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방법 논문

레이리 분해 에어로졸을 통한 mRNA 폴리플렉스의 비강 전달: 비강 증착 및 기능 검사를 위한 시험 관 내 방법

751 조회수

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DOI:

10.3791/70000

⸱

2026년 1월 20일

 ,  , 
1GKT School of Medical Education, Faculty of Life Sciences and Medicine, King's College London, 2Genetics, Faculty of Life Sciences and Medicine, King's College London, 3Institute of Pharmaceutical Science, King's College London

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 Rayleigh 분해를 비바이러스성 mRNA 벡터의 에어로졸라이징을 위한 가벼운 과정으로 제시합니다. 에어로졸화된 mRNA 벡터의 지역적 침착은 앨버타 이상화된 비강 입구(AINI) 모델로 평가됩니다. 인간 폐세포 내 녹색 형광 단백질(GFP) 발현은 에어로졸화 후 mRNA 벡터의 물리화학적 및 생물학적 기능 유지를 나타냅니다.

초록

mRNA 치료제의 비강 내 전달은 병원체 침입 부위에서 직접 면역 활성화를 제공하는 유망한 백신 접종 및 호흡기 질환 치료에 유망한 전략입니다. 그러나 기존의 에어로졸화 방법(예: 초음파 또는 고압 네뷸라이저)은 과도한 전단력으로 인해 비바이러스성 mRNA 벡터를 손상시켜 mRNA의 구조적 완전성과 생물학적 활성을 잃게 만듭니다. 레일리 분해 비강 분무기를 사용해 폴리에틸에네이민(PEI)-mRNA 벡터를 부드럽게 에어로졸화하여 균일한 방울로 만들었습니다. 녹색 형광 단백질(GFP) 암호화 mRNA는 양이온성 폴리플렉스 형태로 제형화되었고, 에어로졸화 전후 과정을 특성화하였습니다. 레일리 분해 공정은 최소한의 전단으로 연속적인 마이크로 제트를 형성하여 나노입자의 물리화학적 특성을 보존합니다. 에어로졸화 전후 입자 크기의 일정함, 낮은 다분산 지수, 안정적인 제타 전위가 관찰되어, mRNA 폴리플렉스의 물리화학적 특성이 레일리 분열을 통해 잘 보존되었음을 확인했습니다. 앨버타 이상화된 비강 흡입구(AINI) 모델을 사용하여 PEI-mRNA 에어로졸을 전달했습니다. 에어로졸화된 mRNA는 주로 하갑개 부위에 침착되었습니다. 비인두 또는 폐 동등한 부위에서는 무시할 정도의 분획이 발견되었다. 또한, 에어로졸화된 후 mRNA 폴리플렉스가 A549 인간 폐 상피 세포에 성공적으로 전달되어 검출 가능한 GFP 발현을 생성하였습니다. 이 프로토콜은 레일리 분해 에어로졸리화를 이용한 비파괴적인 비강 내 mRNA 전달 방식을 시연합니다. 이 방법은 비바이러스성 mRNA 벡터의 물리화학적 특성과 생물학적 기능을 효과적으로 유지하며, 수용상을 표적 비강 침착에 적합한 크기의 방울로 원자화합니다. 이 프로토콜은 mRNA를 효과적으로 에어로졸화하고 비강 내 영역 침착을 평가하는 새로운 접근법을 밝혀냅니다.

서론

비강 점막(많은 호흡기 병원체의 입구)에 백신을 전달하면 강한 국소 면역을 유도하고 감염을 차단할 수 있습니다. 비강 독감 백신의 성공과 최근 비강 내 COVID-19 백신 승인은 점막 및 전신 면역 반응을 유도하는 비강 경로의 효과성을 강조합니다. 따라서 mRNA 백신의 비강 전달은 호흡기 바이러스 감염을 예방하는 전략으로 큰 관심을 받고 있습니다. 그러나 주요 기술적 도전은 연약한 mRNA 폴리플렉스를 안정성을 해치지 않고 흡입 가능한 에어로졸로 전환하는 것입니다.

