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방법 논문

애기장대(Arabidopsis thaliana)에서 FRET 기반 바이오센서의 정량적 비율 분석을 통해 세포 내 분석 물질의 실시간 측정이 가능해집니다

365 조회수

⸱

DOI:

10.3791/70028

⸱

2026년 2월 24일

 , 
1Department of Biology, Texas A&M University

이 논문에서

요약

우리는 Förster 공명 에너지 전달(FRET) 기반 바이오센서를 사용하여 살아있는 세포의 세포 내 분자 또는 이온을 정량적으로 분석하는 프로토콜을 제시합니다. 표준화된 영상, 이진 마스크 처리, 그리고 Arabidopsis thaliana (A. thaliana)의 인산염에 적용된 선형 회귀를 적용한 비율계량 분석을 포함하지만, 다른 생물 센서와 생물체에도 폭넓게 적용 가능합니다.

초록

형광 바이오센서는 생체 세포 내 대사산물이나 이온 농도의 동적 변화를 모니터링할 수 있는 비침습적이고 다재다능한 접근법을 제공합니다. 특히, FRET 기반 바이오센서는 바이오센서 발현 수준과 무관하게 세포 내 분석 물질 수준을 보고하는 비율 측정을 가능하게 합니다. 우리는 식물 내 FRET 기반 바이오센서의 정량적 비율 분석을 위한 포괄적이고 표준화된 프로토콜을 설명합니다. 프로토콜은 사용자가 라이브 샘플 준비, 공초점 이미지 수집, 기증자, FRET 및 수용체 채널, 관심 있는 아세포 영역에 대한 이진 마스크 생성, 그리고 회귀 기반 비율 데이터 분석을 안내합니다. 주요 산출물은 회귀 분석에서 유도된 비율계량 측정값으로, 유전자형, 조직, 발달 단계, 치료 조건 간의 정량적 비교를 가능하게 합니다. 무기 인산염용 cpFLIPPi-5.3m 바이오센서를 예로 들어, A. thaliana의 엽록체 기질에서 무기 인산염 농도를 측정하는 것을 시연합니다. 이 분석 프레임워크는 다른 FRET 기반 바이오센서 및 모델 시스템에 널리 적용할 수 있어, 생체 내에서 대사산물과 이온의 정밀한 시공간적 정량화를 가능하게 합니다. 이 전략은 대사산물과 이온의 세포 내 역학에 대한 측정 가능한 통찰을 제공하며, 다양한 실험 환경에서의 비교를 지원합니다.

서론

살아있는 식물 세포에서 대사산물과 이온 역학을 모니터링하는 것은 대사 경로와 신호 전달 네트워크가 공간과 시간에 어떻게 조정되어 성장과 발달을 지원하는지 이해하는 데 필수적입니다 1,2. 세포 대사산물의 농도는 영양소 가용성, 빛의 강도, 스트레스와 같은 환경적 신호에 따라 빠르게 변동합니다. 그중 무기 인산염(Pi)의 수준은 에너지 전달, 신호 전달, 대사 조절에 중요한 역할을 하는 매우 중요하지만, 그 세포 내 역학 규모는 측정하기 여전히 어렵습니다.

표준 비색 분석법과 인-31 핵 자기공명(³¹P)-NMR은 총 또는 구획 Pi를 추정할 수 있지만, 단일 세포 해상도가 부족하고 시간 정밀도가 제한적입니다 5,6. 싱크로트론 X선 분광법과 방사성 추적자 영상은 세포 내 또는 플럭스 정보를 제공하지만, Pi와 인산화된 대사산물을 신뢰성 있게 구분하지 못하며 종종 침습적입니다. 비수성 분획과 효소 기반 동역학적 분석은 기질 및 세포질 Pi의 간접 추정을 제공하지만, 이러한 접근법은 노동 집약적이고 오염에 취약합니다 7,8. 이러한 한계는 파이와 같은 대사산물을 모니터링하기 위해 FRET 기반 생체센서의 실시간 영상과 같은 비파괴적 방법의 필요성을 강조합니다.

유전적으로 암호화된 FRET 기반 바이오센서는 세포 내 이온 및 대사산물 역학을 생체 내에서 분석하는 데 강력한 도구입니다. 초기 연구들은 이러한 바이오센서가 세포 내 포도당, 자당, ATP 농도를 모니터링하는 데 유용함을 입증했습니다 9, 10, 11. 최근의 발전으로 칼슘, 질산염, 인산염, 옥신, 아브시식산, 지베렐린 등을 모니터링할 수 있게 되었으며, 영양소와 호르몬 조절에 대한 귀중한 통찰을 제공합니다 12,13,14,15,16.

cpFLIPPi-5.3m은 식물 세포 내 세포 내 Pi 수치를 모니터링하도록 최적화된 FRET 기반 파이 바이오센서입니다17. 이 바이오센서는 시아노박테리아 Pi 결합 단백질과 FRET 기증체(eCFP, 강화된 청록색 형광 단백질)와 FRET 수용체(cpVenus, 금성 노란색 형광 단백질의 변형 변형)로 구성되며, Pi 결합 시 구조 변화를 겪습니다. 이 변화는 공초점 영상으로 포착되는 Pi 의존적 FRET 유래 형광 신호를 변화시키며, Pi 농도가 증가하면 FRET/공여자 비율이 감소합니다. Pi 의존 비율 분석은 이미지 후처리 시 수용체와 기증자 방출의 세기를 비교하여 수행됩니다18.

