재구성된 기저막을 가로지르는 서로 다른 세포 유형 간의 간접 상호작용을 연구하기 위한 3차원 공동 배양법

Summary

이 글에서는 재구성된 기저막으로 분리된 두 세포 유형의 3차원 공동 배양을 위한 간단한 방법을 자세히 설명하며, 전문 장비가 거의 필요 없고 다양한 실험 기법으로 쉽게 분석할 수 있습니다.

Abstract

3차원(3D) 공동 배양은 시험 관 내 실험을 통해 세포-세포 상호작용을 정확히 연구하고자 하는 연구자들을 위한 빠르게 발전하는 기법입니다. 세포 및 세포 외 환경 간 제한된 상호작용과 교란된 세포 형태 등 단층 세포 배양의 한계는 생체 내 세포 환경을 시뮬레이션함으로써 해결됩니다. 구조적 지지를 위해 비계를 사용하고 생물학적으로 활발한 세포외 기질 구성 요소를 포함하면, 3D 배양은 조직과 더 일치하는 행동과 형태를 보입니다. 이러한 3D 환경에 여러 세포 유형을 통합함으로써 생체 모방 모델 시스템 내에서 세포 간 상호작용을 연구할 수 있습니다. 다양한 3D 공동 문화 기술들이 등장했으며, 각각 고유한 장점과 도전 과제를 가지고 있습니다. 이러한 기술들은 종종 전문 장비, 복잡한 장비 또는 특정 기술 지식을 필요로 합니다. 또한, 재구성된 기저막으로 분리된 두 세포 유형 간의 간접 세포 간 상호작용을 연구하는 몇 가지 표준화된 방법도 존재합니다. 여기서는 기본적인 기술 기술만 필요로 하고 더 널리 적용 가능한 재료를 사용하여 기저막을 가로지르는 간접적인 세포-세포 상호작용을 성공적으로 재현하는 3D 공동 배양 방법을 설명합니다. 세포 단층은 마트리젤 형태의 세포외기질 층으로 덮여 있고, 그 위에 두 번째 세포 유형이 시딩됩니다. 결과 공동 배양은 5일간 유지되며, 이후 면역형광을 통해 형태학적 변화를 분석하거나 공동 배양에서 추출하여 보다 상세한 유전체학, 전사체학적 또는 단백질체학적 분석을 수행합니다. 이 프로토콜은 기저막에 의해 물리적 접촉이 금지된 세포 간 통신이 세포 행동에 미치는 영향을 연구하는 데 이상적입니다. 연구자들이 생 체 내 세포 배양 방법을 점점 더 선호함에 따라, 높은 진입 장벽을 피하기 위해 간소화된 접근법이 필요합니다.

Introduction

시험관 내 세포 배양은 견고하고 빠르며 널리 사용되는 연구 기법입니다. 전통적인 세포 배양 방법은 강력하지만, 생체 환경과는 크게 다릅니다. 단층 세포 배양의 공간적으로 제한된 특성은 유전자 발현, 형태, 생화학에 변화를 초래합니다 ^1,2,3. 3차원(3D) 배양 기법은 이 차이를 해결하는데, 세포는 장기와 조직에 존재하는 세포외기질(ECM)을 모방하는 비계 위에서 배양됩니다. 3D 배양에서는 세포가 생체 내에서 관찰되는 형태와 행동과 더 유사하게 나타납니다 ^4,5 그러나 3D 배양만으로는 다른 세포 유형의 기여가 부족해 생체 미세환경의 많은 구성 요소를 완전히 재현하지 못합니다⁶.

