세포 분리 시스템과 드롭렛 디지털 PCR을 이용한 순환 희귀 세포에서 표피 성장인자 수용체 DNA 돌연변이 프로파일링

요약

여기서는 전혈과 폐암 세포가 급증한 인공 샘플에서 희귀 암세포를 분리하는 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 반자동화된 라벨 없는 셀 분리 플랫폼을 사용합니다. 비축된 세포는 이후 드롭렛 디지털 PCR을 사용하여 표피 성장인자 수용체 돌연변이가 있는지 분석합니다.

초록

표피 성장 인자 유전자(EGFR) 내에서 발견되는 돌연변이는 폐암 환자에게 가장 효과적인 치료를 결정하는 데 매우 중요합니다. EGFR 돌연변이에 대한 정기 검사는 종양 생검이나 폐암 환자의 혈장 ctDNA 분석 형태를 취할 수 있습니다. 폐암 환자의 혈액 샘플 검사는 ctDNA 또는 CTC 검출을 통해 폐암의 존재 또는 재발 여부를 파악하기 위해 일상적으로 수행되지만, 일반적으로 포획된 세포에 대한 이후의 분자 분석은 포함되지 않습니다. 희귀 순환 종양 세포(CTC) 내에 존재하는 EGFR 유전자 내 개별 돌연변이를 검출하는 것은 표적 치료의 잠재적 효능에 대한 추가적인 통찰을 제공할 수 있으며, 특히 비소세포폐암(NSCLC)에서 환자 예후에 영향을 미칠 수 있습니다. 안타깝게도, 이러한 순환 종양 세포의 희귀성과 그 유전체 정보를 조사할 간소화된 절차의 부재는 상당한 탐지 도전을 제기합니다.

이 프로토콜의 목표는 전혈에서 CTC를 포착하고 ddPCR을 이용해 그 분자 성분을 평가하는 현실적인 가능성을 보여주는 것입니다. 반자동 크기별 세포 분리 플랫폼을 사용하여 순환 중인 종양 세포를 포획했고, 이후 회수하여 후속 분자 분석에 사용되었습니다. 포획된 세포의 유전체 DNA 내 특정 EGFR 돌연변이 존재를 확인하기 위해, ddPCR은 EGFR pT790M과 EGFR pL858R에 대한 분석법을 사용하여 수행되었습니다.

두 개의 별도 폐암 세포주(A549와 H1975)를 전혈에서 적극적으로 농축하였으며, H1975 세포주 내에 존재하는 돌연변이를 ddPCR을 사용해 정확한 정량화를 수행하였습니다.

서론

액체 생검의 가치에 대한 지속적인 중개 연구와 최근 치료^{법 선택에서} ctDNA 모니터링의 임상적 가치를 구체적으로 보여주는 논문들이 발표되면서, 액체 생검이 점차 성숙해지고 있습니다. 액체 생검은 기존 조직 생검 방법과 비교할 때 암 모니터링과 예후를 위한 대체적이고 덜 침습적인 방법을 제공합니다. 광범위한 연구는 혈액에서 발견되는 단편화된 DNA(세포 자유 DNA, cfDNA), 특히 종양에서 유래하는 하위 구획인 순환 종양 DNA(ctDNA)에 집중되어 왔습니다. ctDNA는 지난 20년간 광범위하게 연구되었으며, SNV와 구조 변이와 같은 종양 특이적 유전자 돌연변이뿐만 아니라 메틸화 마커와 비종양 cfDNA와 비교했을 때 뚜렷한 조각 패턴을 포함하고 있음이 밝혀졌습니다. 이 특정 ctDNA 특성은 현재 암 환자의 분자 상태를 조기 발견, 치료 반응, 최소 잔존 질환(MRD), 치료 내성 상태를 모니터링하는 데 활용되고 있습니다. 마찬가지로, 원발 종양 부위에서 혈관으로 분리된 순환 종양 세포(CTC)는 최근 유망한 바이오마커로 진화했으며, 혈액 내 존재와 양이 질병 진행 및 재발 가능성과 밀접한 상관관계를 보였습니다. 초기 CTC 연구는 주로 단백질 마커 발현과 열거에 의존^했으나, 유방암의 에스트로겐 수용체 1(ESR1)의 유전체 돌연변이 검출과 다양한 암의 표피 성장 인자 유전자(EGFR) 등 분자 수준에서 CTC 연구에 의미 있는 진전이 있었습니다.