살아있는 식물 조직에서의 정량적 비율계 FRET 분석은 각각 공여체(CFP)와 수용체(cpVenus) 형광체의 스펙트럼 누출과 교차 여기 분석을 보정해야 합니다18. 블리드스루는 FRET 채널에서 CFP 방출이 감지될 때 발생하며, 교차 여기는 CFP 여기 중 cpVenus가 여기되어 발생합니다. 이러한 스펙트럼 인공물은 특히 색소가 있는 식물 조직에서 세포와 세포 하위 구획에 따라 달라질 수 있어 비율 측정을 혼란스럽게 만듭니다. 보정되거나 감민화된 FRET 방출을 얻기 위해, 다음과 같이 순수 FRET 신호에서 블리드 스루 및 교차 여기 기여도를 차감합니다:

감민화된 FRET 방출 = 원시 FRET 방출 - 스루 - 교차 여기

블리드 스루 및 교차 여기의 보정 인자는바이오센서와 동일한 세포 및 아세포 위치에서 CFP 또는 cpVenus를 개별적으로 발현하는 식물을 통해 결정됩니다. 감작된 FRET 방출은 다음과 같이 계산됩니다:

감작된 FRET 방출 = 원시 FRET 방출 - (CFP 방출× 블리드 스루 보정 계수) - (cpVenus 방출 × 교차 여기 보정 계수)

감작된 FRET 방출과 공여자 방출의 비율(FRET ratio)은 리간드 농도의 상대적 변화를 보고하며, 바이오센서 발현 수준과는 무관하다19.

cpFLIPPi-5.3m 바이오센서는 A. thaliana 및 기타 종의 뚜렷한 세포 내 구획을 성공적으로 표적으로 삼아 Pi 역학 18,20,21,22의 시각화가 가능했습니다. 이 바이오센서는 세포질 Pi의 분포와 조직 간 수송의 이질성을 밝혀내며, 엽록체 기질 Pi 변동이 수송체 활동 및 광관 성능과 연관되어 있음을 밝혔습니다20,21. 바이오센서가 정의된 동적 범위 내에서 변화를 보고하기 때문에, 해석 시 이 범위가 안정적인 영상 조건에서 생체 내 Pi 수준을 포함해야 합니다. 조명이 고르지 않거나 바이오센서 풍부도가 매우 낮으면 비율 측정에 영향을 줄 수 있으며, 표준화된 획득 설정과 Pi 비민감 제어 센서20과 같은 적절한 음의 대조군의 중요성을 강조합니다. 관심 영역(ROI) 간 FRET 비율 변동이 미미할 경우, 회귀분석이 적합하지 않을 수 있으므로 ROI 지표 통합 방식을 권장합니다.

본 글에서는 공초점 영상, 이진 마스크를 이용한 이미지 분할, 그리고 생세포 내 Pi의 동적 모니터링을 위한 FRET 비율 계산을 포함한 A. thaliana 내 cpFLIPPi-5.3m의 정량적 비율 분석 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 FRET 기반 바이오센서 신호를 분석할 수 있는 재현 가능한 워크플로우를 제공하며, 비율계량 데이터를 선형 회귀와 실험 조건 간 통계 비교를 통해 분석합니다. 대표적인 데이터는 pht2에서 변형된 엽록체 기질 Pi 축적을 통해 나타났으며; 1, cpFLIPPi-5.3m 센서를 발현하는 엽록체 파이 수송체 돌연변이체21,23. 이 프로토콜은 연구자들이 FRET 기반 비율계 영상을 다른 실험 시스템에 적용할 수 있도록 도와주며, 바이오센서 스펙트럼 보정, 영상 설정, 정량적 분석 단계를 상세히 설명할 것입니다. 정의된 실험 맥락 내에서 이미지 획득 및 회귀 기반 분석을 표준화함으로써, 워크플로우는 일치하는 조건 하에서 분석된 샘플 간 FRET 응답의 일관된 비교를 지원합니다. 이는 돌연변이체나 대사물 수송 또는 대사가 변화된 형질전환 계통을 포함한 살아있는 식물 조직에서 분석물 수치의 빠르고 구획별 변화를 측정하려는 사람들에게 적합합니다. 이 표준화된 접근법은 식물생물학에서 정량적 생세포 영상 연구의 재현성을 촉진할 것입니다. 여기서 설명한 엽록체 국소화 Pi 생감지 외에도, 이 분석 전략은 바이오센서 특이적 보정 및 제어 측정이 이루어진다면 다른 FRET 기반 바이오센서 및 생물 특이 조직에도 적용할 수 있습니다.