직접(세포 간 접촉) 및 간접적인 세포 간 상호작용은 생체 내 세포 행동에 중요한 역할을 합니다 ^7,8. 이러한 상호작용을 재현하려면 3D 공동 배양 모델이 필요하며, 이는 여러 세포 유형을 3D 환경에서 함께 배양하는 방식입니다. 이 기법들을 사용하면 시험관 내에서 생체 내 유사한 성장 환경을 구축할 수 있어 결과의 생물학적 관련성을 높일 수 있습니다 ^9,10. 하지만 특정 실험에 필요한 환경이 더 구체적일수록 방법론은 더 복잡해집니다. 기저막 매트릭스로 분리된 세포 간 세포 간 상호작용을 연구할 수 있는 표준화된 모델 시스템이 부족합니다. 따라서 이 프로토콜은 기저막 매트릭스를 가로지르는 세포-세포 상호작용을 견고하고 재현 가능하게 시뮬레이션하도록 설계되었습니다. 이전에 확립된 3D 배양 모델¹¹에서 변형된 이 기술은 이하 ECM 겔이라 불리는 마트리젤 층을 사용하여 배양 내에서 두 가지 다른 세포 유형을 물리적으로 분리하면서 분비된 인자들이 통과하도록 합니다. 원래 지방세포가 중간엽 유방암 세포에 미치는 간접적 영향을 연구하기 위해 설계되었으나, 다양한 세포 유형에 맞게 쉽게 수정할 수 있습니다. 이 방법이 특정 실험 설계에 적합한지 신중히 고려해야 합니다. 이 방법은 세포 간 직접적인 상호작용을 허용하지 않으므로, 기저막 매트릭스를 통한 세포 간 간접 소통이 포함된 생체 내 모델링에 한정되어야 합니다. 예를 들어, 이 시스템은 세포독성 T 세포와 종양 세포 간의 상호작용을 모델링하는 데 이상적이지 않은데, 이들은 일반적으로 직접 상호작용하기 때문입니다. 대신 기저막이 자연스럽게 두 가지 관심 세포 유형을 분리하는 생물학적 상황을 생각해 보십시오. 예를 들어, 이 방법은 침혈 전 종양 세포와 혈관 내피세포 간의 상호작용 연구에 적용할 수 있습니다.

일반적인 대안 3D 공동 배양 방법은 특수 마이크로플루이딕스 칩, 즉 '오르간-온 어-칩(OoC)'의 사용입니다. OoC 시스템은 강력하며 개별 실험에 맞게 조정할 수 있지만, 칩 설계, 재료 선정, 주변 장비, 최적화, 데이터 수집에 상당한 시간과 자원이 투입됩니다^12,13. 또한, 현재 미세유^{체 흐름을} 방해하지 않으면서 기저막 매트릭스의 생물학적 및 물리적 단서를 제공할 수 있는 표준 재료나 방법은 없습니다. 따라서 기저막을 가로지르는 세포-세포 상호작용 연구에 OoC 기술을 적용하는 것은 추가적인 도전 과제를 제시합니다. 이 프로토콜에 제시된 방법은 생물학적 관련성과 접근성을 유지하면서 표준화된 대안을 제공하는 것을 목표로 합니다.

Protocol

이 프로토콜(그림 1A)은 기저막 매트릭스를 통해 세포 간 상호작용을 재현하기 위해 설계된 3D 공동 배양 시스템을 개략적으로 설명합니다. 후속 분석은 공초점 현미경(그림 1B)이나 공동 배양 내에서 세포를 채취하는 방법(그림 1C)을 통해 가능합니다. 두 세포 집단 사이에 ECM 젤 층을 끼워 넣는 '샌드위치' 구조를 사용하여 전문 장비가 필요 없고 현대 세포 배양 기술에 대한 기초 지식만으로도 수행할 수 있습니다.

1. 3D 공동 배양 준비

참고: 이 프로토콜은 3T3-L1 지방세포와 MDA-MB-231 유방암 세포를 이용한 3D 공동 배양법의 대표적 적용을 목적으로 합니다. 다양한 세포 유형을 사용할 때는 세포 시딩 밀도 최적화와 ECM 겔 로트의 사전 검사가 필요하며, 이를 통해 효능을 보장합니다. 이 프로토콜은 무지방세포 대조군과 조건부 미디어 통제 사용을 다룹니다. 실험 목표에 따라 더 많은 대조군이 필요할 수 있습니다.