레일리 분해 에어로졸라이징은 다른 물리적 원리를 사용하여 부드러운 대안을 제공합니다. 레일리 분해 장치에서는 압력이 가해진 액체 흐름이 미세한 오리피스를 통과하여 연속적인 마이크로 제트를 형성합니다. 제트는 자연스럽게 균일한 크기의 물방울로 분해됩니다. 표면 장력으로 인해 액체 컬럼이 노즐 직경의 약 두 배에 달하는 특성적 파장에서 파편화됩니다. 초음파 네뷸리화와 달리, 이 과정은 사실상 난류 전단을 도입하지 않습니다; 물방울은 외부 파쇄 힘이 아니라 제트의 자기 불안정성에서 자연스럽게 형성됩니다. 그 결과 나노입자 조형은 최소한의 스트레스를 받습니다. 레일리 분해를 사용하면 지질 나노입자(LNP) mRNA를 크기, 표면 전하, 캡슐화 효율에 큰 변화 없이 에어로졸화할 수 있음이 입증되었습니다. 3,4,5 전후와 3,4,5 모두가 적용되었습니다. 이 방법에서는 에어로졸화 후에도 PEI-mRNA가 온전하고 기능적으로 유지되며, 이는 더 강한 네뷸리화(네뷸리화) 기법에서 관찰되는 악화와 대조적입니다.

레일리 분해의 또 다른 장점은 액적 크기를 조절할 수 있다는 점입니다. 생성된 방울은 비교적 크며(약 20-30 μm 정도) 있습니다. 이 방울 크기는 비강 전달에 이상적입니다: 공기역학적 직경 >10 μm의 입자는 폐로 이동하기보다는 코와 상기도에 침전되는 경향이 있습니다. 이 임계값 이상에서 주로 방울을 생성함으로써, 레일리 분무기는 자연스럽게 비강 침착을 목표로 삼습니다. 타겟팅은 Alberta 이상화된 비강 흡입구(AINI) 모델을 사용하여 투여 기법을 최적화하여 더욱 강화됩니다. AINI는 3D 프린팅된 비강 기도 복제체로, 생체 내 분사 침착 패턴을 정확히 예측합니다. 이 모델을 사용하면, 콧구멍에 45° 각도로 분사하면 갑갑개7에 대한 침착이 크게 증가하는 것으로 나타났습니다. 투여 각도는 침착 패턴7에 큰 영향을 미칩니다. 비인두나 폐와 같은 비표적 부위에 침착되는 것은 목 자극, 맛 악취, 전신 부작용을 일으킬 수 있으므로 바람직하지 않습니다8. 이 프로토콜에서는 mRNA 에어로졸3의 갑개가 침착을 극대화하기 위해 45° 분사 각도와 통제된 흡입 공기 흐름 조건을 재현했습니다. 이전 데이터에 따르면 전달된 mRNA 질량의 절반 이상이 최적의 조건에서 갑개에 집중될 수 있으며, <10%는 비인두나3 이상에 도달할 수 있습니다. 이 표적 전달은 면역의 유도 부위에 용량을 집중시키고(혈관이 잘 형성되고 면역 세포가 풍부한 부위), 동시에 폐기나 부작용으로 이어질 수 있는 표적 외 침착을 최소화함으로써 백신 효능을 향상시킬 것으로 기대됩니다.

이 방법 논문에서는 레일리 분열을 통한 mRNA의 에어로졸화 실험 절차를 자세히 설명하며, AINI 모델에서 지역 침착을 평가하고 침착된 mRNA의 생체 활성 시험관 내에서 평가합니다. GFP를 암호화하는 리포터 mRNA는 인간 세포에서 형질전환 결과를 시각화하는 데 사용됩니다. HEK293T 셀은 에어로졸화된 복합체의 기능을 시험하기 위해 선택됩니다. 시험 관 내 에어로졸화된 mRNA의 세포 흡수를 촉진하기 위해, mRNA는 PEI와 분지하여 PEI-mRNA 폴리플렉스를 형성한 후 세포에 첨가됩니다. PEI는 양이온성 고분자 형질전환제로 mRNA 전달 효율을 향상시킬 수 있으며, 이전의 유전자 전달 최적화를 바탕으로 N:P(질소: 인산) 몰 비율 24:1이 사용되었습니다. PEI는 본 연구에서 세포 배양 검증 단계에만 사용되며 실제 코에 에어로졸 전달에는 포함되지 않습니다(생체 내에서는 LNP-mRNA만으로 의존하지만, 세포 배양에서는 유전자 발현을 극대화하여 검출을 돕습니다).

