감귤 껍질 추출물의 총 페놀릭스 및 플라보놀 측정 및 프로파일링을 위한 통합 마이크로플레이트 및 HPTLC 전략

요약

본 연구는 감귤류 껍질에서 플라보놀/5-하이드록시플라본 및 페놀 화합물의 HPTLC 프로파일링 및 정량을 위한 Al₃/Folin–Ciocalteu 결합 접근법을 제시하며, 마이크로플레이트 분석을 보완합니다.

초록

페놀 화합물과 플라보노이드는 감귤류 부산물의 항산화 활성과 기능적 가치에 크게 기여합니다. 그러나 기존 색도 측정법은 널리 사용되지만 크로마토그래피 분리가 부족하여 화학적 간섭의 영향을 받을 수 있습니다. 이 프로토콜은 감귤류 껍질 추출물의 총 페놀 함량(TPC), 총 플라보놀 함량, 그리고 5-하이드록시플라본 함량(TFHC)의 결정 및 프로파일링을 위해 마이크로플레이트 분광광도 분석법과 고성능 박층 크로마토그래피(HPTLC)를 결합한 통합 분석 워크플로우를 제시합니다. 석회(Citrus aurantifolia)와 만다린(Citrus reticulata) 필링의 에탄올 추출물을 96웰 마이크로플레이트 형식에서 Folin–Ciocalteu(FC) 및 염화알루미늄(AlCl₃) 분석으로 평가한 후, 두 차례 순차적 이동상과 이중 크로마토그래피 파생을 이용한 HPTLC 분석이 진행되었습니다. 마이크로플레이트 측정 결과, 석회는 74.2 mmol/g, 만다린은 72.8 mmol/g, TFHC 각각 15.5 mmol/g, 6.0 mmol/g의 TPC 값을 얻었습니다. HPTLC 분리는 석회에서 4개의 페놀 밴드, 만다린에서 6개의 페놀 밴드를 분리하였습니다. AlCl₃ 유도화 후 두 개의 석회 띠가 선택적으로 시각화되었으며, 이는 플라보놀 또는 5-하이드록시플라본과 일치합니다. HPTLC가 추정한 페놀 배드 합은 석회와 만다린에서 각각 22.0 mmol/g, 20.8 mmol/g였으며, TFHC는 석회에서 13.4 mmol/g에 도달해 만다린에서는 검출되지 않았습니다. 이 결과들은 마이크로플레이트 분석법이 총 성분의 신속하고 민감한 추정을 제공하는 반면, HPTLC는 화합물 분리와 기능군 특이적 유도화를 통해 선택성을 높인다는 것을 보여줍니다. 이 결합된 전략은 고처리량 스크리닝 후 크로마토그래피 확인을 가능하게 하여, 복잡한 식물 매트릭스의 식물화학적 특성 분석에 실용적이고 재현 가능한 플랫폼을 제공합니다.

서론

감귤 껍질은 주스 산업의 부산물로, 항^산화제와 같은 기능성 화합물의 존재를 입증한 바 있습니다. 신경 보호 식품², 항염증, 항여드름 화장품³, 식품 첨가물^로 사용되었습니다. 이 중 여러 생물 활성은 플라보노이드⁵와 페놀 화합물⁶에 귀속됩니다. 총 플라보노이드와 페놀 양을 추정하는 일반적인 방법은 문헌에서 확립^{되었으며, 가장} 일반적인 방법은 총 페놀 함량(TPC)⁸에 대한 Folin-Ciocalteu, 분광광도법을 통한 총 플라보노이드 화합물(TFC)⁹ 에 대한 염화알루미늄입니다. Folin-Ciocalteau 방법은 1927년에 처음 발표^{되었으며, 이는} 인산화환원-인산성 화합물의 산화환원 반응을 기반으로 한 Folin-Denis 반응¹¹의 변형을 기반으로 했다. Folin-Ciocalteau 방법은 페놀 화합물의 환원용량을 측정합니다¹². 염화알루미늄과 플라보노이드 검사는 1960년에 금속과 플라보노이드 리간드¹³ 사이의 복합체를 기반으로 처음 제안되었습니다.