1. 세포 배양 및 용액 준비
   1. 3T3-L1 프리-지방세포와 MDA-MB-231 유방암 세포주를 획득하여 배양합니다. 클래스 II 생물학적 안전 캐비닛과 표준 부착 세포 배양 방법 내에서 무균 기법을 사용하여 모든 세포를 독립적으로 배양하고 유지합니다¹⁵. Dulbecco's Modified Eagle Media(DMEM)에 3T3-L1 세포를 유지하며, 10%(v/v) 신생아 송아지 혈청(NBCS)과 1% 페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL)을 보완합니다. RPMI 1640에서 MDA-MB-231 세포를 유지하며, 10% 태아 소 혈청(FBS)과 1% 페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL)을 보충합니다.
      참고: 유지 기간 동안 3T3-L1 세포가 80% 합류율을 넘지 않도록 하며, 20^번째 통과 번호 이후의 배양은 사용하지 마십시오.
   2. 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1.8 mM KH₂PO₄, pH 7.4의 인산 완충 식염수(PBS) 1x 정액을 획득하거나 준비하십시오.
   3. 50mL의 PBS-글리신 세척액을 50 mL의 글리신에 50 mL의 PBS를 첨가하여 최종 글리신 농도는 100 mM으로 만듭니다. 용액은 최대 12개월간 4°C에서 보관합니다.
   4. 50 μL Triton X-100과 9.5 mL PBS를 첨가하여 10 mL의 투과성 버퍼를 준비합니다. 최종 농도는 0.5% (v/v) Triton X-100으로 10mL로 채우세요. 4°C에서 보관하고 1개월 이내에 사용하세요.
   5. 50 mL의 면역형광(IF) 완충제를 50 μg의 소 혈청 알부민(BSA), 100 μL 트위온 X-100, 25 μL 트윈-20에서 45 mL PBS를 첨가하여 제조합니다. 최종 농도는 50mL로 채우면 0.1% (w/v) BSA, 0.2% (v/v) Triton X-100, 0.05% (v/v) Tween-20입니다. 4°C에서 보관하고 1개월 이내에 사용하세요.
   6. 10mL의 차단 완충제를 동물 혈청 1mL를 IF 완충제 9mL에 첨가하여 최종 농도는 10% 혈청으로 만듭니다. 4°C에서 보관하고 1개월 이내에 사용하세요.
      참고: 세럼의 종 동일시는 사용된 2차 형광 항체의 숙주 종에 따라 달라집니다(2.2.4 참조).
   7. ECM 젤(총 단백질 농도 ~9-9.5 mg/mL)을 4 °C에서 하룻밤 해동합니다. 500 μL 알리코트를 1.5 mL 마이크로 원심분리관에 준비하여 -20 °C에서 보관합니다.
      참고: ECM 겔은 매우 다양하며 각 세포 유형에서 예상되는 행동을 유도하기 위해 검증되어야 합니다. 세포 유형에 따라 단백질 농도나 기질 강성이 달라질 수 있습니다.
      참고: ECM 겔을 다룰 때는 상온에서 중합을 방지하기 위해 항상 미리 냉각된 피펫 팁과 용기를 사용하세요. ECM 젤은 항상 얼음 위에 보관하세요.