EGFR 돌연변이는 발병기전 및 예후 결정뿐만 아니라 폐암 환자에 가장 효과적인 치료법을 결정하는 데에도 매우 중요합니다³. EGFR 돌연변이에 대한 정기 검사는 진단 또는 진행 시 고형 종양 생검 또는 최근에는 재발/난치성^{폐암 환자의} 혈장 ctDNA 샘플링 형태로 나타날 수 있습니다. 그러나 ctDNA 기반 접근법과 달리, CTC 유전자 유전체 물질 분석은 온전한 종양 세포와 그 돌연변이 프로필을 직접 평가할 수 있게 합니다. ctDNA MRD 연구와 함께, 희귀 CTC의 EGFR 유전자 내 돌연변이 검출은 치료 요법의 잠재적 효능과 그 이상으로 비소세포폐암(NSCLC)에서 환자 예후에 대한 추가 이해를 제공할 수 있습니다. CTC의 희귀성과 클리닉에서 사용자 친화적인 도구를 활용한 간소화된 프로토콜의 부재는 광범위한 도입에 심각한 장애물이 됩니다. 이러한 한계는 효율적인 CTC 분리와 하위 분자 분석을 모두 가능하게 하는 표준화되고 접근 가능한 워크플로우의 필요성을 강조합니다. 따라서 본 연구의 목표는 세포 분리와 디지털 PCR 접근법을 결합하여 순환 종양 세포의 농축과 EGFR 돌연변이 검출을 위한 재현 가능한 워크플로우를 제시하는 것입니다.

제네시스 세포 분리 시스템은 마이크로플루이딕 세포 포획 슬라이드를 이용해 CTC를 반자동화 공정으로 포획할 수 있으며, 이는 1차 백혈구 및 적혈구 집단에 비해 크기가 크고 변형성이 적다는 점을 바탕으로 높은 생존율과 높은 포획 효율을 제공합니다 ^5,6. 포획된 CTC는 미세유체 세포 캡처 슬라이드에서 역류를 통해 회수하여 추가 유전체 분석을 수행할 수 있습니다. 포획된 세포의 유전체 DNA 내 특정 EGFR 돌연변이 존재를 확인하기 위해, DDPCR은 CTC 유래 유전체 DNA에 EGFR T790M 및 L858R 분석법을 사용하여 수행했습니다.

이 프로토콜은 모델 CTC 샘플과 상업적으로 이용 가능한 ddPCR 분석법을 사용하여 CTC에서 암 관련 돌연변이를 표적으로 검출할 수 있는 진입점을 보여주기 위해 설계되었습니다. 이 프로토콜은 순환 종양 세포에서 암 관련 돌연변이를 검출하는 실용적인 접근법을 제공하며, 액체 생검 응용 연구를 지원할 수 있습니다.

프로토콜

윤리적 선언:

혈액 샘플은 연구용으로 허가된 출처에서 채취되었으며, 샘플 수집 전에 모든 기증자로부터 서면 동의를 받았습니다. 인간 혈액 샘플을 포함한 모든 실험 프로토콜은 혈액 공급업체인 Discovery Life Sciences(앨라배마, 미국 소재)의 기관심의위원회(Institutional Review Board)의 검토 및 승인을 받았습니다. 인간 혈액 샘플과 관련된 모든 절차는 기관 연구 위원회의 윤리 기준과 헬싱키 선언에 따라 수행되었습니다.

1. 반자동 세포 분리 시스템을 이용한 암세포 농축

참고: 이 절에서는 반자동 세포 분리 플랫폼을 이용한 순환 종양 세포(CTC)의 농축 과정과 드롭렛 디지털 PCR을 이용한 EGFR 돌연변이 검출에 대해 설명합니다. 모델 CTC 샘플을 사용하여 실현 가능성을 입증하며, 임상 적용 전에 분석법 검증을 권장합니다. 두 가지 비소세포폐암(NSCLC) 세포주인 NCI-H1975(EGFR L858R/T790M 돌연변이)와 A549(EGFR 야생형)가 사용되었으며, A549는 돌연변이 검출의 음성 대조군으로 작용했습니다.

