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방법 논문

유방 구상 분석법은 비종양성 유방 상피 세포주에서 API5 유도 줄기 특성을 밝혀내다

742 조회수

⸱

DOI:

10.3791/69999

⸱

2026년 2월 24일

 , 
1Biology Department, Indian Institute of Science Education and Research

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 비종양성 유방 상피세포에서 세포자손멸증 억제제 5(Api5) 유도 암 줄기를 연구하기 위한 유방구형 형성 분석 설정 방법을 설명합니다. 1차 세대 유방구에서 채취한 용해액은 줄기세포 유사 특성의 유도를 평가하기 위해 다양한 줄기 특성 지표를 분석합니다.

초록

유방암은 전 세계 여성 사이에서 가장 흔한 암으로, 연령 표준화 발생률과 사망률이 가장 높습니다. 유방암을 겨냥한 치료법의 발전에도 불구하고, 환자의 20%가 재발을 보이는데, 이는 치료 저항성 암 줄기세포(CSC) 집단에 기인할 수 있습니다. 이 CSC는 정기 상태를 유지하거나 종양 덩어리의 불완전 절제로 인해 지속되어 이후 재발을 초래할 수 있습니다. 따라서 최근 연구는 이 내성 세포 집단을 식별, 분리, 표적으로 하는 데 집중하고 있습니다. 시험관 내에서 유방 구어 형성 분석은 유방 상피 집단 내에서 줄기유사 세포를 풍부하게 하고 증식시키기 위한 견고한 3차원 현탁 배양 시스템 역할을 합니다. 여기서는 비종양성 유방 상피세포에서 세포자살감소 억제제 5(Api5)의 과발현으로 가능해지는 암 줄기세포 유사 표현형을 평가하기 위해 유방구어 분석법을 활용한 접근법을 제시합니다. 이 프로토콜은 유방구를 연속 통로를 통해 전파하여 유방구의 형성 효율성과 자기 재생 능력을 평가하는 것을 포함합니다. 또한, 유대구에서 채취한 단백질 용해액은 면역블롯팅을 통해 확립된 줄기 특성 표지자를 탐침합니다. 이 분석법은 Api5와 같은 새로운 조절 인물, 예를 들어 유방 상피세포 집단에서 암 줄기세포 유사 특성을 연구할 수 있게 합니다. 이 접근법은 분자 개입의 비교 연구나 CSCs를 표적으로 하는 치료제 선별에 적용될 수 있습니다.

서론

항암 내성 유방암의 증가로 인해, 치료 저항성과 재발의 근본 원인인 암 줄기세포를 찾아내고 표적으로 삼는 데 점점 더 많은 관심이 집중되고 있습니다. 이 세포들은 분화를 회피하고 조용히 있는 능력이 특징으로, 암 치료의 다양한 방식에 저항할 수 있습니다 1,2. 유방암 줄기세포를 식별하는 데 여러 방법이 사용될 수 있는데, 여기에는 유방구체 형성 분석법 3,4,5, 세포 표면 표지 기반 세포 분류 6,7, 배출 특성에 기반한 분리, 생체 내 종양발생성 분석법7, 그리고 Oct48, Nanog 9, Sox210, Bmi11과 같은 줄기세포 핵 조절자 평가 등이 포함됩니다. 일반적으로 암 줄기세포를 식별하고 분리하는 데는 이러한 방법들 중 하나 이상이 결합되어 사용됩니다.

세포자멸증 억제제 5(Api5)는 유방암 12,13,14, 자궁경부암 15,16,17, B세포 만성 림프구 백혈병 18, 비소세포폐암19 등 여러 암에서 상향 조절되는 항세포자멸 단백질입니다. 높은 Api5 수치는 자궁경부16과 삼중음성 유방암에서 화학요법 내성과 관련이 있는 것으로 밝혀졌습니다. 치료 내성과 재발이 종종 암 줄기세포에 의해 유발된다는 증거가 점점 늘고 있습니다20,21. Song 등(Song) 등의 흥미로운 연구(22)는 자궁경부암 세포에서 Api5의 과발현이 나노그 수치를 높여 암 줄기성 증가에 기여한다는 사실을 밝혀냈습니다. 우리 연구실의 이전 연구들은 Api5의 과발현이 마트리겔 지지 3D 배양에서 배양된 비종양성 유방 상피세포의 변형을 유발한다는 것을 보여주었습니다. 이 형질전환 세포들은 극성 파괴, 증식 증가, 고정 독립적 성장, 그리고 부분적으로 상피에서 중간엽 전이(EMT) 유사 표현형을 보입니다. 3D 배양에서 Api5 과발현 시 관찰된 표현형 변화는 구체를 단층 배양으로 해리한 후에도 유지되었다14. Api5가 화학요법 내성 삼중음성 유방암에서 상향 조절된다는 점을 고려할 때, 우리는 Api5가 유방 상피 세포의 암 줄기형성 특성도 조절할 수 있다고 추측합니다.