2. 지방세포 분화
   1. 3T3-L1 프리-아디포사이트(3T3-L1) 50,000개를 0.5mL 표준 배지 내 4웰 챔버 슬라이드 2웰에 씨앗. 빈 우물은 지방 세포 제거 및 조건 관리 미디어 방제에 사용됩니다.
      참고: 챔버 슬라이드 세포 배양은 기계적 교란에 취약합니다. 매체의 진공 흡인을 피하고 수동 피펫터를 이용한 부드러운 피펫팅 기법을 사용하세요.
   2. 30,000에서 80,000개의 3T3-L1 프리-지방세포를 0.5mL 표준 배양지에 24웰 조직 배양 플레이트의 단일 웰에 씨앗. 이 도구는 조건 매체 제어를 위한 조건 매체를 수집하는 데 사용됩니다.
   3. 두 문화가 24시간 동안 100% 합류할 수 있도록 허용하세요.
   4. 지방생성을 시작하기 위해 성장 배지를 DMEM에 10% FBS, 0.5 mM 3-이소부틸-1-메틸크산틴(IBMX), 1 μM 덱사메타손으로 구성된 지방 생성 개시 배지를 대체합니다. 세포를 5%_CO2 인큐베이터에서 37°C에서 48시간 배양합니다.
   5. 48시간 후에는 DMEM과 10% FBS 및 10 μg/mL 인슐린으로 구성된 신선한 지방생성 진행 배지로 대체합니다. 세포를 37°C에서 5%_CO2 인큐베이터에서 추가로 48시간 배양합니다.
   6. 3D 공동 배양을 계속하기 전에 >60%의 세포에서 지질 방울이 존재하는지 육안으로 확인하세요. 지질 방울 축적이 느리다면, 진행 배지를 DMEM과 10% FBS 보충으로 교체하고 24시간마다 지질 함량을 모니터링하세요.
3. 3D 공동문화의 오버레이 및 유지
   1. ECM 젤을 4°C에서 하룻밤 해동한 후 오버레이를 계속하세요.
      참고: 로트 간 변동성 효과를 피하기 위해 단일 연구 내 모든 실험에 동일한 로트 ECM 겔을 사용하는 것이 권장됩니다.
   2. 3T3-L1의 성공적인 분화 후에는 사용한 배양지를 제거하고 ~50 μL 정도의 작은 완충 체액을 남깁니다.
   3. 챔버 슬라이드의 각 지방세포 포함 웰에 110 μL ECM 젤을 조심스럽게 첨가하되, 지방세포 단일층을 방해하지 않도록 주의하세요.
      참고: ECM 겔은 상온에서 빠르게 굳습니다. 조기 매트릭스 중합을 피하려면 ECM 겔을 항상 얼음 위에 보관하고 팁을 -20°C에서 미리 냉각해 사용하세요.
   4. 빈 무지방세포 조절 우물에 110 μL ECM 젤을 추가합니다. 마트리젤을 고르게 퍼뜨리기 위해 우물의 모서리와 중앙에 떨어뜨려 넣으세요. 피펫 팁을 사용해 마트리젤을 배양 표면에 긁지 않고 부드럽게 펴 펴 주세요.
   5. 슬라이드를 37°C에서 1시간 동안 배양하여 ECM 겔이 중합되도록 하세요.
   6. 이 배양 단계에서 MDA-MB-231 세포를 채취하고 계수하세요
      선택 사항: 이 세포들에 대한 형광 표지에 대한 자세한 내용은 1.4단계를 참조하세요.
   7. 2% ECM 젤(v/v)이 포함된 유선배지 내 30,000 세포/mL의 희석된 MDA-MB-231 세포를 준비합니다.