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프로토콜

참고: cpFLIPPi-5.3m 및 cpFLIPPi-null(세포질 및 플라스티드 표적 변이)을 발현하는 애기장대(Arabidopsis) 형질전환 계통은 이전에17, 18, pht2가 생성되었습니다; 1-1(CS19883)은 애기대대 생물자원센터에서 얻었으며, MS 배지, 커버 안경, 퍼플루오로데칼린, 공초점 현미경, 40배 유성 침지 대물렌즈(수치 구경 1.3), 여기 레이저(CFP/445nm 및 cpVenus/515nm 또는 기기에 적합한 방출 파장), CFP, cpVenus/FRET, cpVenus 수용기용 방출 필터, 카메라 또는 검출기, 이미지 분석 워크스테이션, FIJI24 및 Excel을 포함했습니다.

1 . 샘플 준비

  1. 형질전환 A. thaliana 계통의 생성
    1. cpFLIPPi-5.3m 바이오센서와 Pi-비민감 대조군(cpFLIPPi-Null), 기증자 단독(CFP), 수용체 단독(cpVenus) 대조군을 식물 발현 벡터에 복제합니다17.
    2. 안정적인 발현을 위해, Sgs3-13 돌연변이 배경에서 Agrobacterium tumefaciens floral 딥을 통해 A. thaliana 식물을 형질전환하고, T1 씨앗을 수확하며, 적절한 선택제(예: phosphinothricin, 10 μg/mL)를 포함한 0.5배 Murashige & Skoog(MS) 한천 플레이트에 선별형질을 추출합니다.
    3. 생물 센서를 발현한 A. thaliana 씨앗은 70% 에탄올에 1분간 담근 후 50% 표백제로 옮긴 후 멸균물로 6-10번 헹구세요.
      주의: 에탄올과 표백제는 자극 물질이므로 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용한 채 다루어야 합니다. 화학 훈기 후드나 환기가 잘 되는 곳에서 씨앗 멸균을 수행하여 연기 흡입을 방지하고, 표백제와 에탄올을 직접 섞지 마십시오. 폐기물 처리 방법은 기관의 화학 안전 지침에 따라 처리됩니다.
    4. 씨앗을 4°C에서 어두운 환경에서 2-3일간 층층시켜 발아를 동기화한 후, 0.25% 자당과 실험 설계에 필요한 Pi 농도(250 μM)를 포함한 한천 또는 액체 0.5x MS 배지로 옮깁니다. 변환체를 선택할 때는 선택 에이전트를 포함하세요.
    5. 플레이트를 21°C, 16시간 빛: 8시간 암흑 광주기, 120 μmol·m⁻²·s⁻¹ 빛 세기, ~60% 상대습도로 설정된 제어된 성장실로 옮깁니다. 뿌리를 찍기 위해 4-7일 동안 묘목을 키우거나, 잎을 찍기 위해 21일간 토양으로 옮겨 보세요.
    6. 파이 처리를 시험할 경우, 묘목을 원하는 파이 배지(예: 파이 보충 시 250 μM 파이, 파이 결핍 시 10 μM 파이)로 옮기고, 정해진 기간(예: 급성 파이 결핍 시 48시간) 처리를 유지합니다.
    7. If possible, screen plants for adequate sensor expression by imaging for donor or acceptor fluorescence (low-intensity excitation) using a fluorescence stereo microscope (7-‬10x magnification).
    8. 동일한 유전적 배경에서 cpFLIPPi-null을 발현하는 계통을 리간드 비민감 대조군과 비교합니다.