1. 혈액 샘플
   1. 혈액 채취 전에 헌혈자/환자로부터 사전 동의를 받도록 하세요. 혈액을 포함한 인간 표본을 포함한 연구에 대해서는 필요 시 기관심의위원회(IRB)의 승인을 받아야 합니다.
   2. 타당성 테스트의 경우, 연구용으로만 공인된^{3자 공급업체} 에서 혈액 샘플을 채취하세요.
   3. 말초혈을 에틸렌디아미네테트라아세트산(EDTA) 튜브에 채취하여 48시간 이내에 제네시스 농축 프로토콜을 통해 샘플을 처리합니다.
      참고. 후속 분석 및 Genesis Enrichment 프로토콜을 위해서는 EDTA 튜브가 권장됩니다. 스트렉과 EDTA 튜브는 제네시스 열거 프로토콜(직접/간접)을 이용한 슬라이드 면역염색에 사용할 수 있습니다.
   4. 혈액 샘플은 EDTA 튜브에 2–8°C에서 보관하여 사용 전까지 보관합니다. 제네시스 세포 분리는 전처리가 필요 없으며, 농축 프로토콜에 최대 10 mL 전혈을 사용할 수 있습니다.
2. 모델 CTC 샘플/임상 샘플 준비
   1. 100–1,000 세포 농도로 적절한 세포 배양 배지 또는 인산 완충 식염수(PBS) 완충액에 세포 저장액을 준비합니다. 임상 샘플을 사용 중이라면 이 단계를 건너뛰세요.
      참고: 본 연구에서 사용된 스파이킹 농도는 일반적으로 관찰되는 임상 CTC 수준보다 높으며, 이는 방법 시연 목적으로만 제공됩니다.
   2. 건강한 기증자의 전혈 10 μL 용액을 최대 10 mL 전혈에 첨가하여 모델 CTC 샘플을 만듭니다. 임상 샘플의 경우, 환자의 전혈 샘플에 암세포를 포함하지 마십시오.
   3. 혈액 샘플을 같은 양의 PBS(1배)와 섞고, 실온에서 혈액 락커 위에서 부드럽게 저어 사용하세요. 보관 시간이 1시간을 초과하면 4°C에서 보관하세요.
3. CTC 농축
   1. 제네시스 세포 격리 시스템을 켜고 시스템 초기화를 기다려. 이 과정은 최대 5분까지 걸릴 수 있습니다.
   2. 폐기물 통을 스테이션 베이 바닥에 놓고 폐기물 통 튜브를 폐기통에 연결하세요.
   3. 파이프를 핀치 밸브에 눌러 넣어 딸깍 소리가 나는 느낌이 들 때까지 누르고, 제네시스 시스템 튜브를 폐기물 통 출구에 연결하세요.
   4. 홈 화면에서 "시작"을 누르고 화면의 '셀프 테스트'를 터치하여 셀프 테스트를 실행하세요.
   5. 자가 검사가 완료되면 선택 프로토콜 옵션에서 '2.0 키트 강화' 를 선택하세요.
   6. 화면의 지시를 따라 필요한 데이터 입력란을 채우고 프라이밍 및 조립 절차를 완료하세요. 70% 에탄올과 1배 PBS를 사용한 성공적인 프라이밍은 DNA 추출 시 최고의 세포 포획 성능과 회복을 제공합니다. 프라이밍은 약 20분 정도 걸립니다.
   7. 적절한 농축 프로그램(2.0 키트 농축)을 선택하고, 모든 튜빙 연결과 슬라이드 위치가 제대로 고정되었는지 확인하여 운행을 시작하세요. 시료 적재 시 기포를 도입하지 마세요. 이는 유동 일관성과 포집 효율에 영향을 줄 수 있습니다.
   8. Step 1.2.3(모델 CTC 샘플/임상 샘플 준비)에서 준비한 모델 샘플을 입구 깔때기로 부드럽게 분배한 후, 시스템 화면에서 '재개' 버튼을 눌러 농축 프로토콜을 계속 진행하세요.
   9. CTC 포집이 완료되면 반자동 셀 격리 시스템이 사용자에게 폐기물 통을 제거하고 프라이밍 저장소를 다시 부착하라는 안내를 합니다.