이 프로토콜은 mRNA의 에어로졸화 안정성 문제를 해결하는 비강 내 mRNA 백신 전달의 새로운 접근법을 강조합니다. 레일리 분열은 최근에야 핵산 전달에 적용되었으며, 3, 4, 5, 9 연구에서는 이 기술을 구현하기 위한 상세한 방법론적 지침을 제공합니다. 이 단계별 절차를 따라가면 연구자들은 mRNA 나노캐리어의 부드러운 에어로졸화를 재현하고 그 증착 및 형질전환 특성을 평가할 수 있습니다. 아래 프로토콜 섹션은 순차적인 부분으로 구성되어 있습니다: (1) PEI-mRNA 제형; (2) 에어로졸화 전후의 나노입자 특성화(크기 및 제타 전위); (3) 레일리 분해 분무기 및 AINI 비강 증착 절차의 작동 RNase 없는 상태 유지와 적절한 장치 정렬 등 성공을 위한 주요 고려사항들이 언급되어 있습니다. 결과 및 논의에는 대표적인 결과, 기존 접근법에 비해 이 방법이 가진 장점, 잠재적 응용 분야(예: 인플루엔자 또는 COVID-19 비강 백신10,11,12), 그리고 한계 및 문제 해결 팁이 포함되어 있습니다. 이 포괄적인 방법론은 재현 가능한 비강 내 mRNA 전달 실험을 가능하게 하고 바늘 없는 점막 RNA 백신 개발을 가속화하는 것을 목표로 합니다.

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프로토콜

참고: PEI-mRNA 형질염화 전에 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)과 10% 태아 소 혈청(FBS)과 2% 페니실린-스트렙토마이신을 보충한 완전한 배지에서 HEK293T 및 A549 세포주를 배양했습니다. 두 세포주가 합류할 때 약 48시간마다 통과시킵니다. 씨앗 세포 밀도는 40,000 cm²에 달하고, 배양 시간은 ~48시간입니다. 배양지를 제거하고 형질전환 직전에 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 세척하여 잔류 혈청을 제거하고 형질전환 조건을 표준화합니다. 사용 전에 모든 세포 배양 플라스크, 24웰 플레이트, PBS, 피펫, 피펫 팁을 오토클레이브하세요.

1. PEI-mRNA 제형

  1. PEI-mRNA 복합체 형성 ( 시험관 내 형질전환을 위한 것)
    참고: 이 단계는 PEI가 세포 배양에서 형질전환을 촉진하는 데 사용될 때만 필요합니다.
    1. 원하는 N:P 몰 비율에 맞는 PEI 양을 계산하세요.
      참고: N:P = 24(mRNA에서 음전하를 띤 인산염 몰당 양전하를 띤 아민 24몰)를 사용합니다; 10 μg mRNA는 이 N/P 비율에서 PEI-mRNA를 형성하는 데 ~31 μg PEI가 필요합니다.
    2. 희석한 PEI 용액(예: 1 mg/mL 육수를 물에 담가)을 준비하고 오토클레이브합니다.
    3. mRNA를 적절한 농도(예: 0.2 μg/μL)로 희석합니다.
    4. PEI 용액을 mRNA 용액에 넣으면서 부드럽게 섞으세요(소용돌이 방지).
      참고: 혼합물이 작은 튜브 안에 있을 수 있습니다; 피펫을 조심스럽게 위아래로 움직이거나 튜브를 튕겨서 섞으세요.
    5. PEI가 mRNA에 전기적으로 결합할 수 있도록 실온에서 ~20분간 배양하세요.
      참고: PEI를 사용하지 않을 경우, 노출된 mRNA는 직접 에어로졸화될 수 있습니다. 추가된 PEI는 A549 세포에서 유전자 발현을 크게 개선했으나, 독성 문제로 인해 실제 생체 내 전달에는 사용되지 않을 수 있습니다.