2 . 공초점 영상

  1. 뿌리는 유리 슬라이드에 묘목을 성장 배지나 멸균된 물에 올려 장착하세요. 작은 커버슬립을 부드럽게 덮어 뿌리를 눌러주지 않고 납작하게 만듭니다. 즉시 이미지를 찍어라.
  2. 잎의 경우, 목표 잎(예: 21일 된 식물의 3번째 또는 4번째 잎)을 잘라내고, 그 밑면을 슬라이드에 넣어 아래로 놓습니다.
  3. 필요 시 공기 공간을 확보하기 위해 10-15 μL 퍼플루오로데칼린을 침투시키고, 작은 유리 무게추를 부드럽게 덮어 샘플을 평평하게 만듭니다. 즉시 이미지를 찍어라.
  4. 생세포에 적합한 고NA 대물렌즈(예: 40× / 1.2-1.3 NA)를 사용하세요. 비교 가능성을 유지하기 위해 모든 샘플에 동일한 목표를 사용하세요.
  5. Metamorph 소프트웨어를 사용하여 여기 및 방출 채널을 설정하고 이미지를 캡처합니다(그림 1).
    참고: 기증자(CFP) 방출을 포착하기 위해 ~445 nm(또는 기기에 적합한 CFP 라인)에서의 여기와 기증 방출 수집(예: 470-500 nm 대역)을 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 445 nm 레이저를 70%(그림 1A)에서 여기시키고 노출 시간은 1000 ms(그림 1B)로 CFP 방출을 포착하는 데 사용되었습니다. FRET(감민화된 수용체 방출)를 포착하기 위해: 공여 파장(445 nm)에서의 여기와 수용체 방출 밴드(예: 530-560 nm)의 수집. 직접 수용기 채널 포착을 위해: 수용기 여기 시 여기(예: 500-515 nm) 및 FRET와 동일한 수용기 방출 대역을 수집하는 방식.
  6. 순차적으로 이미지를 획득하세요: 공여체 여기/공여체 방출, 공여자 여기/FRET 방출, 그리고 수용체 여기/수용체 방출을 포착합니다. 광표백을 제한하려면 필드당 촬영 시간을 짧게 유지하세요(500-1000ms).
    참고: 각 세포 위치(뿌리 세포질, 잎 중엽 세포질, 엽록체 기질)에 대해 평균 픽셀 세기가 국소 배경보다 높지만 검출기 포화도보다 낮도록 최적의 레이저 출력, 검출기 이득, 노출 시간을 산정하세요(그림 1). 특정 위치에 대해 기증자 여기 기반 채널(기증자 및 FRET)에 대해 동일한 캡처 설정을 유지하세요. 영상 매개변수는 시료, 현미경, 광원, 검출 시스템에 따라 달라지므로, 경험적으로 결정되어야 하며, 허용 범위는 본 프로토콜에 설명된 회귀분석을 통해 평가 및 문서화되어야 합니다. 여기서 사용되는 이미지 캡처 소프트웨어는 Metamorph 버전 7입니다.
  7. 목표 위치에 대해 모든 이미지에 동일한 검출기 감도(예: 이득 2.4배, 0 오프셋 사용)를 사용하세요. 여러 검출기를 사용할 경우, 각 검출기의 스펙트럼 응답을 특성화하고 문서화하세요.
  8. 관심 있는 각 조직/유전자형별로 대조군 이미지를 획득하세요.
    1. 각 채널의 배경 자가형광을 결정하기 위해 변형되지 않은 야생형 조직을 영상화합니다.
    2. 각 위치에서 동일한 촬영 설정에서 공여 단독(CFP)과 수용체 단독(cpVenus)을 발현한 영상 식물을 통해 스펙트럼 보정 계수(블리드 스루 및 교차 여기)를 도출합니다. 방출 강도가 다양한 여러 개인(≥6-8)으로부터 이미지를 촬영하세요.