이 맥락에서 우리는 Api5 과발현에 의해 변형된 3D 해리 비종양성 유방 상피세포에서 암 줄기세포를 식별하기 위한 유방구형 형성 분석법을 설명하고, 이어서 줄기세포 표지자를 위한 서부 블롯팅을 통해 이 세포들의 정체를 확인합니다. 유방구법은 비부착적이고 분화되지 않는 조건에서 유방 상피세포를 배양하는 과정을 포함하며, 이를 통해 유방구어라 불리는 3차원 구조에서 줄기유사/전구세포를 풍부하게 만들 수 있습니다. 줄기와 유사한 특성을 갖지 않은 유방 상피세포는 일반적으로 아노이키스를 겪습니다; 그러나 줄기와 유사한 특성을 가진 세포는 유방구(유방구)를 형성합니다 4,5. 이 방법은 원래 Dontu 등에 의해 개발되었으며, 신경 줄기세포와 전구세포를 연구하고 식별하는 데 사용되는 신경구(neurosphere) 분석에서 영감을 받았습니다23. 여기서 설명한 유방구어 분석법은 비타민 A와 재조합 인간 표피 성장인자(EGF) 없이 B27을 보충한 최소 배지 내에서 줄기세포 활성과 자가재생 능력을 평가할 수 있게 합니다. Api5 과발현 3D 해리 세포는 폴리(2-하이드록시에틸 메타크릴레이트)(pHEMA) 코팅된 플레이트에 드드문드루 시딩됩니다. 이로 인해 세포는 비부착 조건에서도 성장할 수 있어, 이후 매번 유방구가 클론 기원이 됩니다. 매모스피어는 7일째까지 성장하게 두고, 이후 매머스피어 형성 효율이 계산됩니다. 진짜 줄기세포와 시간이 지남에 따라 증식 능력을 잃는 비줄기세포를 구분하기 위해, 이후 세대의 유방구체 형성이 이루어집니다. 유대구의 연속 통과는 1차 생성에서 수집한 구를 분리하고 단일 세포를 재도금하여 2차(및 후속 세대) 유방구를 형성하는 과정을 포함합니다. 이는 세포가 구체 형성을 반복적으로 시작할 수 있는지 여부를 결정하며, 세포5의 자기 갱신 능력으로 정량화됩니다.

이 방법은 종양성 또는 변형된 유방 상피 세포에서 유방암 줄기세포를 식별하는 데 활용될 수 있습니다. 이 방법은 환자 샘플에서 유방암 줄기세포를 분리하는 데에도 적용될 수 있습니다. 이 시스템은 화학요법 내성과 연관될 수 있는 유방암 줄기세포에 대한 새로운 표적을 식별하는 데 도움을 줄 수 있습니다.

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프로토콜

1. 조직 배양 플레이트에 폴리(2-하이드록시에틸 메타크릴레이트), pHEMA 코팅

  1. 1.2 g의 pHEMA(분자량 300,000)를 100 mL 95% 에탄올에 65 °C에서 지속적으로 저어 1.2% pHEMA 용액을 준비합니다( 재료표 참조).
  2. 6웰 플레이트의 웰당 1mL씩 pHEMA를 적용하여 표준 조직 배양 플레이트에 pHEMA를 코팅합니다. pHEMA 용액의 부피는 조직 배양 용기의 크기에 따라 조절할 수 있습니다.
  3. 접시를 멸균 조건에서 40°C 오븐에 건조시키세요.
  4. 플레이트를 15분간 자외선에 노출시킨 후, 둘벡코의 인산염 완충 식염수(DPBS)로 세 차례 세척한 후 유방구체 형성 분석법을 설정합니다.