두 분광광도 측정법 모두 식물 재료에서 흔히 발견되는 식물화 물질의 전체 함량을 추정하고 비교하는 데 유용한 도구입니다. 하지만 여러 제한이 있습니다. 예를 들어, 외부 표준¹⁴의 사용에서 일부 제한이 발생하는데, 일반적으로 표준의 화학적 특성이 신호 응답에 큰 영향을 미치지 않는다고 가정합니다. 실제로는 몰 흡수율이 결합 및 기타 구조적 특징에 따라 달라지기 때문에 이 가정은 검증하기 어렵습니다. 예를 들어, Appel 등^은 11종의 참나무에서 TPC를 평가하고 이른바 '자기 표준화' 접근법을 개발하여 보정 곡선 기울기에서 50% 이상의 차이를 보고했습니다. 자가 표준 이용은 샘플 내 동일한 조성 혼합물을 표현하기 위해 고안된 전략으로, 샘플¹⁶의 실제 총 페놀 함량(TPC)과 더 가깝게 일치하도록 설계되었습니다. 자기 표준은 반응성 그룹과 평균 분자량 간의 비율에 관한 정보도 제공합니다; 하지만 표준화는 번거롭고 어렵습니다.

염화알루미늄 복합체를 기반으로 한 총 플라보노이드 화합물 분석법은 최근^{연구 17,18}에서 비판적으로 평가되었으며, AlCl₃이 플라보놀과 5-하이드록시플라본의 두 하위 그룹과 복합체를 형성한다는 결론을 내렸습니다. 일반적으로 플라보놀은 약 440nm 부근에서 최대 흡수를 보이는 반면, 5-하이드록시플라본은 약 415nm 부근에서 흡수됩니다. 또한, 특정 플라보노이드는 유도체화가 없더라도 415–440 nm 범위 내에서 고유한 흡수율을 보일 수 있으며, 복합체 반응 시 흡수율 증가는 개별 화합물마다 다릅니다. 더불어, 두 색도 분석법 모두 분리가 없어 서로 다른 페놀 성분을 구분할 수 없습니다; 이 기능은 총 내용 추정에 유리할 수 있지만, 특이성에 제한적입니다. 이러한 고려사항은 색도 검출 전에 개별 성분을 분리하여 진정한 분석 반응과 스펙트럼 또는 화학적 간섭을 구분할 수 있는 분석 전략의 필요성을 강조합니다.

이러한 한계에도 불구하고, 이러한 분석법은 식물 및 과일 추출물 내 생리활성 페놀 화합물의 일반 스크리닝에 여전히 귀중한 도구로^{남아 있습니다.} 잠재적 간섭을 평가하기 위해, Folin–Ciocalteu 및 AlCl₃ 시약 모두에서 밝혀진 고성능 박층 크로마토그래피(HPTLC) 방법을 사용하는 것이 효과적인 접근법입니다. 크로마토그래피 분리는 복합체 이전에 기존 흡수 밴드를 가진 간섭 물질을 검출할 수 있게 하며, 사진 기록은 다중 흡수 최대값을 동시에 분석할 수 있게 합니다. 또한 HPTLC 분석은 HPLC–MS/MS와 같은 보다 포괄적인 크로마토그래피 기법에 비해 용매 소비량 감소, 여러 시료(플레이트당 최대 18개)를 동시에 처리하여 분석 시간이 ^단축되고, 이후 크로마^토그래피 유도화의 선택성 덕분에 복잡한 혼합물의 해석이 용이해진다는 장점이 있습니다.

본 연구에서는 고성능 얇은 층 크로마토그래피(HPTLC) 분리와 마이크로플레이트 색도 측정법을 기반으로 한 일반 함량 추정을 이용해 감귤류 껍질 추출물에서 총 폴리페놀 함량(TPC), 총 플라보놀, 그리고 5-하이드록시플라본(TFHC)을 포함한 특정 화합물을 결정하는 통합 프로토콜을 제시합니다. 페놀 화합물의 평면 크로마토그래피 정량은 Folin–Ciocalteu 시약을 사용하여 수행되며, 염화 유도화는 플라보놀과 5-하이드록시플라본에 해당하는 밴드의 크로마토그래피 식별에만 전적으로 적용됩니다. 이 접근법에서 TFHC 결정은 정량화를 위한 염화 착합체보다는 크로마토그래피로 분리되고 화학적으로 동정된 화합물의 Folin–Ciocalteu 반응에 의존합니다. HPTLC 분석은 화합물별 분리 및 시각화를 가능하게 하여 개별 페놀 성분의 식별과 잠재적 스펙트럼 간섭 탐지를 가능하게 합니다. 또한, 전체 TPC 및 TFHC의 신속한 추정을 위한 마이크로플레이트 기반 분광광도계법이 제시되어 복잡한 식물 행렬에 대한 보완적인 고처리량 스크리닝 도구를 제공합니다.