      참고: 최적의 세포 시딩 밀도는 세포 유형에 따라 다르며 실험 전에 최적화되어야 합니다. 참고: 유선배지는 유선상피세포에 최적화된 상업적으로 이용 가능한 세포 배양 배지입니다. 이 성분에는 0.4% 소 뇌하수체 추출물, 10 ng/mL 표피 성장 인자(재조합 인간), 5 μg/mL 인슐린(재조합 인간), 0.5 μg/mL 하이드로코르티손이 포함되어 있습니다. 공동 배양 배지는 두 세포 유형의 요구에 맞게 신중하게 선택되어야 합니다.
   8. ECM 겔이 중합되면, 각 웰에 MDA-MB-231 현탁액 450 μL을 부드럽게 첨가합니다. 이로 인해 총 셀 수는 13,500개의 셀/우물에 달합니다.
      참고: 이 단계에서 젤 위에 세포 현탁액이 고르지 않게 겹쳐질 가능성이 있습니다. 챔버 측면을 시각적으로 확인한 후 모든 면을 부드럽게 두드려 고르게 분포하세요.
   9. 24웰 플레이트의 지방세포 배양에 2% ECM 겔(v/v)이 포함된 유선성장 배지 450 μL을 추가합니다. 매 48시간마다 매번 매체를 수확하고 교체하세요.
   10. 공동 배양은 최대 5일간 유지하며, 매개체는 48시간마다 교환하세요.
       참고: 진공 흡인은 삼가고 부드러운 피펫팅을 사용하세요. ECM 겔의 박리 현상은 공동 배양 유지 중 발생할 수 있는 문제일 수 있습니다.
   11. 조건 배지 대조 우익을 위해, 희석된 지방세포(단계 1.3.9)를 신선한 배지와 1:1 조건화한 후 2일차와 4일차에 사용한 공동 배양 배지를 교체했습니다.
       참고: 이 시점에서 공동 배양 기간은 종료되며, 형태와 표지 발현을 확인하기 위해 배양물을 고정하고 염색하여 분석하거나( 2절 참조) 또는 공동 배양 환경에서 세포를 추출해 후속 분석을 위해 세포를 준비해야 합니다( 3조 참조).
4. 형광 세포 표지 부착 (선택 사항)
   참고: 면역형광 영상 촬영 중 겹침 세포를 식별하는 데 도움을 주기 위해 1.3.7단계 이전에 겹쳐진 세포의 표지가 가능합니다.
   1. 10mg의 CFSE를 4.22mL DMSO에 용해하여 5mM 용량의 카복시플루오레세인 디아세테이트 석시니미딜 에스터(CFSE) 정액을 제조합니다. 빛으로부터 보호된 상태로 -20°C에서 500 μL 알리코트에 보관하세요.
   2. 1.3.6단계의 세포를 세고 나서, PBS 5mL로 세포를 한 번 세척합니다. 결과 펠릿을 1배 PBS에 재현탁하여 최종 농도는 1,000,000 cells/mL로 만듭니다.
   3. 세포 현탁액 1mL당 5 mM CFSE 1 μL 첨가하여 최종 작동 농도인 5 μM을 달성합니다. 세포 현탁액을 빛으로부터 보호한 상태로 실온에서 20분간 인큐베이팅합니다.
   4. CFSE 염색을 5볼륨의 배양지를 추가해 소매하세요. 상온에서 추가로 5분간 배양하세요.
   5. 펠릿 세포를 넣고 PBS로 두 번 세척하여 잔여 CFSE를 제거하세요. 세포를 미리 가열한 유선배지에 재현탁합니다. 염료가 남지 않도록 실온에서 추가로 10분간 배양하세요.
   6. 1.3.7단계에서 설명한 형광 표지 세포를 씨앗. 나머지 프로토콜은 설명한 대로 수행할 수 있습니다.