3 . 이미지 처리

  1. FIJI나 ImageJ와 같은 분석 소프트웨어에서 공여자(공여자 여기/방출을 CC라고 함), FRET(공여체 여기/수용체 방출을 위한 CY), 수용체(YY로 수용체 여기/방출) 채널의 원시 이미지를 엽니다. (그림 2).
  2. 동일한 설정으로 영상화한 비변형 식물에서 동일한 위치에서 5-10개의 ROI를 샘플링하여 채널별 평균 배경 강도를 산출합니다. 각 해당 채널 이미지에서 평균 배경값을 빼세요.
  3. 피지에서 따라야 할 절차
    1. 탭을 클릭 해 분석> 측정값을 설정> 평균 회색값 선택. 배경 강도는 특정 ROI나 전체 이미지의 평균을 선택해 측정하세요.
    2. 탭 분석> 측정 탭을 클릭하세요. 값을 엑셀 스프레드시트에 저장하고 각 채널별 평균 배경 값을 계산하세요. 기증자(CFP) 이미지를 역치하여 바이오센서 공간 경계를 정의합니다(기증자는 일반적으로 신호가 가장 낮습니다). 임계값이 부여된 기증자 이미지를 이진 마스크로 변환합니다(그림 3 A).
    3. 탭 이미지를 클릭> 조정> 임계값.
    4. 임계값 설정의 창이 열릴 것입니다. 임계값을 위해 최대 엔트로피 방법을 선택하세요. 공간 경계, 이 경우 엽록체 기질을 설정하고 임계값을 적용합니다. 이로 인해 흑백 이진 이미지가 생성됩니다(그림 3 B).
    5. 탭 수학을 클릭하고> 나누고> 255를 입력하세요. 이미지는 완전히 하얗게 변할 거예요. 이 이진 마스크 이미지를 .tiff 파일로 저장하세요.
    6. 이진 마스크에 배경이 뺄 세 이미지를 모두 곱하여 분석용 마스크 이미지를 만듭니다(그림 3C).
    7. FIJI에서 이진 마스크 파일을 열어보세요.
    8. 탭 프로세스> 수학>곱셈을 클릭하세요.
    9. 이진 마스크를 이미지 중 하나로, 배경을 빼고 CC 이미지를 다른 이미지로 선택하세요.
    10. CY와 YY를 반복하세요.
    11. 연구 대상 구조(전체 세포, 세포질, 엽록체 기질)에 적합한 마스크 이미지에 대해 ROI를 그립니다. 각 ROI마다 도너, FRET, 직접 수용기 채널의 평균 픽셀 강도를 추출합니다. ROI 메타데이터(이미지 이름, 좌표, 실험 조건, 복제 ID)를 저장하여 후속 통계 분석에 활용하세요.
    12. CC, CY, YY 이미지를 열어보세요.
    13. 탭 수학을 클릭하고> 빼기> 평균 배경 값을 입력하세요. 또는 이 작업을 Excel에서 감민화된 FRET 계산 직전에 할 수도 있습니다.
    14. 마스크 처리된 CC 파일을 열어보세요.
    15. 이미지 계산기> 탭 프로세스 버튼을 클릭하세요. CC를 마스크 처리된 CC 이미지 파일과 곱하세요. 이렇게 하면 새로운 32비트 이미지 파일이 열립니다.
    16. 메인 작업 표시줄에 있는 적절한 FIJI 도구를 사용해 ROI를 계산하세요. 예를 들어, 여기서 엽록체 기질은 "타원" ROI 도구를 사용해 선택합니다. ROI를 ROI 매니저에 추가하세요(ctrl+T). 이미지당 5-10 ROI를 선택하세요. "모두 보기"를 확인해 보세요. 이 ROI는 별도의 메타파일로 저장할 수 있습니다(그림 3D). ROI 매니저는 닫지 마세요.
    17. 탭을 클릭하여 분석> 측정값을 설정> 평균 회색값을 선택하세요.
    18. ROI 매니저에서 "측정"을 클릭하세요.
    19. 선택한 ROI의 평균 픽셀 값은 별도의 창에 목록으로 표시됩니다.
    20. 이 데이터를 엑셀로 복사하세요. ROI 매니저는 닫지 마세요.
    21. 마스크 처리된 CC 파일을 CY 및 YY 이미지와 곱한 과정을 반복하여 각 채널의 ROI 관리자를 사용해 동일한 ROI를 측정합니다. 값을 엑셀에 저장하세요.