   10. 제네시스 시스템 튜빙을 폐기병에서 분리하고 4mL의 희석 버퍼를 프라이밍 저장소에 피펫으로 주입하세요.
   11. 역류 어댑터를 프라이밍 저장소에 부착하고 제네시스 시스템 튜빙에 다시 연결하세요. 화면에서 '재개' 버튼을 눌러 농축 프로토콜을 계속하세요. 이로 인해 마이크로유체 슬라이드에 포획된 세포가 역류를 통해 입구 깔때기로 방출됩니다.
   12. 회수된 세포는 입구 깔때기에서 5.0 mL 에펜도르프 튜브로 피펫으로 옮겨 수집합니다. 흡입구 깔때기에는 4mL를 초과할 수 있는 모든 수용성 샘플을 반드시 수집하세요.
   13. 회수한 샘플을 600g 원심분리기에서 5 분간 원심분리하여 세포 용해를 위해 포획된 세포를 펠릿으로 제거하세요.
   14. 상액을 조심스럽게 제거하고 DNA 추출 프로토콜(섹션 1.4)으로 진행하세요.
4. DNA 추출
   주의: DNAzol BD는 피부에 닿거나 섭취하면 해롭습니다. 피부와 눈과의 접촉을 피하세요. 화학 훈제 후드 환경에서만 사용하고, 안개, 증기, 스프레이를 흡입하지 마세요. 피부와 접촉하면 즉시 물로 세척하세요.
   1. 1.3.14단계에 따라 DNAzol BD 1mL를 튜브에 직접 첨가합니다.
   2. 샘플 전체 부피를 새로운 Eppendorf DNA LoBind 1.5 mL 마이크로 원심분리관으로 옮기고 세게 흔듭니다.
   3. 튜브를 실온에서 5분간 부양하세요. 튜브를 강하게 소용돌이로 돌리고 최소 4분간 실온에서 배양하세요.
   4. DNA 회수를 극대화하기 위해 용해 및 침전 단계에서 완전한 혼합을 보장하세요. RNA 오염이 우려되는 경우 선택적 RNase 처리가 포함될 수 있습니다.
   5. DNAzol BD 세포 용해액 샘플 혼합물에 400 μL 이소프로판올을 직접 첨가합니다.
   6. 튜브를 10,000g에서 6분간 원심분리하여 DNA를 침전시킵니다.
   7. 원심분리 후 상원액을 제거하고 0.5mL DNAzol BD를 부드럽게 첨가하여 알릿 DNA에 첨가합니다.
   8. DNA 펠릿이 완전히 퍼질 때까지 튜브를 소용돌이로 돌립니다.
   9. 혼합물을 10,000g에서 5분간 원심분리합니다.
   10. 상청액을 제거하고 75% 에탄올 1mL를 피펫팅하여 DNA 펠릿을 세척합니다.
   11. 9단계부터 10단계까지 반복하여 총 두 번의 세척을 합니다.
   12. 마이크로피펫을 사용해 튜브 바닥에 남아 있는 에탄올을 제거합니다.
       참고: 펠릿이 완전히 건조되지 않도록 주의하세요.
   13. CTC 샘플에서 DNA를 용해시키기 위해 DNase/RNase-free 이온수(DI) 20 μL을 첨가합니다.
   14. Qubit 1x dsDNA 고감도 분석 키트나 Bioanalyzer 고감도 DNA 분석과 같은 dsDNA 정량 분석 키트/플랫폼을 사용하여 샘플 내 이중 가닥 DNA(dsDNA)를 정량할 수 있습니다.
   15. 추출한 DNA 샘플은 분해를 방지하기 위해 4 °C 또는 -20 °C 온도에 보관합니다.
       일시정지: 추출된 DNA 샘플은 단기 저장을 위해 -20°C, 장기 저장을 위해 -80°C에서 보관할 수 있으며, 이후 분석으로 넘어갑니다.

