마이크로플루이딕 시스템을 이용한 영양 배지의 영향이 Pseudomonas aeruginosa 바이오필름 개발에 미치는 영향을 실시간으로 시각화하기

요약

이 프로토콜은 마이크로채널 내 정상 유동 환경에서 영양소 배지(TSB) 및 최소(FAB) 영양 배지 조성이 Pseudomonas aeruginosa PAO1 및 PA14 바이오필름 형성에 미치는 영향을 평가합니다.

초록

병원성 박테리아인 Pseudomonas aeruginosa 는 수많은 병원 감염의 주요 원인이며, 항생제 내성이 커지면서 중대한 공중보건 위협이 되고 있습니다. 이 글은 두 가지 주요 P. aeruginosa(P. aeruginosa ) 균주인 PAO1과 PA14에서 바이오필름 발생을 실시간으로 시각화하고 정량화하기 위해 마이크로플루이딕 시스템을 사용하는 포괄적인 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 광학 투명 다중 채널 마이크로채널 플레이트를 사용하여 박테리아 배양물을 연속적이고 일정한 배지에 노출시키는데, 여기에는 삼립산 대두 육수(TSB) 또는 변형된 최소 정교 혐산소 육수(FAB)를 포함한 다양한 탄소 원천 농도가 포함되어 임상 환경에서 발생하는 조건을 모방합니다. 24시간 동안 자동 실시간 영상 기술로 바이오필름의 표면적 범위, 두께, 표면 거칠기를 매우 재현 가능하게 포착합니다. 실험 목적은 두 균주 모두의 바이오필름 형성이 영양 배지 조성 변화에 크게 영향을 받는다는 것을 입증하는 데 있습니다. 이 시각화 프로토콜의 목표는 연구자들이 안정된 층류 조건에서 바이오필름 역학을 연구할 수 있는 방법을 제공하는 것이며, 얻은 통찰을 활용해 병원 내에서 초기 단계 P. aeruginosa 바이오필름을 근절하기 위한 대체 비항균 전략 개발에 활용할 수 있습니다.

서론

이 방법의 목표는 두 가지 다른 배양 배지, 즉 삼속 대두 육수(TSB)와 변형 최소 정밀 혐산소 육수(FAB)가 두 가지 Pseudomonas aeruginosa 균주인 PAO1과 PA14의 바이오필름 성장에 미치는 영향을 관찰하는 것입니다. P. aeruginosa PAO1과 PA14는 모두 흔한 실험실 참조 균주이지만, PA14 균주는 식물에서 무척추동물에 이르기까지 숙주 중 더 많은 비율을 감염시킵니다¹. TSB 영양 육수는 2.5 g/L 포도당을 탄소원으로 사용하는 범용 배양 배양지로, 유기 질소와 자연 당 공급을 위한 카제인과 대두 펩톤 조성 덕분에 다양한 박테리아를 배양할 수 있으며, 삼투압 평형 유지를 위한 염화나트륨도^{포함됩니다.} 반면 최소 FAB 배지는 단일 탄소원의 최소 농도(50배 환원)로 조제되어 혐기성 박테리아의 성장 요구를 탐구합니다. PAO1과 PA14 변형 모두 단방향 층류 흐름에 노출되어 벽 전단 응력이 0.01 Pa로 낮았습니다. 이 전단 응력 값은 낭포성 섬유증 환자의 기관지와 위장관 등 P. aeruginosa가 정착한 부위에서 자주 나타납니다. 바이오필름 성장은 실시간 바이오필름 비율 표면적 덮개, 두께, 표면 거칠기의 산술 평균을 평가하여 24시간 동안 측정되었습니다.

P. aeruginosa 바이오필름은 병원 내 감염의 상당 부분을 차지하며, 낭포성 섬유증 환자의 주요 사망 원인입니다 ^3,4,5. 이전 연구들은 탄소원 수준이 박테리아 바이오필름 발달에 미치는 영향에 대한 중요한 역할을 간과했고, 전단 응력 값을 사용해 P. aeruginosa 감염 부위를 대표하지 않거나, 실험 후 바이오필름의 동역학적 및 형태학적 분석만 수행했습니다 ^6,7. 이러한 한계는 이 방법에서 방포성 섬유증 환자에서 발견되는 생리적 환경을 매우 유사하게 재현하는 미세유체 채널 내에서 정상 상태 유동 조건 하에서 바이오필름 현상의 실시간 영상을 활용하여 해결됩니다.

이 방법은 바이오필름 발생을 연구하는 데 사용되는 대체 기법에 비해 상당한 장점을 제공합니다. 24시간 바이오필름 성장 기간 동안 실시간 영상 촬영을 적용하면 건조나 화학적 변경이 필요 없으므로 생중하는 바이오필름이 방해받지 않도록 조성 변화를 피하고, 샘플 조작이 필요한 방법보다 더 대표적인 결과를 얻을 수^{있습니다.} 또한, 일정한 유체역학적 유동 조건을 적용하고 탄소원 농도를 크게 변화시킴으로써, 이 절차는 P. aeruginosa 병원 감염 부위에서 발견되는 생리학적 환경을 보다 정확하게 재현합니다. 이로 인해 96웰 마이크로타이터 플레이트나 쿠폰과 같은 정적 분석법과 비교할 때, 유체 흐름이 바이오^{필름 형성에} 미치는 중요한 영향을 포착하지 못하는 방법보다 더 대표적인 방법입니다(^9,10,11).