4. 비율계량 분석

  1. Microsoft Excel을 열어 다음 작업을 수행하세요(그림 4).
  2. 보정 계수 계산.
    1. 각 세포 위치별로 기증자 전용 식물의 FRET 채널 강도(Y축)와 기증자 강도(X축)를 비교해 그래프로 표시합니다. 선형 회귀를 적합시켰습니다. 기울기는 공여 누출 계수( a로 지정)입니다.
    2. 수수용체 전용 식물(Y축)의 FRET 채널 강도와 직접 수용체 강도(X축)를 표시하여 반복합니다. 기울기는 수용기 교차 여기 계수( b로 지정)입니다.
    3. 여러 공장에서 ≥15-20 ROI를 사용하여 견고한 계수를 얻으세요. 엽록체 기질에는 50-60개의 엽록체가 선택됩니다.
  3. 각 ROI에 대해 감수화된 FRET 값을 계산합니다.
    감작된 FRET = 원시 FRET - (× 공여체) - (수용기 × b
    여기서 a 와 b 는 위에서 유도된 위치별 계수입니다(그림 4).
  4. 풀링 ROI에 대해 민감화된 FRET(Y축) 대 기증자 채널 강도(X축)를 도면화합니다. 선형 회귀를 적합하면 엑셀은 y = mx + c 형식의 적합을 제공합니다. 여기서 y는 감민화된 FRET 강도, x 는 도너 강도, c 는 y 절편, m 은 회귀의 기울기에 해당합니다. 적합 회귀에 대한 R²에 주목하라. 일반적으로 R²는 0.8에서 1 사이로, 좋은 적합도를 나타냅니다(그림 4).
  5. 세포질 및 기질 측정의 경우, FRET/공여자(감작된 FRET ÷ 공여자)의 기울기를 계산하여 FRET 비율이라고도 함.
    참고: 회귀 적합 오차는 기울기의 표준오차를 나타냅니다(엑셀의 LINEST 함수 사용 바랍니다). 관심 있는 샘플과 유전자형 전반에 걸쳐 위치별 선택을 일관되게 사용하세요. 여러 ROI와 독립 플랜트의 데이터에 선형 회귀분석을 적용한 결과, FRET 비율이 센서 풍부도와 무관하다는 것이 확인되었습니다.
  6. 보정, 통제, 비특이적 효과 구별.
    1. cpFLIPPi-null(리간드 비민감 변이)을 병렬로 표현하고 동일하게 처리하여 FRET 비율(pH, 이온 강도, 광물리학)의 비특이적 변화와 파이 특이적 변화를 구분합니다.
    2. ROI 수준 데이터를 유전자형, 구획, 복제 식물 ID, ROI ID, 기증자, 수용체, 원시 FRET, 감작된 FRET, 적합 비율(해당되는 경우)을 포함한 필드를 집계합니다. 원초적인 강렬함을 유지하세요.
    3. 인구 비교의 경우, 회귀 유도 기울기를 1차 통계량으로 사용한다; SE± 기울기와 % 상대오차를 보고합니다.
    4. 회귀 유도 매개변수에 적절한 추론 통계(예: 학생 t-검정 또는 ANOVA)를 적용하세요. 분포가 정규성을 위반할 경우 비모수 검정을 사용하세요. 필요하면 여러 번 비교를 정확히 해야 합니다.
  7. 품질 관리 체크리스트 (데이터를 수락하기 전)
    1. 각 이미지의 세 채널 모두 검출기 포화 이하이고 충분한 신호 대 잡음비(>2-10배 배경)를 갖추었는지 확인하세요.
    2. 기증자와 수용체 단일 형광체 대조군이 동일한 설정에서 이미징되었고, 보정 계수 a 와 b 도출을 위한 선형 관계를 얻었는지 확인하라.
    3. 이미지 등록이 정확한지, 마스크가 바이오센서 포함 영역을 정확히 정의하는지 확인하세요.
    4. cpFLIPPi-null control이 Pi 민감도가 예상 부족임을 확인하라.
  8. 이미지 제외를 돕기 위한 대표적인 품질 관리 지표
    1. 채도율: 16비트 이미지에서 최대 강도(65,535)에 도달하는 픽셀은 1-2% 미만입니다.
    2. 배경 수준: 세포가 없는 영역의 평균 강도는 ~50-200 단위 범위입니다.
    3. 픽셀 강도 범위: 평균 강도는 배경보다 훨씬 높지만 채도는 낮습니다(~2,000-20,000 단위).
    4. 신호 대 잡음비(SNR): 값은 2-10을 초과해야 합니다.

5. 두 회귀 기울기 간 차이를 통계적 검정

  1. 두 개의 사우기(회귀 유도 FRET 비율 기울기, 두 유전자형 또는 처리)가 유의미하게 다른지 여부를 확인한다25.
  2. 검정 통계량과 자유도를 다음과 같이 계산합니다
    figure-protocol-1
    자유도는 df = n1 + n2 - 4입니다. m1과 m2는 선형 회귀에서 얻은 기울기, SB1과 SB2는 각 기울기의 표준오차(LINEST 또는 회귀 출력에서 얻는)를 나타내며, n1과 n 2는 표본 크기(각 회귀분석을 맞추기 위해 사용된 ROI 수)입니다.
  3. df가 있는 t에 대해 양측 p-값을 얻으세요(예: t-분포 표나 온라인 계산기26 사용). 온라인 계산기(그림 5C)를 사용할 때, 이전 단계에서 얻은 s의b1, s, b2, n1과 n2를 입력하여 p값과 검정 통계량을 계산합니다.
  4. 해석은 p가 < α(예: α = 0.05)일 때 귀무가설(기울기가 유의미하지 않음)을 거부하는 것입니다. B1, B2, Sb1, Sb2, T, DF, 그리고 P를 보고하세요.

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결과

공초점 영상

공초점 현미경과 변태 소프트웨어를 사용하여, 야생형(WT) 및 pht2의 A.thaliana 잎 조직에서 FRET 기증자 및 수용체 신호를 시각화하기 위해 별도의 채널을 획득했습니다 ; 1 엽록체 파이 수송체 돌연변이체(그림 2). 대표적인 이미지는 Pi 생체센서의 명확한 세포 내 위치를 보여주며, 엽록체는 개별 세포 내뿐만 아니라 다양한 조직 유형 내에서도 쉽게 구별됩니다(그림 3). 이 이미지들은 바이오센서의 성공적인 발현과 표적 선정을 확인하며, 정량적 비율 분석에 필요한 신호의 품질을 보여줍니다. 신호 대 잡음비가 낮은 등 최적이 아닌 이미지는 제외되어 적절한 샘플 준비와 영상 설정의 중요성을 강조했습니다. 생물센서 위치는 표피 엽록...