프로토콜

1. 과일 껍질 준비

1. 각 과일에서 약 50g의 껍질을 제거하여 먹을 수 있는 부분과 분리하세요. 대표적인 결과를 위해 현지 상점에서 만다린(칠레에서 수입된 이사벨린 품종)을 구입했고, 코스타리카 산호세 근처의 나무에서 라임을 채취했습니다(바우처 표본 JVR-16434).
2. 껍질을 플라스틱 지퍼백에 넣고 -20°C에서 최소 2시간 이상 냉동하세요.
3. 냉동 껍질을 미리 냉각된 냉동 건조기로 옮기고, 봉지를 열어둔 채 완전히 마를 때까지 0.1 mbar의 진공청소기를 하룻밤 동안 적용하세요.
4. 각 건조 재료를 블레이드 밀을 사용해 약 0.1mm까지 분쇄합니다.

2. 추출

1. 약 100mg의 건조 간 감귤류 껍질(라임 또는 만다린)을 무게로 15mL 유리관에 넣으세요.
2. 튜브에 60% 에탄올 3mL를 추가하세요.
3. 혼합물을 초음파 세척 40°C에서 10분간 초음파 처리하여 식물 세포를 교란하고 식물화학적 방출을 촉진합니다.
4. 샘플을 850 × g에서 10분간 원심분리합니다.
5. 에탄올 상청액을 파스퇴르 피펫을 사용해 10mL 부피 플라스크에 조심스럽게 옮기며, 침전물 교란을 피하세요.
6. 습한 고체 잔여물이 담긴 튜브에 60% 에탄올 3mL를 추가로 넣습니다.
7. 위에서 설명한 초음파 및 원심분리 단계를 2.3단계와 2.4단계에서 반복합니다.
8. 상원액을 같은 부피 플라스크에 옮기고 이전 추출물과 결합하세요.
9. 세 번째 추출을 수행하여 이전 단계를 반복합니다(2.6–2.8).
10. 결합된 추출물(≈9 mL)을 0.1 mol/L HCl 두 방울로 산성화하여 안토시아닌 및 기타 페놀 화합물의 안정성을 높이고, 메탄올로 부피를 10mL로 만듭니다.
11. 이 과정을 각 샘플마다 3번씩 수행하세요.

3. 마이크로플레이트 분광광도법에 의한 총 플라보놀 및 5-하이드록시플라본 함량(TFHC)

1. 쿼세틴 스톡 용액(100 μg/mL) 또는 이에 상응하는 플라보노이드 표준 용액을 준비합니다.
   1. 0.1mg 정밀도의 저울을 사용해 10mg의 퀘르세틴을 계량하세요.
   2. 케르세틴을 약 5mL 95% 에탄올에 녹인 후, 10mL 용량의 일반 용액으로 표시된 플라스크에 옮깁니다.
   3. 비커를 95% 에탄올 2mL로 두 번 씻고, 세척액을 플라스크에 넣으세요.
   4. 60% 에탄올로 부피를 기준에 맞추세요.
   5. 표 1에 따라 1.5 mL 마이크로 원심분리관에 표준 용액(10–100 μg/mL)과 블랭크 액을 준비합니다.
   6. 모든 샘플과 표준이 0.2–0.8 흡수도 범위 내에 있는지 확인하고, 필요시 농도를 조절하세요.
   7. 마이크로플레이트 레이아웃을 준비하려면 그림 1에 따라 각 웰에 60 μL의 블랭크, 샘플 또는 표준액을 분사합니다. 샘플 또는 표준형당 세 번의 복제를 수행합니다.
   8. 2% 염화알루미늄, 5% 아세테이트 나트륨, 80% 메탄올의 수용액을 각각 시약 저장소에 투여합니다.
      참고: 염화알루미늄과 메탄올 용액은 주의 깊게 다루세요. 염화알루미늄 용액은 자극적이며, 메탄올은 섭취, 흡입, 피부 흡수 시 독성이 있습니다. 피부와 눈 맞춤을 피하고 적절한 개인 보호 장비를 착용하세요
   9. 8채널 다채널 피펫을 사용해 각 웰에 10 μL AlCl₃ 용액, 10 μL 아세테이트 나트륨 용액, 200 μL 80% 메탄올을 첨가합니다.
   10. 중간 강도로 10초간 흔들고 어두운 곳에서 30분간 배양하세요.
   11. 415nm에서 흡광도를 측정하세요. 진동이 불가능하다면 배양 전에 마이크로피펫으로 수동으로 혼합합니다(그림 2).
   12. 보정 곡선에서 샘플 흡광도 값을 보간하고, 필요에 따라 희석, 부피, 질량 보정 계수를 적용합니다.