사용된 마이크로유체 장치는 기관지와 기관지¹² 같은 폐의 일부 부위와 크기가 유사하기 때문에 특별히 선택되었습니다. 더불어, P. aeruginosa는 심각한 화상 환자에게 큰 우려 사항으로, 혈당 수치가 정상 범위에서 크게 변동할 수 있습니다^13,14.

이 프로토콜은 P . aeruginosa의 두 균주를 구체적으로 사용하지만, 유사한 조건에서 감염을 일으키거나 부위에 정착하는 다른 박테리아의 초기 발달 연구에도 적용 가능합니다. 또한 다른 영양 매체 조성과 흐름 조건(예: 맥동성 및 진동 흐름, 더 높은 벽 전단 값)도 같은 방법론으로 조사할 수 있습니다.

프로토콜

1. 유리 제품 세척

1. 배지와 한천용으로 사용할 200mL 유리병 두 개와 1L 유리병 세 개를 10% 염산(HCl) 목욕에 실온에서 약 5분간 담가세요.
   주의: 염산은 부식성이 있습니다. 모든 산 처리는 화학 연기 후드에서 적절한 개인 보호 장비(실험실 가운, 장갑, 안경 보호구)를 착용하세요.
2. 그 후 HCl 욕조에서 유리 기구를 꺼내 수돗물로 두 번, 증류수(dH₂O)로 한 번 헹군습니다.

2. 트립틱 대두 육수 배지 준비

1. TSB 용액을 준비하고, 깨끗한 무게 측정 보트와 정밀 저울을 사용해 TSB 가루 6g/200 mL를 무게로 재세요.
   참고: 사용되는 TSB 분말의 조성은 다음과 같습니다: 포도당(2.5g∙^L-1), 인산이칼륨(2.5g∙^L-1), 췌장 소화액 카제인(17g∙^L-1), 대두 가루의 파파익 소화액(3.0g∙^L-1), 그리고 염화나트륨(5.0g∙^L-1).
2. 측정 실린더를 사용해 dH₂O 200mL를 측정한 후 미리 세척된 유리병 중 하나에 부으세요.
3. TSB 6g을 200mL dH_2O가 들어 있는 깨끗한 유리병에 넣고, 병을 단단히 밀봉한 후 약 2분간 혼합하여 분말을 녹여 TSB 용액 배지를 만듭니다.
4. 121°C, 1.5기압 압력에서 15–20분간 오토클레이브 TSB 매체 용액을 사용해 용액을 멸균합니다.
   참고: (일시정지) TSB 용액은 사용 사이에 실온(약 20°C)에서 보관할 수 있으며 향후 실험에 사용할 수 있습니다.

3. 엄격한 혐기성 육수 배지 준비

1. FAB 매체 트레이스 금속 용액을 준비하세요.
   1. 0.5–210g 사이의 질량을 재는 것은 별도의 깨끗한 저울과 주걱을 사용하고, 0.001–0.5g 사이의 질량을 재는 것은 정밀 저울, 0.001–0.5 g 사이의 무게를 재는 것은 분석용 저울을 사용하세요. 다음 성분과 그 양을 측정하세요: CaSO 4.2H ₂O (200 mg∙^L-1), FeSO_{4.7H 2}O (200 mg∙^L-1), MnSO₄. H₂O (20 mg∙^L-1), CuSO_{4.5H 2}O (20 mg∙^L-1), ZnSO_{4.7H 2}O (20 mg∙^L-1), CoSO_{4.7H 2}O (10 mg∙^L-1), NaMoO₄. H₂O (10 mg∙^L-1), 그리고 H₃BO₃ (5 mg∙^L-1)^7,9.
   2. 각 성분을 1L 세척된 유리병에 1L dH_2O가 들어 넣고 dH_2O와 충분히 섞습니다.
   3. 남은 두 개의 1L 멸균 유리병 각각에 1mL씩 1L dH_2O를 넣고 충분히 섞습니다.
2. 20 mM 시트레이트 보조 FAB를 조성하여 하룻밤 배양을 합니다
   1. 다음 성분과 그 양을 별도의 깨끗한 저울과 주걱으로 측정하라, 0.5-200g 사이의 질량을 측정할 때는 정밀 저울, 0.001-0.5g 사이의 질량을 측정할 때는 분석적 저울을 사용한다: 시트레이트나트륨(20 mM), (NH₄)₂SO₄ (2 g∙^L-1), Na₂HPO_{4.2H 2}O (6 g∙^L-1), KH₂PO₄ (3 g∙^L-1), NaCl (3 g∙^L-1), MgCl₂ (93 mg∙^L-1), CaCl₂ (11 mg∙^L-1)^7,9.
   2. 남은 1L 멸균 유리병 중 하나에 모든 성분을 넣으세요. 여기에는 1L dH,_2O, 그리고 1mL의 미량 금속 용액이 들어 있습니다.
   3. 충분히 섞으세요.
3. 바이오필름 성장을 위해 0.3 mM 포도당 보조 FAB를 준비합니다.
   1. 20 mM 시트레이트 나트륨을 0.3 mM 포도당으로 대체하세요. 3.2.1 단계에서 나열된 동일한 부품과 질량을 사용하세요.
   2. 남은 세척된 1L 유리병에 0.3 mM 포도당 FAB 성분을 1mL dH_2O와 1mL 미량 금속 용액에 넣고 잘 섞습니다.
4. 증기 온도 121°C, 압력 1.5기압에서 15-20분간 오토클레이브하여 매체를 멸균합니다.
   참고: (일시정지) FAB 매질 용액은 사용 사이에 실온(약 20°C)에서 보관할 수 있으며 향후 실험에 사용할 수 있습니다.

