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방법 논문

쥐의 좌골신경에 대한 단극 고주파에 의한 열 손상 모델

201 조회수

⸱

DOI:

10.3791/69998

⸱

2026년 4월 3일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pain Management, Xuanwu Hospital, Capital Medical University, 2National Medical Center for Neurological Diseases, 3National Clinical Research Center for Geriatric Diseases

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 연구는 고주파 시스템을 쥐의 좌골신경에 적용하여 열신경 손상의 고주파 소작 모델을 확립하였습니다. 이 접근법은 쥐의 말초 신경 열손상 모델에서 제어 가능성 문제를 해결하여, 신경 손상 복구와 신경병성 통증 연구에 실용적인 모델링 방법을 제공합니다.

초록

말초 신경 손상은 종종 신경병성 통증을 유발하며 신경 회복 과정을 유발합니다. 통제 가능한 물리적 손상 모델은 이미 잘 확립되었지만, 기존의 열손상 모델은 탐색적 수준이며 통제 가능성이 낮습니다. 임상 실무에서는 조직과 신경에 열손상을 유도하기 위해 고주파 소작(RFA) 시스템이 자주 사용됩니다. RFA는 신경에 열 손상을 유도하여 통증 전달을 효과적으로 차단하는 치료적 기법입니다. 절제술의 범위는 특정 매개변수와 영향을 받은 신경 분포 부위의 저림 및 운동 기능 장애 정도를 조절하여 조절할 수 있습니다. 이 연구는 단극 고주파 시스템을 사용하여 쥐의 좌골신경에서 75°C를 30초 동안 적용하여 안정적이고 조절 가능한 신경 손상 모델을 만들었습니다. 수술 후 7일째부터 14일째까지 기계적 철수 역치(MWT)가 유의미하게 증가했으며, 28일째에 회복이 이루어졌습니다. 이 연구는 RFA 신경 손상 모델의 현재 공백을 해소하고, RFA 시술 후 임상적으로 관찰된 신경 손상을 재현하며, RFA 유발 신경 손상에 대한 후속 연구를 위한 방법론적 틀을 제공합니다.

서론

신경병성 통증은 통증 기전이 계속 연구되고 있어 임상 관리에 지속적인 도전 과제를 제시하고 있습니다. 신경병성 통증의 분자 및 세포 기전을 연구하기 위해, 척수 신경 결찰(SNL)1, 만성 수축 손상(CCI)2, 부분 좌골신경 결박(pSNL)3, 좌골신경 절단(SNT)4, 그리고 보존 신경 손상(SNI)5 가 설치류에서 말초 신체 신경 손상을 성공적으로 시뮬레이션하는 데 사용되었습니다. 모델의 제어성과 안정성을 높이기 위해 이전 연구들은 압력 게이지와 선택적 손상 등 개선 사항을 제안했으며, 이를 구현한 바 있습니다.

라디오 주파수 기술이 긍정적인 임상 결과를 가져왔지만, 여러 부작용도 동반하고 있습니다. 예를 들어, 수술중 지혈에 사용되는 고주파 소작술(RFA)은 주변 조직에 열 손상을 일으킬 수 있으며, 기구 팁7의 높은 온도로 인해 말초 신경에 열 손상 위험이 있습니다. 또한, 삼차신경통8, 전부후 신경통9 및 기타 신경병성 통증 질환 치료를 위한 RFA는 수술 후 원발성 통증을 줄이지만, 지배 부위의 장기적인 수술 후 무감각, 표재성 과민지통 및 기타 불편함을 동반합니다10,11. 그 결과, 말초 신경의 열 손상에 관한 연구가 점차 주목받고 있습니다. 그러나 기존 동물 모델은 열손상의 온도, 지속 시간, 위치를 정밀하게 제어하지 못해 손상 심각도의 균일성을 제한합니다.

이전 연구들은 열전도 막대를 일정 온도 수욕12 나 온수 펌프에 연결해 신경13과 직접 접촉하는 고무관에 뜨거운 물을 주입하는 것을 사용하여, RFA가 신경 손상에 미치는 열 효과를 모방하는 것을 목표로 했습니다. 그러나 이전의 열 손상 모델은 열손상만 유발하여 고주파 전류와 그 매개변수가 신경에 미치는 영향을 배제했습니다. RFA로 인한 손상이 단지 열 효과 때문인지, 아니면 라디오 주파수 매개변수 변화와 같은 요인이 신경에 뚜렷한 영향을 미치는지는 아직 탐구해야 합니다. 현재 신경 손상에 대해 무선 주파수 열 응고 시스템을 직접 사용하는 동물 모델이 부족하여 RFA와 관련된 신경 손상 연구의 발전을 저해하고 있습니다. 이 연구는 단극성 RFA 시스템을 직접 사용하여 임상 환경에서 RFA 시술과 관련된 신경 손상을 시뮬레이션하였으며, 이는 쥐의 좌골신경에 RFA 손상을 유도하는 방식이었습니다. 이 연구는 말초 신경에 대한 RFA 손상에 관한 기초 연구를 위한 방법론적 참고 자료를 제공합니다.