표 1: 총 플라보놀 및 5-하이드록시플라본 함량(TFHC) 보정 곡선에 대한 퀘르세틴 표준 함량. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하세요.

그림 1: 총 플라보놀 및 5-하이드록시플라본 함량(TFHC) 마이크로플레이트 분석을 위한 마이크로플레이트 레이아웃. (A) 마이크로플레이트 도면. (B) 소프트웨어 Gen5 레이아웃 프로그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 2: 총 플라보놀 및 5-하이드록시플라본 함량 분석을 위한 마이크로플레이트 소프트웨어 설정. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하세요.

4. 마이크로플레이트 분광광도법에 의한 총 폴리페놀 함량(TPC)

1. 갈릭산 표준 곡선(0.000–0.120 mg/mL)을 준비합니다.
   1. 분석 저울을 사용해 약 0.0123g의 갈릭산(순도 98%)을 측정하여 증류수에 녹입니다.
   2. 용액을 10mL 용량 플라스크에 옮기고 두 번 헹군 후 증류수를 기준점까지 채워 기본 용액을 얻습니다.
   3. 스톡 용액 1mL를 증류수에 10mL로 희석하여 작동하는 용액을 준비합니다.
   4. 표 2에 따라 작업 용액을 추가로 희석하여 보정 표준을 준비합니다.
   5. 흡수도가 0.2–0.8 범위 밖에 떨어지면 농도를 조정하세요.
   6. Folin–Ciocalteu 작동 시약은 증류수로 1:14 상업용 시약을 희석하여 준비합니다.
      참고: Folin–Ciocalteu 시약과 염산 용액은 부식성이 있습니다. 물보라와 직접적인 접촉은 피하세요. 연기함에서 시약 취급을 수행합니다.
   7. 각 샘플, 표준 또는 블랭크 30 μL을 그림 3A의 레이아웃에 따라 96웰 마이크로플레이트에 피펫팅하며, 샘플당 3회 복제합니다.
   8. 멀티채널 피펫을 사용해 각 웰에 215μL Folin–Ciocalteu 작업 시약을 추가합니다.
   9. 각 웰에 20% 탄산나트륨 용액 50 μL을 추가하고 마이크로피펫으로 충분히 혼합합니다.
   10. 40°C에서 교반을 가한 채 20분간 배양합니다(그림 3B).
   11. 755nm에서 흡수도를 측정하세요.

표 2: 총 페놀 함량(TPC) 교정 곡선에 대한 갈릭산 표준 성분 양. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 3: 총 페놀 함량(TPC) 마이크로플레이트 분석을 위한 마이크로플레이트 레이아웃 및 소프트웨어 설정. (A) 레이아웃. (B) 소프트웨어 프로그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