4. TSB 한천 준비

1. 정밀 저울과 세척된 무게 측정 보트, 주걱을 사용해 8g/200 mL의 TS 한천을 측정하세요.
2. 같은 정밀 저울을 사용해 별도의 무게 측정선에서 세균학 등급 한천 1g/200mL를 측정합니다.
3. 측정 실린더를 사용해 200mL의 dH_2O를 측정한 후 마지막으로 세척된 유리병에 부으세요.
4. 두 가지 한천 성분을 200mL dH_2O에 부어 잘 섞습니다.
5. 121°C, 1.5기압 압력에서 15–20분간 오토클레이브하여 매체를 멸균합니다.
   참고: (정지 지점) TSB 한천은 사용 사이에 실온(약 20°C)에서 보관할 수 있으며, 향후 실험에서 사용하기 전에 재가열이 필요합니다.

5. 페트리 접시 Pseudomonas Aeruginosa 배양

1. 한천을 전자레인지에서 약 5분간 녹이거나, 용액이 액체가 될 때까지 녹입니다.
2. 70% 에탄올 용액으로 클래스 II 안전 캐비닛 표면을 열고 소독하여 사용 준비를 마칩니다. 이 섹션의 모든 단계를 이 클래스 II 안전 캐비닛 내에서 수행하세요.
3. 한천 용액 25mL를 50mL 바이알에 담아 90mm 페트리 접시에 부은 후 한천이 굳을 때까지 기다립니다.
4. -80 °C 냉동고에서 P . aeruginosa PAO1 및 PA14 냉동 재고를 회수하세요. 육수를 인큐베이터에 약 5분간 넣고, 내용물이 완전히 해동될 때까지 보관하세요.
5. 녹인 P. aeruginosa 육즙 중 하나에 접종 루프를 담가 샘플을 한천 위에 펴 뿌리세요.
6. 다른 P. aeruginosa 균주에 대해 5.5단계를 반복하여 PAO1 균주와 PA14 균주를 사용하는 두 개의 별도 P. aeruginosa 페트리 배양을 만듭니다.
7. 각 페트리 접시에 P . aeruginosa 균주, 부활 날짜, 이니셜을 적은 후, 37°C에서 16–18시간 인큐베이터에 넣으세요.
   참고: (멈춤 지점) P. aeruginosa PAO1 및 PA14 페트리 접시는 4°C에서 최대 4주간 보관할 수 있으며 향후 실험에 사용할 수 있습니다.

6. Pseudomonas aeruginosa PAO1 및 PA14 글리세롤 스톡

1. 사용 시 클래스 II 안전 캐비닛을 열고 소독하며, 8개의 50mL 바이알을 선택하여 하룻밤 배양을 보관하세요.
2. 이전에 제작한 TSB와 시트레이트 나트륨 FAB 배지(섹션 3)를 사용하여, 8개의 바이알 중 4개에 5mL의 TSB 배지를 붓고, 나머지 4개의 바이알에는 시트레이트 최소 FAB 배지를 부었습니다.
3. 이전에 배양한 페트리 접시와 접종 루프를 사용해 P. aeruginosa PAO1 페트리 접시의 다섯 개의 개별 군락을 터치하여 TSB 바이알 중 하나로 옮깁니다. 이 과정을 시트레이트 FAB 배지와 P. aeruginosa PA14 품종의 페트리 접시에 대해 반복하세요.
4. 깨끗한 접종 루프를 나머지 4개의 TSB 및 시트레이트나트륨 FAB 배지 바이알에 직접 담가, 대조군을 형성합니다.
5. 8개의 바이알 모두 진동 인큐베이터에 16–18시간 동안 200 RPM, 37 °C에서 배양하고 명확하게 라벨을 붙입니다.
6. 배양 바이알을 회수하고, P. aeruginosa 접종자가 탁이 있는지 확인하며, 대조군으로 사용된 바이알이 깨끗한지 확인하세요.
7. 4000 × g에서 20°C에서 5분간 P. aeruginosa에 접종된 4개의 바이알을 원심분리하여 P. aeruginosa를 배양 배지에서 분리합니다. 원심분리기가 균형을 이루도록 하세요.
8. 상정액은 무시하고, 원심분리 후 15% 글리세롤 함유 용액 1mL, 150 μL 글리세롤, 850 μL 신선 TSB 또는 시트레이트 나트륨 FAB 배지와 함께 재현탁합니다.
9. 재현탁된 배양물을 1mL 바이알로 옮겨 -80 °C 냉동고에 보관합니다.
   참고: (잠시 멈춤) 글리세롤 재고는 장기 보관을 위해 -80°C에서 보관할 수 있으며, 향후 실험에 활용할 수 있습니다.