2. ddPCR을 이용한 EGFR 돌연변이 분석

디지털 PCR은 희귀 돌연변이를 높은 민감도와 정밀도로 검출하는 데 적합한 방법입니다. 단일 튜브에서 제공되는 ddPCR 돌연변이 검출 분석법은 일반적으로 돌연변이 대립유전자를 표적으로 하는 FAM 표지 프로브와 야생형 대립유전자를 표적으로 하는 두 번째 HEX 표지 프로브를 포함합니다.

1. 반응 설정 및 방울 생성
   1. ddPCR 슈퍼믹스를 해동하고, ddPCR 돌연변이 검출 분석법을 얼음 위에 사용하세요.
   2. 각 튜브마다 소용돌이를 하여 내용물이 균질하게 유지되도록 하는데, 이는 -20 °C에서 저장 중 농도 구배가 형성될 수 있기 때문입니다.
   3. 튜브 바닥의 퇴적물을 원심분리하여 얼음 위에 올려놓습니다.
   4. 표 1의 레시피에 따라 반응 혼합물을 준비하기 전에 원하는 농도로 추출한 DNA 샘플을 준비하세요.
   5. 슈퍼믹스, 분석법, 제한효소, 그리고 검사에 필요한 모든 샘플에 물을 넣은 프리믹스를 만들고, 마지막 반응 성분으로 샘플 DNA를 개별적으로 추가하세요. 최종 DNA 샘플 농도가 50 fg–100 ng로 유지되도록 하세요.
      참고: 액상 생성 전에 제한 소화를 통한 DNA 분절이 정확도 향상, 점도 감소, 템플릿 접근성 향상을 위해 권장됩니다. ddPCR 설정 시 2–5 U의 제한효소를 이용한 직접 소화가 권장됩니다. EGFR 점 돌연변이 분석(T790M/L858R)에는 MseI가 권장되며; 맞춤화 전에 호환 가능한 효소에 대한 분석법 데이터 시트를 참고하세요. 개별 검사에 대한 데이터 시트는 Bio-Rad 디지털 검사 포털(Bio-Rad Droplet Digital PCR Assays | 홈)
   6. 최소 한 개의 웰에 대해 야생형 템플릿만 포함하고, 미확인 샘플 농도와 유사한 농도를 가진 음성 대조군을 준비하세요.
   7. 반응관을 완전히 혼합하기 위해 소용돌이를 사용하고, 각 반응관의 바닥에 모든 샘플을 잠시 원심분리하여 침전시킵니다. 반응관을 실온에서 2분간 평형으로 두세요.
   8. 각 반응 혼합물 20 μL을 마이크로플루이딕 카트리지(DG8 카트리지) 샘플 웰에 주입한 후, 75 μL의 액적 생성 오일을 오일 웰 내 프로브로 주입합니다.
   9. 카트리지를 가스켓으로 덮고 QX200 드롭렛 제너레이터에 넣으세요.
   10. 드롭렛 제너레이터 상단의 버튼을 눌러 뚜껑을 닫으세요. 뚜껑이 닫히면 비말 생성이 자동으로 시작됩니다. 이 절차는 마이크로플루이딕 카트리지의 마이크로채널 내 샘플과 오일을 결합하여 각 샘플마다 ~20,000 나노리터 크기의 방울로 구성된 에멀젼을 만듭니다.
2. PCR 증폭 (열 사이클링 조건)
   1. 표 2에 권장되는 열사이클러의 열 사이클링 조건을 프로그래밍하세요.
   2. 방울 생성이 완료되면 기기의 모든 불빛은 초록색으로 고정됩니다. 드롭렛 제너레이터의 버튼을 다시 눌러 기기를 열고 카트리지 홀더와 카트리지를 제거하세요.
   3. 일회용 가스켓을 제거하고 카트리지에서 45 μL의 방울을 흡인하며, 피펫 팁에 약간의 각도를 두어 방울 파쇄를 방지하세요.
   4. ddPCR 96-웰 플레이트에 방울을 분사한 후 PX1 PCR 플레이트 실러를 이용해 PCR 플레이트 히트 씰로 플레이트를 밀봉합니다.
   5. 드롭이 포함된 96웰 플레이트를 밀봉한 후, 96웰 플레이트를 2.2.1단계에서 준비한 열 사이클러로 조심스럽게 옮기고 열 사이클링을 시작하세요.
3. 액자 판독 및 데이터 분석
   1. ddPCR 드롭렛 리더 기기(QX200 드롭렛 리더 또는 QX600 드롭렛 리더)와 QX 매니저 소프트웨어가 설치된 연결된 컴퓨터를 실행하세요.
   2. 열 사이클링 단계가 완료되면 밀봉된 96웰 플레이트를 드롭렛 리더 기기로 옮깁니다.
   3. QX 매니저 소프트웨어를 열어 실험 설계를 기반으로 새로운 판 레이아웃을 구성할 수 있습니다. '플레이트 추가' 탭을 클릭하면 소프트웨어가 플레이트 구성 버튼을 활성화합니다. '플레이트 구성' 을 클릭하여 샘플 세부 정보를 플레이트에 할당하세요.
   4. 플레이트와 웰 정보 세부사항을 입력하고, 웰을 선택하고, 시료 상태, 실험 유형, 타겟명, 타겟 타입, 참고 문헌을 지정하세요: FAM은 ch1, HEX 색상은 ch2입니다.
   5. '적용' 을 클릭하여 우물을 불러오고, 완료되면 '확인'을 선택하세요.
   6. 모든 샘플의 플레이트 레이아웃이 완성되면 'Run'을 선택하여 액상 판독 과정을 시작하세요.
   7. 데이터 획득 시, 웰 셀렉터의 '분석' 항목에서 샘플을 선택하고 ddPCR 돌연변이 검출 분석법의 적절한 임계값을 설정하여 돌연변이와 야생형 신호를 구분합니다.
   8. 이 프로토콜에서 사용되는 이중돌연변이 분석의 경우, QX 매니저 소프트웨어 기본 설정을 통해 임계값을 자동으로 설정할 수 있습니다(결과의 그림 참조).
   9. 또는 십자선(cross-hair) 또는 올가미 방법을 사용해 임계값 또는 올가미 경계가 양성과 음의 군집을 구분하고, 각 실행에 포함된 양과 음의 대조군이 정의한 군집 위치를 기준으로 임계값 또는 올가미 경계를 설정할 수 있습니다.
      참고: 복제 가능한 돌연변이 호출을 보장하기 위해 양성 및 음적 대조군을 사용하여 배치 내 샘플 간에 일관되게 임계값을 설정해야 합니다.
   10. 보고된 농도는 최종 1x ddPCR 반응의 1μL당 복사본 수 수입니다.

결과

Genesis 세포 분리 시스템은 마이크로플루이딕 세포 포획 슬라이드를 사용하여 25–250 세포·^mL-1 농도로 혈액 샘플에서 평균 84%의 스파이크된 암세포를 분리했습니다(그림 3A). 이러한 높은 포획 효율은 전혈 샘플에서 희귀 순환 종양 세포를 분리하는 데 있어 농축 단계의 효과성을 입증합니다. 시스템 Enumeration 프로토콜을 이용한 마이크로플루이딕 세포 포획 슬라이드에 포획된 세포에 대한 선택적 면역염색 검사는, 세포케라틴에 대한 두 가지 양성 항체, 핵화된 세포를 식별하는 DAPI, 그리고 대부분의 백혈구에서 발현되지만 일반적으로 CTC에서는 발현되지 않는 CD45에 대한 음성 항체 한 개를 이용한 희귀 세포 식별을 입증했습니다(그림 3B)). 이 염색 패턴은 배경 백혈구를 제외한 상태에서 순환 종양 세포의 성공적인 식별을 확인시켜 줍니다.