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토론

이 프로토콜은 FRET 기반 바이오센서를 이용한 생세포 내 대사산물 또는 이온의 정량화를 위한 표준화된 접근법을 제공합니다. 주요 장점은 비침습적 비율계 측정과 다중 세포 내 구획(17, 20, 21, 22)에 적용할 수 있다는 점입니다. 이진 마스크와 선형 회귀의 사용은 정밀도와 재현성을 향상시킵니다. 여기서는 A. thaliana의 세포 내 Pi에 대해 입증되었지만, 이 프레임워크는 다른 분석물, 식물 종, 실험 조건에 적응할 수 있습니다.

프로토콜의 핵심 단계에는 바이오센서 발현을 보장하기 위한 신중한 샘플 준비, 최소한의 자가형광 건강한 조직 선별, 광표백 및 검출기 포...

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공개 사항

저자들은 이 작업과 관련된 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 프로토콜 개발을 지원한 W.K.V. 연구소의 과거 구성원들의 노력에 감사드립니다. 재정 지원은 미국 에너지부 과학국, 생체영상기술프로그램(DE-SC0014037) 및 기초에너지과학부(DE-FG02-04ER15559)에서 제공되었습니다. A.S.R.는 텍사스 A&M 대학교 해글러 고등연구소의 일부 자금으로 지원받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
40배 오일 침수 목표  올림포스https://www.edmundoptics.in/p/olympus-uplxapo-40x-oil-immersion-objective/55558/?srsltid=AfmBOoo0cqmgz7SoQ3ZCUvlJn_LeA37O42aX5BbFqF76k40CwQLNVn4P영상용 대물렌즈  
커버 글라스 / 커버슬립VWR48393-081샘플 배치용 커버 슬립
피지 (ImageJ)오픈 소스2.9.0이미지 분석 소프트웨어
역방향 올림푸스 IX81 현미경올림포스http://www.olympusconfocal.com/brochures/pdfs/ix81.pdf공초점 영상 시스템
iXon3 897 EMCCD 카메라 및 nbsp;안도르 테크놀로지https://andor.oxinst.com/products/ixon-emccd-camera-series/ixon-life-897공초점 영상 시스템의 일부입니다
MetaMorph 소프트웨어 V7분자 장치. LLC버전 7이미지 분석 워크스테이션
Microsoft Excel 마이크로소프트 스위트v16.68데이터 분석 소프트웨어
무라시게 & 스쿠그(MS) 미디엄  케이슨MSP11-10LT식물 성장 배지
퍼플루오로데칼린 (Acros Organic)아크로스 오가닉스P9900-25G영상 매체
포스피노트리신시그마77182-82-2항생제
식물 성장실컨비론관습성장실
요코가와 CSU-X1 회전 원반 공초점 장치요코가와https://www.yokogawa.com/solutions/products-and-services/life-science/spinning-disk-confocal/csu-x1-confocal-scanner-unit/공초점 영상 시스템의 일부입니다