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프로토콜

동물 실험은 수도의과대학교 현무병원 실험동물센터 동물윤리위원회의 승인을 받았으며, NIH 실험동물 관리 및 사용 가이드14에 따라 수행되었습니다. 성체 수컷 C57BL/6마리 쥐(8–10주, 20–25g)는 통제된 환경 조건(22± 2°C, 습도 50%–60%, 12시간 밝/어둠 주기, 07:00 불 켜짐)에서 그룹 사육되었으며, 표준 설치류 밥과 물을 자유롭게 섭취할 수 있었습니다. 모든 행동 평가는 08:00부터 12:00 사이의 빛 단계에서 수행되었습니다. 시약, 소프트웨어, 장비에 대한 세부 사항은 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 마취 및 쥐 준비

  1. 20 mg/mL 트리브로모에탄올 용액을 복막 내 주사로 마취하며, 체중 10g당 0.2 mL 용량을 투여합니다.
  2. 양쪽 눈을 면솜 어플리케이터로 안과 연고로 덮으세요.
  3. 쥐들을 왼쪽 옆 위치로 눕히세요. 전동 면도기(그림 1)로 몸 오른쪽(1cm × 1cm 부위)의 털을 제거하세요.
    참고: 이 단계는 회로 저항을 줄이기 위해 몸통과 음극 사이의 접촉면적을 늘립니다.
  4. 마우스 몸통 일부를 금속 음극판에 오른쪽 측면 방향으로 접촉시킵니다. 몸통과 판 사이의 접촉 부위에 이온 액체(0.9% NaCl 또는 변형된 링거 용액; 성분표 참조 )를 여러 방울에 발라하여 전기 전도도를 높입니다.
    참고: 눈이나 다른 장기에 의도치 않은 전류 노출을 방지하기 위해 머리와 얼굴이 음의 판에서 벗어나 있는지 확인하세요.
  5. 왼쪽 뒷다리를 위로 향하게 고정하고, 무릎은 음극판에 붙인 테이프로 굽히세요. 왼쪽 허벅지 부위의 털을 제거하고 수술 부위를 75% 에탄올로 세 번 소독하세요.
  6. 진행 전에 충분한 마취 깊이를 확인하기 위해 뒷다리나 꼬리에 가해진 꼬집음 자극에 대한 철회 반응이 없음을 확인하세요.
    참고: 수술 전반기 동안 국소 마취제(예: 리도카인) 또는 비스테로이드성 소염제(예: 아세트아미노펜)를 투여하는 것을 피해야 하며, 이들 약물이 수술 후 신경행동 평가에 영향을 줄 수 있습니다.