2. 나노입자 특성화 (크기 및 제타 전위)

참고: 분석기를 사용해 크기 또는 제타 전위를 측정하기 전에 소프트웨어에서 측정 매개변수를 설정하고 방법으로 저장하세요. 기기 를 작동시키기 위해 방법 설정이 필요하며, 매개변수는 측정 환경, 사용된 큐벳, 샘플의 특성에 따라 달라집니다.

  1. 동적 빛 산란(DLS) 사전 에어로졸화
    1. 입자 크기 분석기를 사용해 희석된 조형 샘플을 일회용 크기 큐벳(예: 0.2 μg/μL에서 500 μL)에 적재합니다.
    2. 분석기를 켜고 연결된 컴퓨터에서 소프트웨어13 을 엽니다.
    3. 창 상단의 측정 버튼을 클릭하세요.
    4. 창 상단의 파란색 파일 아이콘을 클릭하면 프리셋 크기 방법을 선택하세요.
    5. 프로토콜 이름을 샘플 이름에 맞게 변경하세요.
    6. 분석기의 뚜껑 버튼을 눌러 챔버를 열어.
    7. 큐벳을 챔버에 넣으세요.
    8. 소프트웨어 창 상단의 초록색 실행 버튼을 클릭하세요. 측정이 완료될 때까지 기다려13.
    9. 소프트웨어 창 상단의 분석 버튼을 클릭한 후, 결과페이지 13의 크기 버튼을 클릭하세요.
    10. 통계표에서 평균 유체역학적 직경(Z-평균)과 다분산 지수(PDI)를 구합니다.
    11. 분석기의 뚜껑 버튼을 눌러 챔버를 열고 쿠벳을 꺼내 뚜껑을 닫으세요.
    12. 큐벳을 폐기하고 아토마이저를 RNAase 무첨가물과 70% v/v 에탄올로 헹구어 크기(Size 측정) 사이에 건조를 돕기 위해 소독하고 건조를 돕습니다.
      참고: 레일리 아토마이저의 경우, 노즐에 염분 침전이나 잔여물이 남아 있지 않도록 주의하세요. 이로 인해 분사 성능이 달라질 수 있습니다.
  2. 제타 전위 에어로졸화
    1. 같은 기기(또는 Zeta 전위 분석기)를 사용하고, 희석된 조형 샘플을 접힌 모세관 셀(예: 0.2 μg/μL에서 700 μL)에 적재합니다.
    2. 분석기를 켜고 연결된 컴퓨터에서 소프트웨어13 을 엽니다.
    3. 창 상단의 측정 버튼을 클릭하세요.
    4. 창 상단의 파란색 파일 아이콘을 클릭하면 프리셋 Zeta 메서드를 선택하세요.
    5. 프로토콜 이름을 샘플 이름에 맞게 변경하세요.
    6. 분석기의 뚜껑 버튼을 눌러 챔버를 열어.
    7. 큐벳을 챔버에 넣으세요.
    8. 소프트웨어 창 상단의 초록색 실행 버튼을 클릭하세요. 13번 돌리는 기계를 기다려.
    9. 소프트웨어 창 상단의 분석 버튼을 클릭한 후, 결과페이지 13의 Zeta 버튼을 클릭하세요.
    10. 통계표를 통해 제타 퍼텐셜(표면 전하)을 구할 수 있습니다.
    11. 분석기의 뚜껑 버튼을 눌러 챔버를 열고 샘플을 꺼내 뚜껑을 닫습니다.
    12. 큐벳과 분무기를 RNAase 없는 물과 70% v/v 에탄올로 헹구어 Zeta 전위 측정 사이에 소독하고 건조를 돕습니다.
      참고: 레일리 아토마이저의 경우, 노즐에 염분 침전이나 잔여물이 남아 있지 않도록 주의하세요. 이로 인해 분사 성능이 달라질 수 있습니다.