7. 야간 배양의 광학 밀도 측정

1. 6.1–6.5단계를 반복하며, TSB 미디엄 바이알 두 개만 사용하고, 하나는 대조군으로, 다른 하나는 PAO1 P. aeruginosa 균주로 사용합니다.
2. 클래스 II 안전 캐비닛 내에서 1 mL 분광광도계 바이알에 TSB 배지 1mL를 피펫 주입하고, 2번째 바이알에 0.9 mL의 TSB 배지를 옮기고, 1야간 배양액 0.1mL를 보충합니다.
3. 분광광도계를 600 nm의 광 파장으로 설정하고, 1 mL TSB 분광광도계 바이알을 사용해 기계를 보정하여 0.1 mL 현탁 바이알¹⁵의 광학 밀도를 측정합니다.
   1. 측정된 흡광도가 0.1이 아니면 필요한 서스펜션 부피를 다시 계산합니다.
      참고: 흡광도 0.1(V₁)을 얻기 위해 필요한 현탁 부피는 초기 0.1 mL 현탁 바이알 흡광 수치인 C₁, 현탁을 조정하는 원하는 흡광 C₂, 그리고 원하는 농축된 야간 현탁액 부피 V₂를 사용하여 계산할 수 있습니다:
      C₁V₁ = C₂V₂
      위 예에서 C₁ = 3.59, C₂ = 0.1, V₂ = 10 mL라면, 10 mL 용액에서 필요한 밤샘 부피는 0.279 mL가 됩니다.
4. TSB 배지 10mL를 50mL 바이알에 측정하고, 10mL 0.1 OD 600nm 현탁액을 만드는 데 필요한 부피와 동일한 부피의 TSB 배지를 제거하세요. 하룻밤 배양을 사용해 계산한 현탁 부피를 추가하고 약 5초간 소용돌이를 섞어 혼합합니다.
5. 10mL 조정된 현탁액 중 1mL를 분광광도계 바이알에 옮기고 흡수도를 0.1로 재측정합니다.
6. PA14와 TSB 배지, 그리고 P. aeruginosa 균주와 시트레이트 나트륨 FAB 배지에 대해 위 7.1–7.5를 반복합니다.

8. 생존 가능한 세포 수

1. dH₂O를 클래스 II 안전 캐비닛 내 정사각형 페트리 접시에 옮기고, 다중 채널 피펫을 사용해 투명한 96웰 폴리스티렌 플레이트¹⁶의 2–9열에 180 μL을 전달합니다.
2. 10 mL 0.1 OD 600 현탁액을 별도의 사각형 페트리 접시로 옮기고, 다중 채널 피펫을 사용해 96웰 폴리스티렌 플레이트 1번 열에 200 μL 현탁액을 전달합니다.
3. 96웰 폴리스티렌판 1열에서 멀티채널 피펫을 이용해 20μL 이상의 현탁액을 채널 2로 옮기고, 이어서 2번 채널에서 3번 채널로 희석된 현탁액 20 μL를 전달한 뒤, 9번 채널로 반복하여 현탁 희석을 ^10-1 에서 ^10-8로 희석시킵니다.
4. 50mL의 TS 한천(4절 및 5.1단계)을 바이알을 사용해 클래스 II 안전 캐비닛에 담아 정사각형 페트리 접시에 옮기고, 한천이 탁할 때까지 방치합니다.
5. 각 웰에서 2–9번 기둥을 따라 10 μL을 태운 천천 페트리 접시에 컬럼 형성으로 전달하며, 다중 채널 피펫트를 사용해 컬럼들이 서로 접촉하지 않도록 합니다.
6. TS 한천을 37°C에서 24시간 배양하고, 옮긴 희석액이 안정될 때까지 기다린 후 보관합니다.
7. 페트리 접시가 30개에서 300개 콜로니 사이인지 계산하여 밀리리터(mL)당 군락형성 단위(CFU)를 계산합니다.
8. 사용된 10 mL 현탁액의 희석 인자를 결정합니다; 이 경우 서스펜션은 1/10(0.1 OD 600)으로 희석되었습니다.
9. 각 도금 컬럼의 개별 희석 계수를 계산하세요. 이는 각 컬럼에 첨가된 희석된 현탁액의 양을 서스펜션 추가 후 컬럼의 전체 부피로 나눈 값입니다. 96웰 플레이트의 2번 기둥(페트리 접시 1번 기둥)의 경우, 20 μL/200 μL = 1/10입니다.
10. 각 열의 개별 희석 계수를 곱하여 전체 시리즈의 희석 계수를 계산합니다.
    참고: 이 경우 각 컬럼에서 다음 컬럼으로 20 μL가 전달되어 각 컬럼 우정의 총 부피가 200 μL이므로, 각 시리즈 희석은 1/10이 되었습니다. 전체 시리즈를 희석 1× ^10-8로 만들었습니다.
11. 96웰 플레이트에서 페트리 접시로 희석이 전달될 때 도금 희석 계수를 측정합니다. CFU/mL를 결정하려면 각 컬럼(10 μL)의 부피를 1 mL로 나누어 계산합니다. 이 경우: .
12. 최종 희석 계수를 원래의 현탁 희석 계수(0.1)에 전체 시리즈의 희석 계수(1 × ^10-8)와 도금 희석 계수()를 곱하여 결정합니다.
13. 원본 샘플에서 CFU∙^mL-1 을 계산하고, 플레이트 위의 CFU에 최종 희석 계수의 역수를 곱합니다.
    참고: 이 경우 200 CFU를 계산하면 200 × 1/1 × ^10-8 을 수행하여 CFU/mL는 2 ×^{10 10} CFU∙^{mL-1 17}이 됩니다.