ddPCR 돌연변이 검출 분석법은 농축된 암세포에서 EGFR 돌연변이를 식별하고 프로파일링하는 데 도움을 주었습니다. 이 연구는 ddPCR 및 돌연변이 검출 분석법을 사용하여 제네시스 플랫폼으로 초기 농축된 세포 내 gDNA 돌연변이를 검출하는 것을 입증했습니다. 두 EGFR 돌연변이의 ddPCR 플롯(그림 4)에서 암세포 계통 A549(EGFR 야생형)와 H1975(L858R/T790M)의 구간에서, ddPCR은 전혈 세포주에 스파이되어 Genesis 플랫폼을 통한 농축 후 H1975 세포주에 존재하는 돌연변이를 민감하게 탐지할 수 있음을 보여주었습니다. H1975 세포에서는 양성 돌연변이 신호가 관찰되었으나, A549 세포에서는 돌연변이 신호가 검출되지 않아 분석의 특이성을 확인했습니다. 대조 세포주 A549와 스파이팅된 샘플에서는 돌연변이 없이 방울이 나타나 L858R과 T790M 돌연변이 검출이 H1975 세포주와 특이적으로 연관됨을 확인시켜 주었습니다. Genesis 플랫폼에서 CTC 분리를 시연한 이 사례와 ddPCR을 이용한 분자 분석은 임상 샘플을 이용한 액체 생검 및 전임상 연구에 강력한 분자 진단 도구를 제공하여 질병 진행 모니터링과 맞춤형 치료를 제공합니다. 전반적으로 이 결과들은 농축과 ddPCR 워크플로우를 결합하면 순환 종양 세포에서 EGFR 돌연변이를 신뢰성 있게 검출하고 정량할 수 있음을 보여줍니다.

그림 1: 폐암에서 EGFR DNA 돌연변이 프로파일링을 위한 액체 생검 워크플로우. (A) 기존 조직 생검과 액체 생검에서 순환 종양 세포(CTC)를 통해 검출된 다양한 EGFR 돌연변이 프로필을 보여주는 종양 이질성 그림. (B) 액체 생검을 이용한 순환 종양 세포의 EGFR DNA 돌연변이 프로파일링 개요 워크플로우. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 2: 인위적으로 사용된 샘플을 이용한 EGFR DNA 돌연변이 프로파일링 시연. (A) 건강한 기증자의 전혈에 EGFR 돌연변이 상태가 정의된 폐암 세포주를 스파이싱하여 모델 CTC 샘플을 제제하는 과정. (B) 상업적으로 이용 가능한 플랫폼을 이용한 순환 종양 세포에서 EGFR DNA 돌연변이 검출을 보여주는 워크플로우. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 3: 순환 종양 세포의 라벨 없이 분리 및 확인. (A) 반자동 희귀 세포 분리 플랫폼을 이용해 건강한 기증자의 전혈 샘플에 포함된 폐암 세포주(A549 및 H1975)의 포획 효율. (B) 세포케라틴 양성 종양 세포를 나타내는 포획 세포의 면역 염색. 스케일 바 = 10 μm. 이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하세요.

그림 4. 비말 기반 디지털 PCR을 이용한 EGFR 돌연변이 프로파일링. 세포 용해 및 DNA 추출 후 농축된 암세포에서 EGFR 돌연변이 검출을 보여주는 2차원 진폭 플롯. A549 세포(야생형)는 돌연변이 특이적 신호가 없으며, H1975 세포는 EGFR L858R 및 T790M 돌연변이에 대해 양성 신호를 보입니다. 이 분석법은 돌연변이 및 야생형 DNA 집단의 민감한 검출과 정량을 가능하게 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

구성 요소	반응당 부피(μl)	최종 집중
프로브용 ddPCR 슈퍼믹스 2개 (dUTP 없음)	10	1회
20배 타겟(FAM) 및 야생형(HEX) 프라이머/프로브	1	1회
제한효소, 희석된 (Msel)	1	2-5 U/reaction
표적 샘플 및/또는 DNase 없는 물(NTA)	가변	가변
총 부피	20	-

표 1: 비말 기반 디지털 PCR 돌연변이 검출을 위한 반응 설정. 암세포 유래 DNA 샘플에서 희귀 EGFR 돌연변이를 검출하는 데 사용되는 시약의 조성 및 최종 농도.

열 사이클* 단계	온도	시간	램프 속도	사이클 수
	(ºC)		(ºC/sec)
효소 활성화	95	10분	2	1
변성	94	30초	2	40
어닐링/연장	55	1분	2	40
효소 비활성화	98	10분	2	1
냉각	4	30분	2	1
홀드 (선택 사항)	4	∞ (무한)	1	1
C1000 터치 열 사이클러의 경우 가열 뚜껑을 105ºC로 설정하고 샘플 부피를 40μl로 설정하세요 96심 우물 반응 모듈을 갖추고 있습니다.