2. 고주파 소작술

  1. 대퇴골을 기준으로 사용하세요. 미세 가위를 사용해 대퇴골의 긴 축 방향으로 1cm 크기의 피부 절개를 하고, 후륜 쪽으로 0.5cm 측면 이동을 허용합니다(그림 2).
  2. 피부 절개 부위를 따라 이두근(BFM)을 직설적으로 해리하고, 미세한 겸자로 주요 좌골신경통을 찾습니다. 좌골신경은 무릎 관절 근처에서 갈라집니다(그림 3).
  3. 미세병자를 사용해 좌골신경통 줄기를 좌골신경 분기점 위 약 2mm 지점에서 주변 조직에서 약 5mm 길이로 절단합니다. 둔한 분리 시 혈관 손상을 피하세요.
    참고: 우발적인 혈관 손상이 발생했을 경우, 멸균 면봉을 사용해 혈액을 흡수하고 적절한 압력을 가해 출혈을 멈추세요. 이후 혈액 침출이 없으면 수술을 계속하세요.
  4. RFA 응고바늘을 고주파 치료 장치에 연결하세요. 바늘 끝을 근육 조직에 평평하게 대고 저항을 테스트하세요. 저항이 1 kΩ 이상이라면, 스포이드를 사용해 마우스 본체와 음극판 사이에 이온 액체를 첨가하여 저항이 1 kΩ 이하로 떨어질 때까지 유지합니다.
  5. 유리 분침으로 분리된 좌골신경을 부드럽게 들어 올립니다. 좌골신경 아래에 RFA 바늘을 놓고, 노출된 금속 끝은 좌골신경 분기점에서 3mm 떨어진 곳에 위치시킵니다(그림 4).
  6. 고주파 치료 기기 매개변수를 다음과 같이 설정하세요: 열응고 모드, 75 °C, 30초, 2 Hz 주파수, 1 ms 펄스 폭. RFA 에너지 전달을 활성화하세요.
  7. RFA 바늘을 부드럽게 빼세요. 핀셋을 사용해 좌골신경을 재배치해 근육 조직을 들어 올립니다. 6-0 흡수성 폴리글리콜산(PGA) 봉합사로 근육을 봉합하세요. 피부 절개 부위는 4-0 흡수성 PGA 봉합사로 봉합하세요.
  8. 수술 후에는 쥐를 순환하는 따뜻한 담요(38 °C)나 온도 조절 가능한 온열 패드(37–38 °C)에 두고, 화장지나 수건으로 덮어 털을 건조시키고 직접적인 열 손상을 방지합니다.
  9. 쥐들을 다시 우리에 넣고 마취 회복을 기다리세요. 정기적으로 절개 부위를 확인하고 매일 점검하며, 음식 섭취, 물 섭취, 전반적인 체내 상태를 모니터링하세요.

3. 실험 그룹

  1. RFA 그룹: 2.1–2.9 단계에 설명된 완전한 RFA 수술 프로토콜을 수행합니다.
  2. 샴 그룹: RFA 그룹과 동일한 절차를 수행하되(2.1–2.5 및 2.7–2.9단계), 2.6단계에서 RFA 시스템 전달을 활성화하지 않습니다. 좌골신경 아래에 RFA 바늘을 현재 활성화 없이 30초간 유지한 후 2.7단계로 진행합니다.
    참고: 샴 그룹은 열 손상과 무관하게 외과적 외상, 마취, 신경 조작, 바늘 삽입을 통제합니다.

4. MWT에 대한 폰 프레이 평가

  1. 각 테스트 전에 쥐들을 무작위로 폰 프레이 테스트 플랫폼에 배치하세요. 탐색 행동이 멈출 때까지 15분간 적응을 기다리세요.
    참고: 플랫폼은 0.6cm 두께× 바닥에 0.6cm 구멍이 있는 금속 망과 여러 개의 빨간색 투명 쥐 용기로 구성되어 있으며, 서로 간섭하지 않고 서로 다른 용기에 배치되어 있습니다.
  2. 폰 프라이 평가를 업-다운 방법으로 수행하세요. 폰 프레이 섬유 와이어를 붙여 왼쪽 뒷발바닥 중앙을 자극해 약간의 구부러짐을 유발하세요. 3초 또는 금단 반응이 일어날 때까지16초까지 참으세요.
    참고: 0.4g 필라멘트로 테스트부터 시작하세요. 음성 반응 후에는 다음 상위 필라멘트를, 양성 반응 후에는 낮은 필라멘트를 적용하세요. 첫 방향 변경 이후 추가로 4건의 신청을 계속하세요. 실제로는 2g 필라멘트가 이 힘에서 폰 프라이 섬유가 앞발을 탈출 또는 철수 반응 없이 들어 올렸기 때문에 이 연구에서 상한선으로 설정되었습니다.
  3. 응답을 기록하고 상하 방법 계산기(https://bioapps.shinyapps.io/von_frey_app/ 년 von Frey 실험의 업-하 방법 사용)를 사용해 50% MWT를 계산하세요.
  4. 기본 선(수술 전)과 수술 후 7일, 14일, 21일, 28일, 35일에 폰 프레이 검사를 실시하세요.

5. DRG 조직 채취 및 면역형광 염색

  1. 수술 후 7일째에 RFA 및 샴 그룹에서 L4–L6 DRG를 채취합니다.
  2. 조직을 10% 자당-파라포름알데히드 4°C에서 6–12시간 고정합니다.
  3. 조직을 30% 자당-PBS에 4°C에서 하룻밤 동안 크라이오프로텍트합니다.
  4. 조직을 최적의 절단 온도화합물 17에 삽입하세요.
  5. 13 μm 냉동절부 절단부를 절단하고 비이온성 계면활성제로 절편을 투과시킵니다.
  6. 차단 시약을 사용해 차단하고 4°C에서 폴리클론 항체와 함께 하룻밤 배양합니다.
  7. 세척 후에는 2차 항체와 함께 실온에서 2시간 인큐베이팅합니다.
  8. 안티페이드 매체로 마운트하세요.