9. 마이크로유체 시스템 설정 및 실험 실행

1. 각 P . aeruginosa 균주에 5mL 육수와 배양지를 접종하여 하룻밤 배양을 형성하고 37°C에서 16–18시간 배양합니다.
2. 마이크로플루이딕 시스템과 관련 소프트웨어를 설정하세요.
   1. 마이크로플루이딕 시스템 부품을 다음 순서로 활성화합니다: 전원 공급, 마이크로플루이딕 시스템 컨트롤러, CMOS 카메라, 인클로저 히터, 현미경, 컴퓨터 및 관련 모니터.
   2. 마이크로유체 소프트웨어를 활성화하고 멀티채널 플레이트 측면에 있는 48-웰 0–2 Pa 멀티채널 플레이트 관련 바코드를 입력하여 관련 제어 모듈 인터페이스를 시작하세요.
3. P. aeruginosa 다채널 플레이트 웰 접종 절차를 설정하세요.
   1. 하룻밤 배양된 광 밀도를 0.1 OD₆₀₀으로 조정하세요.
   2. 클래스 II 안전 캐비닛 내부에서 6개 채널 각각의 출구에 50 μL OD 600 서스펜션을 병렬로 전달합니다.
      참고: 이상 결과 식별 가능성을 극대화하기 위해 6개의 채널이 동시에 병렬로 실행되었습니다.
   3. 48웰 멀티채널 플레이트 커버를 교체하고 시스템 인큐베이터 내부에 위치한 이동식 단계로 옮긴 후 고정하세요.
4. P. Aeruginosa 다중 채널 플레이트 채널 접종 절차를 설정하세요.
   1. 마이크로플루이딕 채널을 마이크로유체 시스템 제어 모듈로 시딩하려면 다음을 선택하세요: 수동 > 컬럼 1–4 > 유체: TSB, 37 °C > 최대 전단(Pa): 0.1 (1 dyne∙^cm-2 = 0.1 Pa) 및 48웰 0–2 Pa 다채널 플레이트 다이어그램의 출구 우물을 선택하세요.
   2. 중단 버튼을 선택 해 2–4초 후 흐름을 멈추고 플레이트를 30분간 방치하여 셀이 채널 기판에 부착되었는지 확인한 후 연속 흐름을 시작합니다.
      참고: 30분 동안 진행되면 플랑크톤성 P. aeruginosa 의 박테리아가 하부 채널 벽에 부착되는 데 중력이 작용합니다. 이 시간은 박테리아와 영양 배지 종류에 따라 달라집니다.
   3. 이동식 인큐베이터 단계에서 다중 채널 플레이트를 제거하고, 클래스 II 안전 캐비닛의 6개 채널 각각의 입구 웰에 신선한 TSB 1mL를 옮깁니다.
   4. 멀티채널 플레이트를 인큐베이터 내부의 이동식 단계로 옮기고 고정하세요.
5. AutoRun을 설정하세요.
   1. 24시간 실험 동안 사용된 흐름이 P . aeruginosa 가 자연에서 발견되는 위치와 관련이 있는지 확인하므로, 수동 >전 단 응력(0.01 Pa)으로 탐색하고 표시된 부피 유량(μL⋅^h-1)을 기록합니다. 이 값은 48웰 마이크로채널 플레이트의 경우 8.2 μL⋅^h-1임을 확인하세요.
   2. 부피 유량을 m³∙^s-1로 변환하고, 채널 단면적(m²)을 계산한 후 0.01 Pa의 유체역학적 전단 응력에서 유속을 산출합니다.
      참고: 유체 부피 유량 방정식을 사용하고 재배열함으로써 채널을 통과하는 유체 속도를 계산할 수 있습니다:
      
      여기서 U는 유체 속도(m∙^s-1), A는 다채널 판 내 채널의 마이크로채널 단면적(m²)입니다.
   3. TSB 매질의 밀도(ρ), 동적 점도(μ)를 사용하여 유동 레이놀즈 수를 계산하고, P. aeruginosa 바이오필름이 발견되는 유체 흐름 범위 내에 있는지 확인하세요. 0.01 Pa의 유체역학적 전단 응력에 대해 TSB와 FAB 매체에 대해 각각 레이놀즈 수가 0.0117과 0.0165로 설정되도록 합니다. 이 범위를 벗어난 경우, 유체 조건이 TSB로 설정되어 있는지 확인하세요.
      
      여기서 D_h는 사용된 마이크로채널의 유압 직경으로, 다음을 사용해 얻었습니다:
      