3. 레일리 분해 에어로졸화 및 비강 침착

  1. 아토마이저와 AINI 설치
    1. Rayleigh 분해 비강 분화기와 Alberta 이상화된 비강 흡입구(AINI) 모델을 조립하세요.
      참고: AINI 모델은 인간 비강의 다양한 부위(예: 콧구멍 전정, 갑개 부위, 후각 부위, 비인두)에 해당하는 해부학적으로 대표적인 속이 빈 단면으로 구성되어 있습니다.
    2. 사용 전에 모든 AINI 부품이 깨끗하고 건조한지 반드시 확인하세요(잔류물이 증착 결과를 바꿀 수 있습니다). 이온수9 로 세척한 후 에탄올이나 유기 용매로 세척하세요.
    3. AINI를 배출구에 진공 펌프와 연결된 차세대 임팩터(NGI)에 연결하여 비강 통로를 통해 공기 흐름을 끌어들입니다.
    4. 유속 속도를 7.5 L/min으로 설정하세요 - 성인의 느리고 깊은 코 흡입을 나타내는흐름입니다. NGI의 유도 포트에 부착된 보정된 유량계(또는 로타미터)를 사용하세요. 펌프를 조절하여 유량계가 7.5 L/min을 가리킬 때까지 조절하세요.
      참고: 테스트에 필요한 유량으로 유량계를 사용해 공기 흐름을 측정하세요.
    5. 분사 지속 시간 동안 이 공기 흐름을 유지하세요. Parafilm을 사용해 장치를 AINI에 제대로 밀봉하세요.
  2. 아토마이저 위치
    1. 레일리 분해 분무기 노즐을 AINI 노스톨(현관 구간) 입구에 45° 각도로 삽입합니다.
    2. 아토마이저를 작동시 움직이지 않도록 고정하세요(모든 연결부, 모델 구간, 펌프 튜빙)은 밀폐되어 있습니다.
  3. 샘플 적재 중
    1. 준비된 PEI-mRNA 현탁액을 부드럽게 섞어 균질성을 확보하세요(기포 생성 방지).
    2. 샘플을 분무기 저장소로 끌어당깁니다.
      참고: 장치 설계에 따라 아토마이저에 부착되는 주사기나 피펫 팁을 채우는 작업이 포함될 수 있습니다.
    3. 샘플을 장치에 넣어.
      참고: 예를 들어, 아토마이저의 중앙 캡이나 챔버를 제거하고 샘플을 피펫으로 넣은 후 장치를 안전하게 재조립하세요. 누수가 없는지, 필요하다면 기기가 제대로 프라이밍되었는지 확인하세요.
  4. 에어로졸 생성
    1. 장치 설명서에 따라 분사 시작 전이나 동시에 에어 펌프의 공기 흐름(AINI를 통한 7.5 L/min)을 켜세요.
    2. 레일리 분열기 아토마이저를 작동시켜 에어로졸화를 시작하세요.
      참고: 수동 주사기 구동 아토마이저의 경우, 주사기 플런저를 꾸준히 눌러서 액체가 오리피스를 통과하도록 하세요. 가능하다면 샘플 전체 부피를 한 번에 연속으로 뿌리세요. 플런저는 안정적인 작동 압력을 생성하기 위해 부드럽게 눌러야 하며, 이는 조형이 마이크로 오리피스14 내부에서 압력이 상승하고 벽 전단률에 노출된 후에야 에어로졸화되기 때문입니다. 빠른 플런저 움직임은 압력을 변화시키며, 따라서 전단률과 전단 노출 시간 모두를 변화시킵니다14.
    3. 전체 흐름 속도가 7.5 L/min으로 유지되도록 하세요. 에어로졸 방울은 비강 모델을 통해 이동하며, 공기역학적 크기에 따라 다양한 영역에 침착되어야 합니다.
    4. 이미 쌓인 물방울이 더 아래로 빨려 들어가거나 고르지 않게 마르지 않도록 공기 펌프를 즉시 끄세요.
  5. AINI에서 샘플 채취
    1. AINI 모델을 각 부위에서 침착된 나노입자를 수집하기 위해 각 해부학적 구간으로 신중하게 분해합니다.
      참고: 분해하기 전에 섹션 위치를 기록하거나 표시해 두세요.
    2. 여섯 구획에서 침착물을 수집합니다: (i) 분모 장치, (ii) 비강 전정 구간, (iii) 갑갑개 구간, (iv) 후각 영역, (v) 비인두 구간, 그리고 (vi) 하류 포획(예: 부착된 NGI의 단계나 폐 침투 분율을 나타내는 최종 필터)
    3. 각 구획마다 측정된 세포 배양 배지를 사용해 침착된 물질을 세척합니다.
      참고: 예를 들어, 하갑개 침착물을 채취할 때는 하갑개 부위를 분리하여 일회용 피펫을 사용해 5mL의 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)으로 내부 표면을 철저히 헹군 것입니다. 모든 표면을 부드럽게 세척한 후, 세척액을 라벨이 붙은 15mL 원심분리관에 부으세요(깔때기를 사용해 이동을 돕습니다). 헹군 시에는 세그먼트를 수평으로 또는 약간 기울여 내부 표면에 완전히 접촉하도록 하여 액체가 빠져나가지 않도록 했습니다. 전정, 후각, 비인두 및 기타 절편에 대해서도 5mL 신선한 DMEM을 사용해 각각 별도의 라벨링된 튜브에 수집하여 동일하게 반복합니다.
    4. 아토마이저 장치에서 남은 샘플을 회수하세요.
      참고: 주사기형 경우, 주사기와 노즐을 튜브에 담아 세척하세요.
    5. AINI가 NGI에 연결되어 미세 입자를 포획하는 경우(예: DMEM로 단계를 헹구는 방식) 액체를 회수하세요.
    6. 모은 액체로 튜브를 막으세요.
      참고: 벤치 표면이나 증발로 빗방울을 흘려보내지 않도록 주의하세요.
  6. 수거 후 처리
    1. 채취 직후, PEI-mRNA 샘플은 별도로 세포에 이식되어 형질전환을 진행했습니다.
      참고: PEI-mRNA 샘플은 형질전환 전에 냉장고에 약 1-2시간(최대 6시간)만 보관할 수 있습니다. 각 수집된 PEI-mRNA 샘플에서 일정 부피(최대 1mL)를 추출하여 에어로졸화 후 벡터(즉, DLS 및 제타 측정)를 특성화합니다.
  7. 장비 청소
    1. 각 실행 후 아토마이저와 AINI 모델을 철저히 청소하여 후속 실험의 교차 오염을 방지하세요.
    2. AINI 절편과 분무 부품을 탈이온수로 세척하여 매체와 나노입자를 제거하고, 70% 에탄올로 소독하고 건조를 돕습니다.
      참고: 기기나 모델에 작은 구멍이 있다면 주사기로 세척하세요.
    3. 모든 부품을 완전히 공기 중에 말리거나(또는 낮은 온도의 건조 캐비닛에 넣어두세요) 다시 조립하세요. 레일리 아토마이저의 경우, 노즐에 염분이나 잔여물이 남아 있지 않도록 주의하세요. 이들은 분사 성능에 영향을 줄 수 있습니다.