표 2: 디지털 PCR 증폭을 위한 열 사이클링 조건. 96웰 반응 모듈을 가진 열 사이클러를 이용한 EGFR 돌연변이 표적 증폭에 사용되는 열 사이클링 매개변수.

토론

고형 종양 환자의 혈액 내 순환 종양 세포 존재는 60^{년 이상} 연구 주제였으며, 2010년 처음으로 집단 검사에 포함되기 전부터 1차 액체 생검으로 인정되어^{왔습니다.} 하지만 CTC는 드물고,^전혈에서 선택적으로 분리하기도 어렵습니다. 그러나 물리적/미세유체 접근법과 세포 표면 마커 선택 방법을 다루는 다음 리뷰^10,11에서 보여주듯 CTC를 포착하고 풍부하게 하는 다양한 방법이 존재합니다. 이러한 방법들 중 다수는 시간이 많이 걸리고 노동 집약적이며, 요구되는 선택성을 달성하기 위해 여러 단계나 시스템을 포함하는 경우가 많습니다.

이 프로토콜에서 전혈에서 CTC를 포착하는 것은 크기(> 8 μm)와 미세유체 세포 캡처 슬라이드의 미세유체 기공을 통과하는 표현형상 정상 적백혈구의 배경에서 변형이 없는지에 의존합니다. 따라서 올바른 샘플 로딩, 적절한 슬라이드 프라이밍, 막힘 방지는 포획 효율성과 샘플 회수 유지를 위한 중요한 단계입니다.

워크플로우가 성공하려면 혈액 샘플 관리가 핵심 요소이며; 신선한 혈액이 샘플 처리에 사용되도록 하고, 용혈을 방지하기 위해 올바른 운반 및 저장 조건을 유지하는 것이 중요합니다. 적혈구 또는 백혈구의 분해는 각각 CTC 포획의 질과 희귀 유전체 변이의 감지 민감도에 영향을 미칩니다. 용혈, 응고 또는 시료 명백한 열화가 관찰될 경우, 이러한 조건이 CTC 회복과 후속 돌연변이 탐지 민감도를 저하시킬 수 있으므로 시료를 처리해서는 안 됩니다.

CTC는 전혈 내 백혈구 1,000만 개당 1 CTC 이하로 존재할 수 있으므로, 농축을 위해 허용되는 한 최대한 많은 부피를 포획하는 것이 필수적입니다. 마이크로플루이딕 세포 포획 슬라이드는 일반적으로 7.5~10 mL 혈액을 담는 표준 혈액 포획관인 Streck과 EDTA와 일치하여 10 mL의 혈액을 수용할 수 있습니다. 채취된 혈액량 감소는 CTC 포획 민감도와 이후 유전체 변이 검출에 직접적인 영향을 미칩니다. 치료를 받는 환자들로부터 이 정도 이상의 양을 얻는 것은 임상적, 윤리적으로 모두 도전적일 수 있습니다. 10ml 이상 부피를 늘리거나 진단용 백혈구채소 샘플을 이용해 백혈구/CTC^개체군을 늘리는 것 외에도, 더 큰 부피로 감도 증가는 현재 제네시스 플랫폼의 범위를 벗어납니다.

프로토콜은 표준 표준 표준 절차(SOP)에 명시된 대로 실행되었으나, 신선한 혈액 채취, EDTA와 혈액 채취 시 종합, 혈액 보관 시 신중한 보관 등 신중한 보관 방식을 통해 표준 운영 절차가 중요해지는 임상 환경에서 활용될 가능성을 보여주었습니다. 하지만 이 프로토콜은 인위적인 샘플을 사용해 입증되었기 때문에, 임상 임상 시행 전에 임상 환자 표본과의 검증이 필요합니다.

CTC 집단 내에서 돌연변이 검출의 민감도는 표준 전혈 샘플 내 CTC의 존재와 그 CTC 집단 내에서 체세포 돌연변이의 후속 검출 여부에 의존하며, 이는 CTC 하위 집단에서 돌연변이의 빈도에 따라 달라집니다. 이 두 가지 교란 요인은 궁극적으로 포획된 CTC 집단에서 돌연변이 검출의 전반적인 민감도를 제한합니다; 초기 검출 샘플에 더 큰 영향을 미치는 반면, 후기 단계 샘플은 CTC 수치와 돌연변이 보유 CTC 개체군이 더 많을 가능성이 높습니다.