2. 1차 세대 유방구의 시딩

  1. 배양 배양 16일차 3D 배양물을 해리하여 얻은 3D 해리 MCF10A 세포(대조군 및 Api5 과발현)를 배양14.
    참고: 성장 배양체 구성: 피루베이트 나트륨 없는 고포도당 DMEM에 5% 말 혈청, 10 μg/mL 인슐린, 0.5 μg/mL 하이드로코르티손, 20 ng/mL 재조합 인간 표피 성장인자(EGF), 100 ng/mL 콜레라 독소, 200 단위/mL 페니실린-스트렙토마이신 보충( 재료표 참조).
  2. 사용한 배지를 제거하고, 1mL DPBS로 세포를 세척한 후 0.05% 트립신-EDTA 500 μL 용량을 추가하고, 37°C에서 5%CO2 가습 인큐베이터에서 12-15분간 배양하여 모든 세포가 트립신화될 때까지 배양합니다.
  3. 모든 세포가 분리된 후, 2mL의 재현탁액을 넣어 트립신 활성을 중화시키고, 112 × g 에서 실온에서 10분간 세포 부탁액을 돌립니다.
    참고: 재현탁 배지 조성: 피루브산나트륨 없는 고포도당 DMEM에 20% 말 혈청과 200 단위/mL 페니실린-스트렙토마이신을 보완함.
  4. 상청액을 흡인하고 세포 펠릿을 1mL의 유방구체 배지에 재현탁합니다. 셀 현탁액을 25G 바늘에 통과시켜 단일 셀 현탁액을 만듭니다.
    참고: 유방 배지 조성: DMEM/F12에 20 ng/mL 표피 성장 인자(EGF), 비타민 A 없는 × B27 보충제 1개, 그리고 200단위/mL 페니실린-스트렙토마이신( 재료표 참조).
  5. 혈구계를 사용해 세포 수를 세고, 우물당 0.2 ×4 세포를 씨앗하는 데 필요한 세포 부유액을 계산합니다.
    참고: 유방구의 형성 효율을 정확히 측정하기 위해 낮은 씨앗 밀도를 유지하여 세포 집집의 영향을 최소화할 수 있습니다. 면역블롯을 위해 단백질 용해액을 채취할 때, 세포 밀도를 웰당 최대 2.5 × 105 세포까지 증가시킬 수 있습니다.
  6. 필요한 세포 현탁 부피를 2mL의 유대구체 배지에 희석한 후 6웰 플레이트의 각 웰에 씨앗을 심습니다. 각 조건마다 3배로 씨앗 세포를 배치합니다.
  7. 37°C에서 5%CO2 가습 인큐베이터에서 7일간 배양합니다.
  8. 배양 7일 후, 현미경 아래 그라티큘이 장착된 현미경이나 광현미경 아래 사분면 격자를 사용해 각 웰의 50 μm 이상의 유방구의 수를 수동으로 세어보라.
  9. 광학 현미경에 장착된 디지털 카메라를 20배 배율로 유방구를 영상화합니다.
  10. 다음 공식으로 유대권 형성 효율(MFE)을 계산하세요5
     방정식 1