      여기서 w, h는 사용된 마이크로채널의 너비(m)와 높이(m)를 나타냅니다.
   4. 이미지 획득 영역 내 유체 흐름이 완전히 현상되었는지 확인하기 위해 유체 현상 길이를 계산합니다.
      참고: 채널을 통과하는 층류 유체의 발전 길이는 레이놀즈 수 Re와 채널의 유압 직경 D_h를 사용하여 계산할 수 있습니다:
      L_dev = 0.06ReD_h
   5. 자동 실행 설정: 자동 실행 > 프로토콜 설정 > 시간 24시간, 반복 1회, 전단 응력 0.01 Pa. 프로토콜 저장.
   6. 서열 설정 탭에서 새로 생성된 프로토콜을 한 번의 반복으로 채널 1–6에 적용하여 37 °C에서 TSB를 선택하여 새로운 서열을 생성합니다. 이 시퀀스를 저장하세요.
6. 다차원 획득 창을 사용해 이미지 획득을 설정하세요.
   1. 시스템 소프트웨어를 사용해 '다차원 획득'을 선택한 후, '다차원 획득' 창의 왼쪽 아래에 있는 라이브 버튼을 누르세요. 현미경 스테이지를 탐색하여 라이브 뷰 버튼과 카메라 배율 5×에서 40× 채널을 관찰할 수 있으며, 카메라 시야에서 한 채널씩 표시됩니다.
   2. 카메라 이미지 획득 준비: 다차원 촬영 > 저장: >저장할 이미지 디렉터리를 선택하세요 타임 랩스: 24시간, 유체역학적 흐름과 같은 시간 > 시간 간격: 각 획득 이미지 사이의 간격, 10분으로 설정.
   3. 카메라 설정을 입력하려면 파장 > 조명: 밝은 필드 50% 카메라 50%: 흑백 > 자동 노출: 모든 획득 > 획득: 각 시점 마다 > 자동 초점: 절대 안 됩니다.
   4. 바이오필름 이미지를 캡처할 카메라 위치를 파악하려면 배율을 20×로 설정하여 665.6 μm × 665.6 μm 크기의 시야각을 생성하고, 채널 시청 영역 중앙으로 이동하면 중앙에 채널 번호가 새겨집니다.
   5. 카메라가 촬영할 수 있도록 스테이지 위치를 추가하고, 스테이지 라벨로 이동해 위치를 표시한 뒤, 디렉토리에 추가할 추가 버튼을 선택하세요.
      1. 채널 시야 영역의 입구에서 0.9984 mm 상류 지점과 3.0016 mm 하류 지점에 대해 이 작업을 반복하며, 이 위치는 카메라 시야의 중앙 지점을 나타냅니다.
         참고: 이 영상 위치들은 관측 영역을 따라 바이오필름 성장을 나타내는 동시에 내부 흐름이 완전히 발달하도록 선택되었습니다. 이로 인해 각 마이크로채널마다 3장의 이미지가 촬영되며, 이 경우 10분마다 18장의 이미지가 촬영됩니다.
7. 실험 실행 수행
   1. 시스템 제어 모듈 창에서 AutoRun 을 선택> 실행 설정 > Sequence: 생성된 0.01 Pa 시퀀스를 선택한 후 시작을 선택하세요.
   2. 즉시 다 차원 획득 창> 획득 창으로 이동하세요. 이로 인해 24시간 실험 절차 중 10분마다 18장의 이미지를 획득하며, 실험이 종료될 때 2610장의 이미지를 생성합니다.
      참고: 위 섹션은 초기 실험 후 약 48시간 후 동일한 조건에서 추가로 6개의 마이크로채널을 통해 재현한 것입니다.

10. Z-스택 누적

1. 각 실험 실행이 끝날 때마다 세 개의 채널을 선택하고, 다 차원 획득 > 메인 모드를 열어 40× 배율로 세 개의 섹션으로 Z-스택을 얻으세요: 'Z 시리즈'를 제외한 모든 옵션을 체크 해제하세요.
2. 다차원 획득에서 채널의 한 섹션을 선택한 후 Z-시리즈로 이동하고 > 인터랙티브 설정을 변경하세요: 증가: 0.5 및 두 체크박스 모두 체크 해제.
3. 현미경 초점 조절 노브를 사용해 바이오필름이 초점이 흐려질 때까지 돌린 후, '최상으로 설정'을 선택해 z-거리를 입력하세요. 이 과정을 반복하되, 초점 조절 노브를 반대 방향으로 돌리고 ' 바닥 전류 설정'을 선택하세요. 이로 인해 현미경은 z-스택을 포착할 수 있는 범위를 갖게 됩니다.
4. 저장 창 내에서 폴더를 선택해 z-stack을 저장하고, 창 오른쪽 하단에서 획득을 선택해 획득을 시작하세요.