2. 면역형광

1. 고정
   참고: ECM 겔의 탈중합과 세척 중 샘플 손실을 방지하기 위해, 사용 전 모든 시약을 실온에 맞춰 약 30분 정도 평형으로 두십시오.
   1. 5일간 공동 배양 후 배지를 500 μL PBS로 교체하세요.
      참고: 2.1.2부터 2.3.7까지는 비멸균 환경에서 수행할 수 있습니다.
   2. PBS를 제거하고 2% 파라포름알데히드(PFA)를 넣어 PBS(신선하게 준비)를 실온에서 10분간 사용하세요.
      참고: ECM 젤은 PFA에 민감하여 젤층이 떨어질 수 있습니다.
      주의: PFA는 시간이 지나면서 포름알데히드로 분해됩니다. PFA를 다룰 때는 연기 흡입을 피하고, 충분한 환기를 유지하며, 장갑, 실험복, 안구 보호 장비 등 적절한 개인 보호 장비를 항상 착용하세요.
   3. PFA를 제거하고 500 μL PBS-글리신 세척액으로 실온에서 15분간 부드럽게 저으며 웰을 세척합니다.
      참고: PBS-글리신 세척은 자유 알데히드가 배경 형광을 생성하는 것을 방지하는 데 매우 중요합니다. 글리신 없이 PBS로 세척하지 마세요.
   4. 2.1.3 단계를 두 번 반복하여 총 세 번 세척합니다. 저장 조건은 2.1.5를 참고하시고, 필요 없으면 2.2.2 단계로 건너뛰세요.
   5. 이 시점에서 프로토콜은 최대 1주일까지 일시정지할 수 있으며, 슬라이드는 4°C에 보관할 수 있습니다. 슬라이드를 보관할 때는 모든 웰에 1mL의 PBS를 채우고, 챔버 슬라이드 덮개를 얇은 파라필름 리본으로 밀봉합니다. 슬라이드를 빛을 차단하는 용기에 평평하게 넣고, 배양이 마르지 않도록 젖은 섬세한 조직 위에 올려두세요.
2. 항체 염색
   1. 이전에 보관한 슬라이드를 실온에 두고 PBS를 제거한 후, 500 μL 신선한 PBS로 15분간 부드럽게 저으며 웰을 세척합니다. 2.1.4 단계를 바로 진행할 때는 이 단계를 건너뛰세요.
   2. 500 μL 투과화 완충제를 실온에서 교반 없이 15분간 투과화 세포를 사용합니다.
   3. 500 μL PBS로 세척하고, 15분간 부드럽게 저어줍니다. 이 과정을 두 번 반복해서 총 3번 세척합니다.
   4. 각 웰에 500 μL 차단 완충제를 추가하고 실온에서 부드럽게 교반하며 1시간 배양합니다.
      참고: 차단 버퍼 내 혈청의 원천 종이 2차 항체의 숙주 종과 일치하는지 반드시 확인하세요. 이 프로토콜에서는 당나귀 혈청과 당나귀 2차 항체를 사용합니다.
   5. 제조사 권고에 따라 IF 버퍼에서 관심 있는 1차 항체를 희석하세요. 차단 버퍼를 제거하고 각 웰에 희석된 항체 용액 300 μL를 추가합니다.
   6. 챔버 슬라이드의 덮개를 파라필름으로 밀봉하고 슬라이드를 빛 차단 용기에 넣으세요. 4°C에서 하룻밤 부드럽게 교란하며 배양하세요.
   7. 웰을 500 μL IF 버퍼로 세척하고, 15분간 부드럽게 저어줍니다. 이 과정을 두 번 반복해서 총 3번 세척합니다.
   8. 제조사 권고에 따라 IF 버퍼에 적절히 형광 표지된 2차 항체를 희석하세요. 각 웰에 2차 항체 희석액 300 μL을 추가하고, 상온에서 1시간 동안 부드럽게 저어주어 배양합니다.
      참고: 광표백을 줄이기 위해 이 단계 이후에는 장기간 빛에 노출하지 마세요.
   9. 2.2.7 단계를 반복합니다.
   10. PBS에서 4',6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI) 1:800 비율의 300 μM 정액을 희석합니다. 각 웰에 300 μL을 추가하고 실온에서 20분간 부드럽게 저으며 배양합니다.
   11. 500 μL PBS로 세포를 5분간 부드럽게 저어주며 세척합니다. 한 번 반복하세요.
3. 슬라이드 장착
   1. 배양을 방해하지 않으면서 잔류 PBS를 최대한 제거하세요. 뚜껑을 교체하고 챔버 슬라이드 제조사에서 제공한 도구를 사용해 챔버를 유리 슬라이드에서 분리하세요.
   2. 섬세한 작업 조직을 사용해 ECM 겔을 손상시키지 않고 잔여 PBS를 제거하기 위해 슬라이드 가장자리를 닦아냅니다.
   3. 주사기와 18G 바늘을 사용해 슬라이드 가장자리에 실리콘 실란트를 천천히 배관으로 바르세요. 실리콘이 굳을 때까지 3분을 두세요.
   4. 실리콘이 굳는 동안, 각 웰에 1-2방울의 안티페이드 마운팅 매체를 추가하세요. 거품은 피하세요. 기포가 생기면 피펫을 사용해 배양물을 손상시키지 않고 조심스럽게 제거하세요.
   5. 실리콘이 굳은 후에는 유리 커버슬립을 얕은 각도로 부드럽게 내립니다. 커버슬립을 내릴 때 기포를 내릴 때 집자나 피펫 팁을 사용해 기포를 배출하세요. 커버슬립이 깨지지 않도록 부드럽게 눌러주세요.
   6. 슬라이드를 실온에서 빛을 차단하는 용기에 넣고 하룻밤 동안 굳히세요. 슬라이드는 4°C에서 보관할 수 있으며, 프로토콜은 최대 1주일간 중단됩니다.
      참고 (선택 사항): 슬라이드를 더 잘 밀봉하려면, 커버슬립 후 1시간 후에 투명 매니큐어를 가장자리에 바르세요.
   7. 공초점 형광 현미경을 이용한 10-20배 배율의 이미지 슬라이드. 연산자 편향을 최소화하기 위해 다섯 개의 무작위 시야를 캡처하세요.