3. 2차 세대 유방구의 씨앗

  1. 1세대에 형성된 매머스피어를 15mL 튜브와 원심분리기에서 300 × g에서 10분간 실온에서 수집합니다.
  2. 상청액을 흡인하고, 유방구의 펠릿은 남겨두세요.
  3. 펠릿을 DPBS로 세척하세요.
  4. 유방구체 펠릿에 0.05% 트립신-EDTA 200 μL 첨가하고, 37°C에서 5%CO2 인큐베이터에서 2-3분간 배양합니다. 트립신 용액 내 유방구체를 25G 바늘에 세 번 통과시켜 단일 세포 현탁액을 얻습니다.
  5. 0.5mL의 재현탁액을 첨가하여 트립신 활성을 중화시키고, 112 × g 에서 실온에서 10분간 세포 현탁액을 돌립니다.
  6. 상청액을 흡인하고 세포 펠릿을 0.5mL 유방구체 배지에 재현탁합니다.
  7. 혈구계를 사용해 세포 수를 세고, 웰당 0.2 × 10개의4 세포를 씨앗하는 데 필요한 세포 부피를 계산합니다.
    참고: 세포 밀도를 낮게 유지하여 자가 갱신 능력을 평가하여 세포 응집의 영향을 최소화하세요.
  8. 필요한 세포 현탁 부피를 2mL의 유대구체 배지에 희석한 후 6웰 플레이트의 각 웰에 씨앗을 심습니다. 각 조건마다 3배로 씨앗 세포를 배치합니다.
  9. 37°C에서 5%CO2 가습 인큐베이터에서 7일간 배양합니다.
  10. 배양 7일 후, 각 플레이트에 직경 50 μm 이상의 유방구의 개수를 현미경으로 세어보며, 그라티큘이 장착된 장치나 사분면 격자형을 사용합니다.
  11. 광학 현미경에 장착된 디지털 카메라를 20배 배율로 유방구를 영상화합니다.
  12. 다음 공식5를 사용하여 자가 갱신 능력을 계산합니다
    방정식 2

4. Api5 과발현 시 다능성 마커 변화를 감지하기 위한 서부 블롯

  1. 1세대에 형성된 유방구를 15mL 튜브와 원심분리기에서 300 × g에서 실온에서 10 분간 수집 합니다.
  2. 상청액을 흡인하고, 유방구의 펠릿은 남겨두세요.
  3. 펠릿을 DPBS로 세척하세요.
  4. 펠릿을 얼음처럼 차가운 RIPA 버퍼에 담아 단백질 용해액을 얻고, 표준 프로토콜24에 따라 면역블롯을 수행합니다.
    참고: RIPA 완충액 조성: 50 mM 트리스-HCl(pH 8.0), 150 mM NaCl, 1% 트라이톤 X-100, 0.5% 디옥시콜레이트 나트륨, 0.1% 도데실 황산나트륨(SDS), 1 mM 에틸렌디아미네테트라아세트산(EDTA), 1 mM 페닐메티설폰닐 플루오라이드(PMSF), 10 mM 플루오라이드 플루오라이드, 1 mM 오르토바나데이트 나트륨.
  5. 줄기 마커 - Oct3/4, Nanog, Sox2, Bmi1 및 부하 조절 GAPDH(항체 희 석 관련 재료 표 참조)를 탐침합니다.
  6. ImageJ에서 덴시토메트릭 분석을 이용해 단백질 농도를 정량화할 수 있습니다. 서부 블롯 이미지에서 관심 영역을 선택하고 각 레인에 대한 밀도 프로필을 생성합니다.
  7. 각 레인별로 관심 단백질의 GAPDH 밀도와 상대 밀도를 정규화합니다. 각 단백질의 접힘 변화를 계산하세요.
  8. 어떤 플로팅 소프트웨어든 접힘 단백질 수치 변화를 그래프로 표시하세요.

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결과

비관착 조건에서 유방구체 형성 효율을 평가하기 위해, 프로토콜에 따라 polyHEMA 코팅 판에 대조군 및 Api5 과발현 3D 해리 MCF10A 세포를 시딩하였습니다. Api5 과발현 세포는 대조군에 비해 평균 유방구 형성 효율이 1.58배 증가하는 것을 보였다(그림 1B, C). 이 증가는 Api5의 발현이 높을수록 혈청이 부족한 비부착 조건에서 생존하고 증식하는 줄기세포 유사 전구세포의 비율이 증가하여 클론 유래 구체가 형성됨을 보여줍니다.

주요 유방구는 수집되어 분리된 후 재심어져 2세대 유방구를 형성했습니다. Api5 과발현 세포는 대조군 세포보다 평균 자가갱신 능력이 거의 2.5배 높았습니다(그림 1D,E). 이 결과는 Api5의 과발현이 자가 갱신하는 줄기세포 유사 세포 풀을 증가시켜 연속 통과 과정에...