6. 통계 분석

  1. 정규 분포 연속 데이터를 평균± 표준오차(SEM)로 제시합니다.
  2. 독립 표본 t-검정을 사용하여 그룹 간 비교를 수행합니다.
  3. 분산 반복 측정 분석(ANOVA)을 사용하여 다양한 시점에 대한 그룹 내 비교를 분석합니다.
  4. 사후 쌍별 비교에는 본페로니 보정을 적용합니다.
  5. 모든 데이터를 통계 소프트웨어를 사용해 처리하고 통계적 유의성을 P < 0.05로 설정하세요.

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결과

성공적인 모델 구축은 수술 중 및 수술 후 지표 모두에서 확인되었습니다. RFA 완료(75 °C, 30초)에서는 철수 시 RFA 바늘 끝과 좌골신경 사이에 약간의 유착이 관찰되었습니다. 이 부착은 접촉 부위의 국소적인 단백질 변성과 응고에서 발생하며, 적절한 열 에너지 전달과 직접 신경 접촉을 시사합니다. 유착이 없으면 시술 중 바늘이 변위되었음을 나타내며, 이는 신경 손상이 일관되지 않거나 비최적화로 이어질 수 있습니다.

수술 후 RFA 그룹의 쥐들은 7일차와 14일째에 수술 전 기저선 및 샴 그룹에 비해 MWT가 유의미하게 증가한 것으로 나타났습니다(P < 0.001; 그림 5). 이 일시적인 기계적 저통은 RFA 시술 후 임상 소견과 일치하는 표재성 감각 감소를 반영합니다. 수술 후 21일째에 MWT 수치가 감소하기 시작했고, 28일과 35일째에는 기초 수준으로...

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토론

최소 침습 수술의 급속한 발전과 함께 고주파 기술이 점점 더 널리 보급되고 있습니다 6,7,18. 무선 주파수 기술이 임상 실무에서 확산됨에 따라 관련 연구가 이를 더 널리 채택하는 데 기여했습니다. 그러나 고주파 전류가 조직에 미치는 영향은 특히 신경병성 통증 치료에 무선 주파수 기술이 적용된 이후, RFA 시술 후 기비와 같은 합병증으로 인해 많은 환자의 삶의 질이 영향을 받는다는 점에 대해 더 많은 연구가 필요합니다.

이 연구에서는 쥐의 좌골신경 손상을 치료하기 위해 단극 RFA 시스템을 사용했습니다. 단극 RFA 시스템 수술의 핵심은 작동 요구사항을 충족하기 위해 임피던스를 줄이는 것입니다. 따라서 음극 금속판 접촉면의 피부 준비와 전도성 매체 선...

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공개 사항

저자들은 상충하는 이해관계가 없다고 선언한다.

감사의 글

이 연구는 선무병원 인재 융합 프로그램(HZ2025PYDTR009)과 캐피털의 건강 개선 및 연구 기금(2011년 CFH2024월 2일)의 지원을 받고 있습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
4-0 봉합사진환 메디컬C412피부를 닫아.
6-0 봉합사진환 메디컬KCR631근육층을 닫아주세요
알렉사 플루오 488 2차 항체인비트로젠A-110082차 항체
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바늘 홀더위얀 인스트루먼츠Y32010바늘을 잡아라
QuickBlock 차단 솔루션비요타임 바이오테크놀로지컬P0260면역형광을 위한 차단 시약
고주파 치료 장치코스만 메디컬RFG-1A고주파 시스템
고주파 열응고 전극 트로카코스만 메디컬TCD-10절연된 RF 바늘
나트륨 락테이트 링거 주사쓰촨 및 ; 켈룬 및 ; 제약회사; Ltd86902180001566저항을 줄이기 위한 이온 액체
SPSS 통계IBM 코퍼레이션버전 27.0통계 분석 소프트웨어
직선 가늘게 뻗은 겸자비요타임 바이오테크놀로지컬FS027근육과 근막 절단
폰 프레이 광섬유 와이어대믹 글로벌에스테지오 셈스-와인스타인행동 검사

참고문헌

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