4. 세포 영상

참고: 형질전환 후에는 형질전환 배지를 제거하고 신선한 완전 배지로 교체하여 노출을 종료하세요. 리포터 발현과 세포 회복을 위해 48시간 동안 세포를 배양합니다. ~80% 합류율에서 세포를 4% 포름알데히드로 8분간 고정한 후, 핵을 4',6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI; 300 nM)으로 5분간 염색한 후 영상 촬영 전에 2회 PBS 세척을 합니다.

  1. 형광 영상
    1. DAPI와 GFP용 필터 세트가 장착된 형광 현미경을 사용하세요.
    2. 우선 블루 채널(여기 파장 = 385 nm, 방출 파장 = 477.5 nm)에서 시작하여 DAPI 염색된 핵을 시각화합니다.
    3. 그린 채널(여기 파장 = 488 nm, 방출 파장 = 525 nm)로 전환하여 GFP 양성 세포를 시각화하세요.

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결과

방법에 초점을 맞춘 원고로서, 상세한 결과가 주된 목표는 아닙니다; 그러나 프로토콜의 각 부분에서 예상되는 결과를 보여주기 위해 대표적인 결과가 제시됩니다. 아래에 언급된 그림들은 이 방법의 타당성을 뒷받침하는 예시 데이터(예: 그래프나 이미지)를 보여주지만, 시연 이상의 새로운 정량적 분석은 포함되지 않았습니다.