참고문헌

  1. Frommer, W. B., Davidson, M. W., Campbell, R. E. Genetically encoded biosensors based on engineered fluorescent proteins. Chem Soc Rev. 38 (10), 2833-2841 (2009).
  2. Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. Quantitative imaging with fluorescent biosensors. Annu Rev Plant Biol. 63, 663-706 (2012).
  3. Sweetlove, L. J., Fernie, A. R. The role of dynamic enzyme assemblies and substrate channelling in metabolic regulation. Nat Communications. 9 (1), 2136(2018).
  4. Plaxton, W. C., Tran, H. T. Metabolic adaptations of phosphate-starved plants. Plant Physiol. 156 (3), 1006-1015 (2011).
  5. Mimura, T. Regulation of phosphate transport and homeostasis in plant cells. Int. Rev. Cytol. 191, 149-200 (1999).
  6. Roberts, J. K., Wemmer, D., Ray, P. M., Jardetzky, O. Regulation of cytoplasmic and vacuolar pH in maize root tips under different experimental conditions. Plant Physiol. 69 (6), 1344-1347 (1982).
  7. Gerhardt, R., Heldt, H. W. Measurement of subcellular metabolite levels in leaves by fractionation of freeze-stopped material in nonaqueous media. Plant Physiol. 75, 542-547 (1984).
  8. Farquhar, G. D., Caemmerer, S. V., Berry, J. A. A biochemical model of photosynthetic CO2 assimilation in leaves of C3 species. Planta. 149 (1), 78-90 (1980).
  9. Deuschle, K., Chaudhuri, B., Okumoto, S., Lager, I., Lalonde, S., Frommer, W. B. Rapid metabolism of glucose detected with FRET glucose nanosensors in epidermal cells and intact roots of Arabidopsis RNA-silencing mutants. Plant Cell. 18 (9), 2314-2325 (2006).
  10. Fehr, M., Takanaga, H., Ehrhardt, D. W., Frommer, W. B. Evidence for high-capacity bidirectional glucose transport across the endoplasmic reticulum membrane by genetically encoded fluorescence resonance energy transfer nanosensors. Mol Cell Biol. 25 (24), 11102-11112 (2005).
  11. Imamura, H., Nhat, K. P. H., Togowa, H., Noji, H. Visualization of ATP levels inside single living cells with fluorescence resonance energy transfer-based genetically encoded indicators. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (37), 15651-15656 (2009).
  12. Lanquar, V., Grossman, G., Vinkenborg, J. L., Merkx, M., Thomine, S., Frommer, W. B. Dynamic imaging of cytosolic zinc in Arabidopsis roots combining FRET sensors and RootChip technology. New Phytol. 202 (1), 198-208 (2014).
  13. Sadoine, M., De Michele, R., Župunski, M., Grossmann, G., Castro-Rodríguez, V. Monitoring nutrients in plants with genetically encoded sensors: achievements and perspectives. Plant Physiol. (1), 195-216 (2023).
  14. Tagliani, A. AuxSens, a FRET-based auxin biosensor. Mol Plant. 14 (7), 1051-1052 (2021).
  15. Rowe, J., Grangé-Guermente, M., Exposito-Rodriguez, M. Next-generation ABACUS biosensors reveal cellular ABA dynamics driving root growth at low aerial humidity. Nat Plants. 9 (7), 1103-1115 (2023).
  16. Rowe, J. H., Rizza, A., Jones, A. M. Quantifying Phytohormones in vivo with FRET Biosensors and the FRETENATOR Analysis Toolset. Meth Mol Biol. 2494, 239-253 (2022).
  17. Mukherjee, P., Banerjee, S., Wheeler, A., Ratliff, L. A., Irigoyen, S., Garcia, L. R., Lockless, S. W., Versaw, W. K. Live imaging of inorganic phosphate in plants with cellular and subcellular resolution. Plant Physiol. 167 (3), 628-638 (2015).
  18. Banerjee, S., Garcia, L. R., Versaw, W. K. Quantitative imaging of FRET-based sensors for cell and organelle-specifc analyses in plants. Microsc Microanal. 22, 300-310 (2016).
  19. Xia, Z., Liu, Y. Reliable and global measurement of fluorescence resonance energy transfer using fluorescence microscopes. Biophys J. 81 (4), 2395-2402 (2001).
  20. Sahu, A., Banerjee, S., Raju, A. S., Chiou, T., Garcia, L. R., Versaw, W. K. Spatial profiles of phosphate in roots indicate developmental control of uptake, recycling, and sequestration. Plant Physiol. 184 (4), 2064-2077 (2020).
  21. Raju, A. S., Kramer, D. M., Versaw, W. K. Genetically manipulated chloroplast stromal phosphate levels alter photosynthetic efficiency. Plant Physiol. 196 (1), 385-396 (2024).
  22. Zhang, S., Daniels, D. A., Ivanov, S., Jurgensen, L., Müller, L. M., Versaw, W. K., Harrison, M. J. A genetically encoded biosensor reveals spatiotemporal variation in cellular phosphate content in Brachypodium distachyon mycorrhizal roots. New Phytol. 234 (5), 1817-1831 (2022).
  23. Versaw, W. K., Harrison, M. J. A chloroplast phosphate transporter, PHT2;1, influences allocation of phosphate within the plant and phosphate-starvation responses. Plant Cell. 14 (8), 1751-1766 (2002).
  24. Schindelin, J., Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., Preibisch, S., Rueden, C., Saalfeld, S., Schmid, B., Tinevez, J., White, D. J., Hartenstein, V., Eliceiri, K., Tomancak, P. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  25. Cohen, J. Applied multiple regression/correlation analysis for the behavioral sciences. , https://psycnet.apa.org/record/2002-18109-000 (2003).
  26. Soper, D. S. Significance of the difference between two slopes calculator. , https://www.danielsoper.com/statcalc (2025).
  27. Castellani, C. M., Torres-Ocampo, A. P., Breffke, J., White, A. B., Chambers, J. J., Stratton, M. M., Maresca, T. J. Live-cell FLIM-FRET using a commercially available system. Meth Cell Biol. 158, 63-89 (2020).
  28. Kanno, S., Cuyas, L., Javot, H., Bligny, R., Gout, E., Dartevelle, T., Hanchi, M., Nakanishi, T. M., Thibaud, M. C., Nussaume, L. Performance and limitations of phosphate quantification: guidelines for plant biologists. Plant and Cell Physiol. 57 (4), 690-706 (2016).
  29. Verma, A. K., Noumani, A., Yadav, A. K., Solanki, P. R. FRET based biosensor: principle applications recent advances and challenges. Diagnostics. 13 (8), 1375(2023).
  30. Banerjee, S., Versaw, W. K., Garcia, L. R. Imaging cellular inorganic phosphate in Caenorhabditis elegans using a genetically encoded FRET-based biosensor. PLoS One. 10 (10), e0141128(2015).

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