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토론

기존 암 세포주나 종양 유래 세포의 단층 배양은 암 표현형을 조절하는 다양한 분자 경로에 대한 통찰을 제공하지만, 암 줄기세포에 초점을 맞춘 연구는 2차원 배양에서 수행할 수 없습니다. 암 줄기세포가 현재 치료 후 재발의 주요 원인으로 여겨지므로,이 세포들을 연구하기 위한 강력한 분석법을 구축할 필요가 있습니다. 암 줄기세포 활성을 연구하는 가장 신뢰할 만한 검사법은 생체 내 이식 검사이지만, 더 효율적이고 비용 효율적인 시험관 내 검사가 필요합니다. 유대구체 배양은 암 줄기세포 집단을 연구하는 데 우아하고 비용 효율적인 대안을 제공합니다.

유방구의 1차 생성에서 평가된 유방구 형성 효율은 초기 줄기세포 활성의 척도입니다. 줄기세포의 자기...

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공개 사항

저자들은 잠재적인 이해 충돌이 없음을 선언한다.

감사의 글

이 연구는 SERB-POWER(SPG/2021/002661-G)의 보조금과 일부 IISER, 푸네 코어 자금의 지원을 받았습니다. S.B.는 UGC-SRF 펠로우십으로 자금을 지원받았습니다. MCF10A 세포를 아낌없이 제공해 주신 Raymond C. Stevens 교수님(미국 스크립스 연구소)과 아하무네 바이오사이언스 Pvt. Ltd.의 Abhijith K 박사님께 원고에 귀중한 의견을 주신 데 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.05% Trypsin EDTA  Invitrogen25300062
37 °C 가습 인큐베이터New BrunswickGalaxy 170 R
Anti-Bmi1 토끼 pAbABclonalA134721:1000 희석, 4 °C에서 야간 배양
Anti-GAPDH 항체SigmaG9545-200UL1:10000 희석, 상온에서 1시간 배양
Anti-Nanog 토끼 mAbABclonalA226251:5000 희석, 4 °C에서 야간 배양
Anti-Oct3/4 항체 (C-10)Santa Cruzsc-52791:300 희석, 4 °C에서 야간 배양
Anti-Sox2 항체 (E-4)Santa Cruzsc-3658231:300 희석, 4 °C에서 야간 배양
B-27 보충제 (50x), 비타민 A 제외Invitrogen12587010
원심분리기Beckman CoulterAllegra X-15R
콜레라 독소 Sigma C8052-1MG dH2O에 1 mg/mL 스톡
DMEM/F12Thermo11330032
Dulbecco's 인산염 완충 식염수 (DPBS)Invitrogen14190-144
피부 성장 인자 (EGF) Sigma E9644-0.2MG dH2O에 100 mg/mL 스톡
절대 에탄올 99.9%Jebsen & Jessen GmbH & Co. Germany58051 L05
에틸렌디아민테트라아세트산 디나트륨염 이수화물 (EDTA)SRL43272
고글루코스 DMEM (나트륨 피루브산 제외)Invitrogen11965126
말 혈청  Invitrogen16050122
염산 (HCl)QualigensQ29145Tris-HCl (pH 8.0)의 pH 조정에 사용
하이드로코티손 Sigma  H0888에탄올에 1 mg/mL 스톡
ImageJ 이미지 처리 소프트웨어
ImageQuant LAS 4000 Cytiva
Immobilon Western 화학발광 HRP 기질MerckWBKLS0500
인슐린 Sigma I1882 1% 결산에 10 mg/mL 스톡
Nikon Eclipse TS-100 현미경NikonBM-1919
MCF10A 세포Raymond C. Stevens 교수(Scripps Research Institute, USA)의 선물
페니실린-스트렙토마이신 Lonza 17-602E
페닐메틸설포닐 플루오라이드 (PMSF)Sigma78830-5G
플로팅 소프트웨어 GraphPad Prism 10
폴리(2-하이드록시에틸 메타크릴레이트) (pHEMA)Santacruzsc-25328495% 에탄올에 1.2% pHEMA
염화 나트륨 (NaCl)SRL41721
소듐 데옥시콜레이트Amresco0613-100G
소듐 도데실 설페이트 (SDS)SRL54468
소듐 플루오라이드 (NaF)HiMediaRM1081-500G
소듐 오르토바나데이트Sigma-AldrichS6508-10G
트리스 완충액SRL71033
트리톤 X-100SigmaT8787-250ML

참고문헌

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