방울 크기 및 침전 패턴:
레일리 분열기 분무기는 mRNA 폴리플렉스의 물리화학적 특성을 보존했으며, 그림 1에서 볼 수 있는 것처럼 에어로졸화 전후 측정 간에 약간의 차이가 있었습니다. 이 방법은 고르게 분사된 고른 물방울을 생성했으며, 주로 비강 모델의 의도된 부위에 침전되었다. 성공적인 mRNA 폴리플렉스는 일반적으로 직경이 100-150nm 범위에 있으며, PDI는 낮은 ...

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토론

이 프로토콜에서는 제형을 에어로졸화하기 전에 mRNA에 PEI를 분지하여 세포 흡수를 촉진합니다. 이는 시험관 내 검증 중 LNP-mRNA 전달의 대리 역할을 합니다10,15. PEI-mRNA는 중요한 생물학적 및 기능적 특성을 포함한 LNP 조형의 대부분 기능을 보존합니다10. PEI의 양전하를 띠는 아민기는 정전기 상호작용을 통해 음전하를 띤 mRNA와 결합하여 200 nm보다 작은 나노 규모 조립체를 형성합니다. PEI-mRNA 응축액은 세포를 형질전환하고 시험관 내에서 번역할 만큼 충분히 안정적입니다. PEI-mRNA는 또한 세포 내 GFP 발현을 감지하는 강력한 시험관 리포터 시스템으로, 에어로졸화 후 PEI-mRNA의 생물...

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공개 사항

저자들은 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

저자들은 킹스 학부 연구 펠로우십(KURF)과 킹스 칼리지 런던에서 제공한 학생 기회 기금의 재정 지원을 인정했습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
50 mL 원심분리기 튜브시그마-올드리치 컴퍼니 리미티드CLS430829-500EA
50– 1000 & mu; L 피펫 팁시그마-올드리치 컴퍼니 리미티드Z740031-1000EA
A549 세포주미국 타체 문화 컬렉션ATCC CRM-CCL-185
공기 유량계해당 없음해당 없음일반적인 공기 유량계를 사용할 수 있습니다.
앨버타 이상화된 비강 인구 (AINI) 모델TSI 주식회사 (영국 코플리 사이언티픽 경매)0001-01-8540
오토클레이브 표시 테이프시그마-올드리치 컴퍼니 리미티드Z744090
다피시그마-올드리치 컴퍼니 리미티드D1306
DMEM (둘벡코 변형 독수리 중간)깁코, 써모피셔 사이언티브11966025
에틸 알코올, 순수시그마-올드리치 컴퍼니 리미티드32221-M머크를 통해 구매됨
태아 소 혈청 (FBS)깁코, 써모피셔 사이언티브A5256701
포름알데히드시그마-올드리치 컴퍼니 리미티드F8775
HEK293T 세포주미국 타체 문화 컬렉션ATCC CRL-3216
헤레우스 HERAsafe HS 12 생물안전 캐비닛헤라이우스해당 없음
차세대 임팩터MSP는 TSI의 한 부서입니다0170-01-1000이 제품은 코플리 카탈로그 5201 부호에도 포함되어 있습니다.
니콘 DS-Qi2 흑백 현미경 카메라니콘해당 없음
Nunc 세포 배양 처리된 멀티디시써모피셔 사이언티브142475
Nunc EasYFlask 세포 배양 처리 플라스크써모피셔 사이언티브156340
파라필름시그마-올드리치 컴퍼니 리미티드P7793-1EA
페니실린-스트렙토마이신 (10,000 U/mL)깁코, 써모피셔 사이언티브15140148
인산염 완충 식염수(PBS) 정제써모피셔 사이언티브18912014
폴리에틸레니민 염산염시그마-올드리치 컴퍼니 리미티드764965-1GSLS를 통해 구매됨
레일리 제트 비강 아토마이저레시카 BV 엔스헤데소프트 비강 스프레이 어댑터
RNAse 자유수써모피셔 사이언티브J60610. EQC
큐벳 크기 맞추기말번 파날리티컬ZEN0040
접힌 모세관 세포말번 파날리티컬DTS1070
제타타이저 프로말번 파날리티컬제타타이저 프로
Zetasizer 울트라-프로 ZS Xplorer 소프트웨어말번 파날리티컬해당 없음

참고문헌

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