3. 하류 분석을 위한 공동 배양 수확

참고: 세포나 생체분자를 채취하는 것은 면역형광과 양립할 수 없습니다. 다른 하위 분석을 위한 공배양은 표준 24웰 배양 접시에서 1, 2절에 명시된 동일한 세포 농도와 부피를 사용하여 배양하는 것이 권장됩니다.

1. 셀 추출
   1. 사용한 배지를 제거하고 얼음처럼 차가운 PBS로 웰을 부드럽게 세척하세요. 한 번 반복해서 총 두 번 세척합니다.
   2. 넓은 구경 피펫 팁을 사용해 1mL의 얼음 냉각 세포 회수 용액(이하 회수 용액)을 첨가합니다. 부드럽게 피펫을 위아래로 움직여 ECM 젤 층을 방해하세요. 액체를 1.5mL 마이크로 원심분리관으로 옮깁니다.
      참고: 세포 회수 솔루션은 ECM 겔에 박힌 세포를 부드럽게 해방하도록 설계된 상업적으로 이용 가능한 비효소 용액입니다. 이 조성은 독점적이며 특정 셀 유형과 호환되지 않을 수 있습니다. 대안으로, Dispase나 Accutase와 같은 부드러운 단백질분해효소를 사용하여 ECM 겔의 효소 탈중합이 고려될 수 있습니다. 이 과정에는 37 °C의 배양 기간과 배화 시간 최적화가 필요합니다.
   3. 각 우물에 250 μL의 얼음 냉각 회수 용액을 추가하여 남은 세포를 수집합니다. 해당 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
   4. 튜브를 4-5번 인버트로 섞어 섞으세요.
   5. 튜브를 얼음에 옮기고 60분간 부순히 저어주면 됩니다. 10분마다 튜브를 2-3번 인버트하여 튜브 내용물이 가라앉지 않도록 하세요.
   6. 원심분리기 튜브를 300 x g 에서 4 °C에서 5분간 가열합니다
   7. 눈에 보이는 세포 펠릿의 존재를 확인하세요. 조심스럽게 상원액을 제거하고 얼음에 차갑게 넣은 1x PBS를 넣으세요. 300 x g 에서 4 °C에서 5분간 원심분리기. 한 번 반복해서 총 두 번 세척합니다. 이 펠릿에는 처음 시드된 세포의 80-90%가 포함될 것으로 예상되며, 각 세포 유형의 비율은 일정하게 유지됩니다.
      참고: 이 시점에서 세포 펠릿을 용해하여 단백질이나 핵산을 수집할 수 있습니다. 용해된 펠릿은 -80 °C에서 보관할 수 있으며, 프로토콜은 3개월간 중단할 수 있습니다. Lysis는 3.2와 호환되지 않습니다.
2. 단일 셀 현탁 준비
   1. 0.25% 트립신-EDTA 200 μL 펠릿을 재현탁합니다. 그 후 37°C에서 3-4분간 배양합니다.
   2. 트립신 소화를 억제하기 위해 완전 배양지 600 μL을 추가합니다.
   3. 300 x g 에서 실온에서 5분간 원심분리합니다. 상정액을 제거하고 상온 PBS 500 μL을 추가하세요.
   4. 300 x g 에서 실온에서 5분간 원심분리합니다. 한 번 반복해서 총 두 번 세척합니다.
   5. 펠릿을 0.04% BSA를 사용한 80 μL PBS에 재현탁하고, 40 μm 셀 체를 이용한 필터 현탁액을 사용합니다.
   6. 5 μL 현탁액을 5 μL 트리판 블루에 희석하세요. 세포를 세고 혈구계로 생존 가능성을 평가하세요. 셀들은 이제 하위 분석을 위해 준비가 완료되었습니다.