11. 실험 후 이미지 및 데이터 분석

1. 바이오필름 퍼센트 표면적 적용 데이터를 얻으세요.
   1. 획득한 이미지를 시스템 소프트웨어에 불러오려면 다음을 선택하세요: 분석 도구 > 다차원 데이터 검토 > 기본 파일 선택 > 디렉토리 선택: 저장된 이미지가 있는 폴더를 탐색하고 >> 파장 1 보기, 중앙 사각형 섹션에서 획득한 이미지 수를 가로로 표시한 후 상단의 작은 회색 상자를 우클릭하세요. 왼쪽 코너.
   2. 각 채널 섹션의 이미지를 하나씩 불러오고, 스테이지 위치를 선택하세요: 이미지를 로드할 위치를 선택> 이미지 시리즈를 TIFF 파일로 저장하세요.
   3. 바이오필름을 강조하는 ' Threshold Image ' > '어두운 물체에 대한 자동 임계값 '을 선택해 이미지를 임계값으로 설정한 후, 직사각형 영역 도구를 사용해 이미지에 테두리를 지정합니다.
      참고: 임계값 이미지의 왼쪽 슬라이더는 위아래로 움직여 임계값 강도를 조절하여 바이오필름과 배경을 더 잘 구분할 수 있습니다. 이미지에 그림자가 있다면, 그림자가 없는 부분을 테두리로 표시하세요. 그림자가 기본적으로 강조되어 측정값이 변경되었을 수 있습니다.
   4. 시스템 소프트웨어 창에서 MM 표준 > 측정 > 영역 측정을 선택하여 직사각형 테두리 내 강조된 바이오필름에 대한 데이터 표(임 계 면적 %를 포함)를 생성하여 24시간 실험 동안 바이오필름의 표면적 커버 비율 데이터를 얻으세요. 로그 파일을 열고 저장하려면 Open Log 를 선택하고, 데이터를 입력하려면 F9: Log Data 를 선택하세요.
   5. 스프레드시트를 열고 각 채널 구간의 24시간 바이오필름 데이터를 사용해 24시간 동안 바이오필름 표면적 비율 적용률을 보여주는 그래프를 만듭니다.
2. 바이오필름 두께와 산술 평균 표면 거칠기를 얻습니다.
   1. 저장된 파일을 피지 컨트롤 바에 드래그하여 8비트 이미지로 변환하여 z-stack을 Fiji(ImageJ)로 저장했습니다: Image > Type > 8비트.
   2. 바이오필름과 채널 표면 사이의 대비를 높여 원치 않는 노이즈를 제거하세요: 이미지 > 밝기/명암비 조정>.
   3. 이미지를 임계값으로 설정하고, 바이오필름 픽셀 값은 255(흰색), 배경 픽셀 값은 0(검은색)로 설정합니다: 이미지 > 임계값을 조정>.
   4. 이미지 축척을 설정하고, 분석 > 축척 설정 거리 > 픽셀 단위: 2048 > 알려진 거리: 332.8 > 픽셀 종횡비: 1.0 > 길이 단위: μm.
      참고: 알려진 거리는 332.8 μm이며, 사용된 하마마츠 카메라는 2048 × 2048 픽셀 시야각을 가지며, 각 픽셀 크기는 6.5 μm이고 40× 배율로 촬영되었습니다.
   5. 각 Z-스택 슬라이스의 바이오필름 표면적을 계산하고 합산하며, 입력 스케일 값을 사용해 시리즈의 두께를 계산하여 부피를 찾을 수 있도록 하는 맞춤형 매크로¹⁸ (보조 파일 1)을 사용해 분석합니다. 또는 계산된 부피를 표면적으로 나누어 바이오필름 두께를 구할 수 있습니다.
   6. 각 z-시리즈의 바이오필름 산술 평균 표면 거칠기 값을 ImageJ(피지 아님) 플러그인 SurfCharJ 를 다운로드하여 플러그인 폴더에 저장하여 얻으세요.
   7. 저장된 스택을 컨트롤 바에 드래그하여 32비트 이미지로 변환하여 z-스택을 ImageJ에 업로드합니다: 이미지 > 유형: 32-bit.
   8. 스택 표면 전반에 걸친 회색 값 변화를 보여주는 표면 플롯을 생성하세요: 플롯 프로필 분석>> 더보기: 고해상도 플롯. 고해상도 그래프를 32비트로 변환하세요.
   9. SurfCharJ 플러그인을 실행하여 산술 평균 표면 거칠기 값을 얻으세요: Plugins > SurfCharJ > 거칠기 계산: 평균 샘플링 길이 (): 10).
      참고: SurfCharJ 플러그인은 z-스택 표면을 따라 다양한 회색 값을 사용하여 산술 평균 표면 거칠기를 계산합니다. 표면 거칠기 매개변수를 담은 표가 생성되며, 관심 있는 매개변수는 산술 기준 표면 거칠기 R_a입니다. 테이블 값은 픽셀 단위에서 마이크로미터로 변환해야 합니다.

결과

이 절에서는 위 프로토콜 절차를 적용할 때 대표적인 결과를 설명합니다. 모든 실험은 최소 세 개의 독립적인 생물학적 복제체를 사용하여 수행되었으며, 각 복제체는 여섯 개의 평행 채널로 구성되어 있으며, 데이터는 평균 ± 표준편차로 제시되었습니다. 모든 그래프의 오차 막대는 그림 전설에 정의된 표준 편차를 나타냅니다.

37°C, TSB 매질, 0.01Pa 유체역학적 벽 전단 응력 하에서 24시간 동안 PAO1과 PA14 변형의 성장은 그림 1에 나타난다. 그림은 PAO1 균주가 실험 초기 단계에서 PA14보다 기질 표면의 더 큰 비율을 정착함을 보여줍니다. PAO1 균주에서 발견된 더 큰 초기 부착률은 현재 문헌과 일치하며, 이 균주는 비교적 빠르게 표면 부착을 형성하는 표현형임을 시사한다¹⁹. 그러나 PA14...