현재 혈액 기반 액체 생검 연구들은 혈장 내 종양 DNA를 종양 존재의 지표로 순환시키는 데 크게 편향되어 있습니다. 일반적으로 ctDNA 검출은 SNV, 구조 변이, MSI-H, TMB, CGP 등 종양 특이적 유전체 마커의 존재에 기반합니다. 액체 생검에서 덜 사용되지만 동등하게 유효한 바이오마커인 CTC는 종양이 성장하거나 전이될 가능성이 있어 혈류로 배출되는 것으로 알려져 있습니다⁸. CTC 분석은 주로 세포 표면 표지체에 초점을 맞추며, 포획 또는 포획 후 검증에 사용되는 판-사이토케라틴, 비멘틴, PD-L1, EpCAM 등 기존 또는 맞춤형 항체 패널을 활용합니다. 반면, CTCs의 분자 분석은 전혈에서 CTC를 선택적으로 농축하고 포착한 후 CTC 아집단의 정밀 분석이 어려운 문제로 인해 채택이 제한적입니다. 현재 방법은 CTC 캡처를 위한 확립된 프로토콜을 통합한 표준화된 워크플로우를 활용하고, 인위적으로 알려진 전혈 샘플에서 알려진 병리학적으로 관련된 유전체 돌연변이에 대해 기성 분석법을 사용하는 ddPCR을 이용한 분자 분석이 이어집니다. 이 접근법은 농축된 CTC로부터 직접 돌연변이 프로파일링을 가능하게 하여 혈장 ctDNA 기반 액체 생검 접근법을 보완한다는 점에서 중요합니다.

현재 접근법을 활용하면, 포획된 희귀 CTC가 전혈 내 존재와 CTC 집단 내 병리학적으로 관련된 유전체 표지자의 존재 여부를 조사할 수 있습니다. 연구들은 암 환자의 ctDNA 프로필과 ctDNA¹³과 병행하여 순환하는 CTC 저장소를 모두 평가하는 것의 가치를 보여주었으며, 두 돌연변이 원인 모두를 평가함으로써 개별 환자의 분자 지형이 확장됩니다. 이는 처음에는 중개 연구 범위 내에서 병리학 검사 패러다임을 개발할 잠재력을 가지지만, 궁극적으로는 임상 환경에서 발전할 수 있습니다. 새로운 패러다임은 암의 존재/진행을 나타내는 CTC 존재와 클론 확장이나 치료 내성을 시사할 수 있는 CTC 포획 세포 내 병리학적 돌연변이를 모두 포함할 것이다¹⁴. 이는 전이와 클론 확장의 발생, 그리고 이어지는 약물 내성이 ctDNA 수준과 CTC 수준에서 동시에 모니터링될 수 있으며, 이는 후기 암에서의 치료 선택에 직접적인 영향을 미친다는 의미입니다.

향후 적용 분야로는 이 워크플로우를 추가 암 관련 돌연변이에 적용하고, 종단 임상 샘플에서 그 성능을 검증하는 것이 포함될 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Genesis Cell Isolation System	Bio-Rad Laboratories	12019822	기기(“반자동 세포 분리 시스템”으로 언급됨)
QX200 Droplet Generator	Bio-Rad Laboratories	1864002	기기
QX200 Droplet Reader 또는 QX600 Droplet Reader	Bio-Rad Laboratories	1864003 또는 12013328	기기(“드롭렛 리더 기기”로 언급됨)
PX1 PCR Plate Sealer	Bio-Rad Laboratories	1814000	기기
C1000 Touch Thermal Cycler with 96–Deep Well Reaction Module	Bio-Rad Laboratories	1851197	기기
Qubit 4 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific Inc.	Q33226	기기
Celselect Slides			소모품(“마이크로플루이딱 세포 캡처 슬라이드”로 언급됨)
Celselect Slides Enrichment Kit 2.0	Bio-Rad Laboratories	17009455	소모품
DNAzol BD	Molecular Research Center, Inc.	DN129	시약
MseI restriction enzyme	New England Biolabs	R0525S	시약
ddPCR Mutation Detection Assay: EGFR T790M	Bio-Rad Laboratories	Assay ID dHsaMDV2010019	어세이
ddPCR Mutation Detection Assay: EGFR L858R	Bio-Rad Laboratories	Assay ID dHsaMDV2010021	어세이
Qubit 1X dsDNA High Sensitivity Assay Kit	Invitrogen	Q33230	어세이 키트
DG8 Cartridges for QX200 Droplet Generator	Bio-Rad Laboratories	1864008	소모품
Droplet Generation Oil for Probes	Bio-Rad Laboratories	1863005	소모품
Automated Droplet Generation Oil for Probes	Bio-Rad Laboratories	1864110	소모품 (선택 사항)
ddPCR Supermix for Probes (No dUTP)	Bio-Rad Laboratories	1863023	시약
PCR Plate Heat Seal	Bio-Rad Laboratories	1814040	피어싱 가능한 호일 씰
DNA LoBind Microcentrifuge Tube, 1.5 ml	Eppendorf	022431021	소모품
ddPCR 96-Well Plates	Bio-Rad Laboratories	12001925	소모품