Results

이 프로토콜이 기저막을 가로지르는 세포-세포 상호작용의 효과를 연구하는 데 효과적임을 입증하기 위해, 그림 2 와 그림 3 은 이전 논문(Pallegar et ^al.16)에서 대표적인 결과로 재구성되었습니다. 그림 4 와 그림 5 는 새로운 데이터로, 이 프로토콜이 비유방암 세포에 얼마나 적응적인지, 그리고 공동 배양 환경에서 세포를 채취해 하류에 사용할 수 있음을 보여주기 위해 생성되었습니다.

이 방법을 통한 성공적인 공동 배양은 관심 세포 유형의 뚜렷한 형태학적 특징을 측정하고 분석할 수 있는 선명한 이미지를 얻게 합니다(그림...

Discussion

전통적인 세포 배양에서 복잡한 세포 간 상호작용이 부족하다는 점은 약물 반응과 질병 진행을 생체 내에서 보다 정확히 연구하기 위해 장기 및 조직 모델의 개선이 필요함을 강조합니다. 3D 공동 배양 시스템의 개발은 생체 내 연구 없이도 세포-세포 상호작용의 결과를 연구할 수 있게 하여 이 공백을 메우는 데 기여했습니다 ^9,12. 하지만 이러한 방법들 중 다수는 기계적으로 복잡할 수 있으며,^10,12를 설치하는 데 상당한 자원, 시간, 기술적 경험이 필요합니다. 반면 저희 프로토콜은 표준화된 실험실 기법을 활용하여 최소한의 구체적인 기술 경험이 필요합니다. 또한, 이 프로토콜에 필요한 자료는 보다 일반적으로 적용 가능하며, 이 방법 ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
24웰 조직 배양판	코닝	3524
24 x 60 mm 커버 유리	얼티던트 사이언티픽	170-C2460
PBS에서 4% 파라포름알데히드	인비트로젠	J61899. AK	1x PBS에 2%로 희석한 상태입니다
4-우물 챔버드 배양 슬라이드	팔콘	354114
알렉사 플루어 647 AffiniPure Fab 조각 당나귀 항염소 IgG (H+L)	잭슨 면역연구소 주식회사	705-607-003
브라이트-라인 혈구계	하우서 사이언티브	3120
CellTrace CFSE 증식 키트	인비트로젠	C34570
셀 복구 솔루션	코닝	354253
다피	시그마-올드리치 캐나다 컴퍼니	D9542
당나귀 항마우스 IgG (H+L) 교차흡착 2차 항체, DyLight 594	인비트로젠	SA5-10168
당나귀 항토끼 IgG (H+L) 고도로 교차흡착된 2차 항체, Alexa Fluor 647	인비트로젠	A31573
DMEM/F-12, 페놀 레드 없음	깁코	21041025
둘베코 변형 독수리 배질, 고포도당, 피루브산	깁코	11995-065
태아 소 혈청, 캐나다 기원	깁코	12483-020
플로우미 셀 스트레이너, 40 & 마이크로; M	벨-아르트	136800040
GE 어드밴스드 실리콘 창문과 문, 투명	헨켈 인터내셔널	2811093
염소 다클론 안티ZO-1	산타크루즈 바이오테크놀로지	SC8146	1차 항체, 중단
쥐 단클론 안티 ZO-1	산타크루즈 바이오테크놀로지	SC33725	중단된 SC8416 항ZO-1을 대체할 대체 1차 항체
유선상피세포 기저배지	프로모셀	C-21210
마트리젤, 페놀 적색 없음, 성장 인자 감소, LDEV 없음	코닝	356231	단백질 농도: 9-9.6 mg/mL
마우스 단클론 항비멘틴	시그마-올드리치 캐나다 컴퍼니	V2258	1차 항체
신생아 송아지 혈청, 뉴질랜드 기원	깁코	16010159
페니실린-스트렙토마이신	깁코	15140-122
인산 완충 식염수, pH 7.4	깁코	10010023
ProLong 골드 안티페이드 마운트	인비트로젠	P36934
정제 마우스 안티-e-카데린	BD 생명과학	610181	1차 항체
토끼 다클론 안티클로딘 7	앱캠	AB27487	1차 항체
RPMI 1640, 글루타민	깁코	11875-093
보충 믹스	프로모셀	C-39115
트라이판 블루 스테인 (0.4%)	깁코	15250-061
트립신 0.25%-EDTA	깁코	25200056