토론

이 프로토콜을 구성하는 여러 중요한 단계들은 대체적이고 전통적인 방법보다 바이오필름 형성에 대한 보다 포괄적이고 정확한 분석을 가능하게 합니다. 핵심 요소는 48웰 마이크로채널 플레이트의 사용으로, 350 μm × 70 μm × 4 mm(W × H × L) 크기의 미시적 채널을 갖추고 있습니다. 이 차원들은 병원 환경에서 발견되는 유동 조건과 미세 환경을 구체적으로 재현하며, 예를 들어 요로 카테터나 낭포성 섬유증 환자의 폐 세기관지와 같은 곳을 구체적으로 재현합니다^{12, 21, 22, 23}. 실험 실행 때마다 6개의 병렬 채널이 사용되었으며, 각 경로마다 최소 세 번 이상 반복되었습니다. 이 반복은 박테리아의 고유한 확률적 특성 때문에 데이...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
(NH<서브>4)2SO<서브>4	아크로스 오가닉스	7783-20-2	수정된 FAB 매체에 대해
48웰 0-2 Pa 마이크로채널 플레이트 - 유리 커버슬립	셀 마이크로시스템	910-0047-5팩	실시간 영상을 통한 미디어 흐름 및 바이오필름 성장을 위한 마이크로채널
-80 & 도; C 냉동고	써모피셔 사이언티브	1.16057E+15	글리세롤 재고를 추가 사용 전까지 보관하기 위해
한천, 세균학 등급	아크로스 오가닉스	443570010	한천 배지 - 박테리아 배양
분석 균형	VWR	VWRI611-2297	사용되는 매체의 구성 요소를 측정하기 위해
오토클레이브	프리오르클레이브	4304	유리 기구를 멸균하기 위해
바이오플럭스 1000HT	I& L 바이오시스템즈	https://il-biosystems.com/cell- 마이크로시스템/장치/바이오플럭스-1000HT- 전단흐름시스템/	마이크로채널 유동 및 바이오필름 성장 실험을 위한
바이오플럭스 제어 모듈	I& L 바이오시스템즈	https://il-biosystems.com/cell- 마이크로시스템/장치/바이오플럭스-1000HT- 전단유량시스템/	마이크로채널 내에서 매체 흐름과 바이오필름 성장을 설정하고 모니터링하는 것.
바이오플럭스 몽타주 소프트웨어	I& L 바이오시스템즈	https://il- biosystems.com/app/uploads/2025/01/Bi oFlux_Overview_.pdf	마이크로채널 내에서 매체 흐름과 바이오필름 성장을 설정하고 모니터링하는 것.
CaCl2	피셔 사이언티브	10043-52-4	수정된 FAB 매체에 대해
CaSO4.2H2O	켐크루즈	A1719	1L 최소 금속 용액에 대해
투명 폴리스티렌 96웰 플레이트	코닝, 코스타	CLS7007	생존 가능한 세포 수에 대해
CoSO4.7H2O	시그마-올드리치	10026-24-1	1L 최소 금속 용액에 대해
CuSO4.5H2O	허니웰	209198-100G	1L 최소 금속 용액에 대해
에펜도르프 튜브 3810X	에펜도르프	30125150	P. aeruginosa 글리세롤 스톡에 대해
FeSO4.7H2O	VWR 인터내셔널 주식회사	284005E	1L 최소 금속 용액에 대해
피지 (ImageJ)	국립보건원(NIH)	https://imagej.net/software/fiji/downloa<브레르/> DS	Z-스택 이미지 처리
포도당	시그마-올드리치	50-99-7	포도당 변형 FAB 미디엄을 위한
글리세롤	시그마-올드리치	56-81-5	P. aeruginosa 글리세롤 스톡에 대해
H3BO3	피셔 사이언티브	10043-35-3	1L 최소 금속 용액에 대해
하마마츠 오르카-플래시 4.0 카메라 모델 C11440- 42U	하마마츠	C11440-42U	마이크로채널 흐름 및 바이오필름 성장< bri/> 실험 실시간 영상
KH2PO4	피셔 바이오리시약	7778-77-04	수정된 FAB 매체에 대해
메틸화 영혼	시그마-올드리치	2857	미생물학 캐비닛을 사용 전후에 청소할 때< br/> 사용 시
MgCl2	시그마-올드리치	M8266-100G	수정된 FAB 매체에 대해
미생물학 캐비닛 클래스 II	써모피셔 사이언티브	42111226	박테리아, 육수 또는 한천을 오염시키지 않으면서 프로토콜 단계를 수행하기 위해
미니 인큐베이터	랩넷 인터내셔널	SN03171014	-80 & 이후 PAO1과 PA14를 해동하는 것; C 냉동고와 를 사용하여 초기 24시간 박테리아 한천 플레이트 성장을 위해 사용했습니다
MnSO4. H2O	시그마-올드리치	10034-96-5	1L 최소 금속 용액에 대해
Na2HPO4.2H2O	시그마-올드리치	10102-40-6	수정된 FAB 매체에 대해
나클	시그마-올드리치	S5886-500G	수정된 FAB 매체에 대해
NaMoO4. H2O	시그마-올드리치	10102-40-6	1L 최소 금속 용액에 대해
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쉐이킹 인큐베이터	INFORS HT	https://infors- ht.com/en/products/incubator- 셰이커/멀티트론 표준	야간 배양을 위한
시트레이트나트륨	시그마-올드리치	71498-250G	시트산나트륨 변형 FAB 배지를 위한
멸균 플라스틱 접종 루프	마이크로스펙	15782105	P. aeruginosa PAO1과 PA14를 한천 플레이트와 매관 주입
트립틱 대두 한천, 식물성	밀리포어	14432-500G-F	한천 배지 - 박테리아 배양
트립틱 두이 육수	시그마-올드리치	T8907	탈수 배양 배지 - 6 g/200 mL
타입 1 정수기	써모피셔 사이언티브	SN42103311	디스tiled water에 대해
ZnSO4.7H2O	피셔 사이언티브	7446-20-0	1L 최소 금속 용액에 대해