝에서 1mm 길이의 마디를 잘라내고 공복 혈당(시간 0)을 측정하세요. 20% 포도당 용액을 복강 내 2g/kg 체중 용량으로 투여합니다. 투여 후 15분, 30분, 60분, 90분, 120분 시점에 혈당 수치를 측정하세요.
   2. ITT에서는 6시간 동안 빠른 마우스를 사용했습니다. 공복 혈당 수치를 측정하세요. 복막 내 주사로 0.075 U/mL의 인슐린 용액(0.075 U/mL)을 체중 0.5 U/kg 용량으로 투여합니다. 주사 후 15분, 30분, 60분, 90분, 120분 동안 혈당 수치를 측정하세요.
   3. 소장 이동 시: 빠른 쥐를 12시간 동안 사용하세요. 10% 탄소 분말 현탁액을 10 mL/kg 체중 용량으로 경구 가베지로 투여합니다. 30분 후에는 쥐를 안락사시키세요. 유문에서 맹장의 근위 끝까지 온전한 소장을 절제합니다. 장 통과 비율을 유문에서 탄소 현탁 선두까지의 거리를 소장 전체 길이로 나눈 값으로 측정합니다.
3. 쥐를 희생시켜 소리막 위의 해부학적 구조와 소장의 형태를 관찰하세요.
4. 간 샘플을 헤마톡실린-에오신(HE) 염색과 오일 레드 O 염색으로 염색하고, 혈청 총콜레스테롤(TC), 중성지방(TG), 자유 지방산(FFA)을 검출하기 위해 혈액 샘플을 채취합니다.

5. 통계 분석

1. 모든 연속 변수(체중, 음식 섭취, 소장 통과 비율, 혈당 수치, 혈청학적 지표)를 평균 ± 표준편차로 표현합니다.
2. 종단 체중 및 음식 섭취 데이터를 양방향 반복 측정 ANOVA(요인: 그룹과 시간)를 사용하여 분석합니다.
3. 소장 이동 비율과 혈청학적 매개변수를 일원 ANOVA를 사용하여 분석합니다.
4. 복강내 포도당 내성 검사(ipGTT) 및 인슐린 내성 검사(ITT) 데이터의 경우, 각 피험자별로 곡선 아래 면적(AUC)을 계산하고 일방향 ANOVA를 사용해 그룹 AUC 값을 비교합니다.
5. 상당한 ANOVA 결과가 나온 후 Bonferroni 보정과 사후 쌍별 비교를 수행하십시오.
6. 통계적 유의성을 p < 0.05로 정의합니다. 모든 통계 분석은 GraphPad Prism 9(GraphPad 소프트웨어, 샌디에이고, 캘리포니아, 미국 )를 사용하여 수행하세요.

결과

수술 성공 기준은 수술 후 4주 이상 생존한 쥐로 정의되었습니다. 수술 후 4주 이후 발생한 사망은 합병증으로 추정됩니다. 수술 후 12주 연속 관찰 동안, SC 그룹에서 수술 후 24일에 봉합으로 인한 상처 및 복부 감염으로 사망한 1마리가 기록되었으나, 나머지 9마리는 12주까지 생존했습니다. SS 그룹에서는 총 5마리의 쥐가 사망했으며, 사망 시점은 수술 후 5일, 7일, 12일차와 수술 후 7주, 12주에 발생했습니다. 처음 두 건의 사망은 과도한 약화로 추정되었고, 세 번째는 소매위 폐색과 감염, 마지막 두 건은 심각한 복부 접착성 장 폐색으로 인한 사망이었다. SH 그룹의 모든 마우스는 수술 후 12주까지 생존했습니다(그림 3). 수술 후 생존율은 SC 그룹이 SS 그룹에 비해 유의하게 높았음이 명백하였다.

SC 그룹에서 생쥐의 높은 수술 후 생존율은 주로...

토론

일회용 결찰 클립을 사용한 쥐 SG 모델이 구축되어 간단하고 효율적이며 재현 가능한 수술 절차가 이루어졌습니다. 클립 기반 기법은 기존 봉합 기반 SG 모델과 견줄 만한 치료 효과를 지속적으로 입증했으며, 수술 시간을 크게 단축하고 수술 후 생존율을 향상시켰습니다.

마우스 SG-봉합 모델의 수술 기법은 본질적으로 복잡하지 않으며, 혈관 봉합에 경험이 많은 많은 외과의사들이 성공적으로 시술할 수 있습니다. 82개 연구를 포함한 리뷰에 따르면 SG 모델¹²에서 평균 수술 후 사망률이 17%였습니다. 불안정하거나 복제하기 어려운 동물 모델은 연구 도구로 적합하지 않습니다. 전통적인 쥐 SG-봉합 모델은 복잡하고 시간이 많이 소요되는 조작, 가파른 학습 곡선, 그리고 정교한 해부학의 영향을 많이 받습니다. 첫째, 쥐의 위 내 작은 혈관들이 밀집되어 있어 절개 및 봉합 시 상당한 출혈을...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

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