5. 고성능 박층 크로마토그래피 분석에 사용되는 일반 조건

1. 표준 곡선
   1. 위에서 3절과 4절에서 설명한 대로 케르세틴과 갈릭산(각각 100 μg/mL) 육상 용액을 준비합니다.
   2. 갈릭산을 2, 4, 6, 8, 10, 12 μL 용량의 6개 레인에 발포합니다.
   3. 갈릭산과 쿼세틴 5μL을 각각 별도의 통로에 적용하여 식별하세요.
2. 플레이트 레이아웃:
   1. 고정 상으로 10× 20cm 실리카겔 60 F₂₅₄ 알루미늄 뒷면 TLC 플레이트를 사용하세요.
   2. 적용 매개변수를 다음과 같이 설정: Y 위치 7.0 mm, 밴드 길이 6.0 mm, 첫 번째 X 위치 14.0 mm, 트랙 간 거리 9.4 mm.
   3. 각 밴드당 10μL씩 질소를 분사 가스로 사용해 발췌액을 10μL씩 분포하세요.
   4. 용제 전면 거리를 70mm로 설정하세요.
3. 판 전개:
   1. 40mL의 이동상이 담긴 수동 챔버에서 플레이트를 현상하고, 여과지를 이동상과 챔버 벽에 접촉시켜 챔버 포화 시간을 10분간 두어 이동상의 증기가 챔버 대기를 포화하도록 돕습니다.
   2. MP1 또는 MP2를 사용하여 현상하며, 지시가 있을 경우 이중 현상을 수행합니다. 이동형 1상(MP1)은 에틸 아세테이트:제형산, 아세트산, 물(100:11:11:26)으로 구성되어 있습니다; 그리고 톨루엔: 에틸 아세테이트: 포믹산으로 만든 MP2(5:4:1).
      참고: 흡기 후드에서 HPTLC 플레이트를 현상하세요. 이동상 성분(에틸 아세테이트, 톨루엔, 포믹산, 아세트산)은 휘발성이 높으며, 톨루엔과 에틸 아세테이트는 매우 가연성이 높습니다. 증기 흡입을 피하고 점화원을 제거하세요.
   3. 접시는 상온에서 말리세요.
4. 파생화
   1. Folin–Ciocalteu 시약(시약 300 μL + 50% 에탄올 600 μL 분사)을 사용해 분무판을 하고, 열풍기로 잠시 건조한 후 50% 에탄올에 10% 탄산나트륨 1mL를 분사합니다.
   2. 별도로 50% 에탄올에 1% 염화알루미늄을 뿌려 다른 플레이트들도 분사하세요.
5. 색상 현상이 안정되고 판이 완전히 마를 때까지 열풍으로 균일하게 가열판을 사용하세요.

6. 고성능 박층 크로마토그래피를 통한 총 플라보놀 및 5-하이드록시플라본 함량(TFHC) 및 총 페놀 함량(TPC) 분석 개발

1. 샘플을 갈산과 케르세틴 참조 레인과 함께 삼중으로 도포하세요(식별용으로, 5.1.4 단계에 설명됨).
2. MP1을 사용해 플레이트를 현상하세요.
3. MP2를 사용해 다시 판을 현상하세요.
4. 앞서 설명한 대로 FC 시약을 사용해 판을 유도합니다.
5. 백색 조명과 254nm, 366nm 자외선 조명을 사용하여 플레이트를 사진 문서화합니다.
6. 이 과정을 반복하여 그림 4에 나타난 것처럼 AlCl₃ 미생물화 마지막 단계를 대체합니다.

그림 4: HPTLC에 의한 TPC 및 TFHC 분석을 위한 VisionCats 단계. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭해 주세요.

결과

추출 조건
여기서 설명된 일반적인 추출 프로토콜은 이전에 보고된²²의 에탄올 60%를 사용합니다. 다른 식물성 원료로 외삽할 때, 용매의 극성과 사이클 수 측면에서 추출 조건을 최적화할 수 있습니다. 용매와 사이클 수를 모두 선택하는 포괄적인 근거는^{다른 곳에서} 자세히 설명되어 있습니다. 용매 선택은 이전 문헌과 극성 지수에 의해 결정될 수 있습니다; 일반적으로 에탄올 또는 메탄올의 수소알코올 혼합물과 아세톤이 권장됩니다. 최적의 추출 사이클 수(n)는 고정된 총 부피 10 mL를 1–5회로 나누어 10/n mL 추출물을 한 번 풀어 평가할 수 있습니다. 이후 다양한 추출 사이클 횟수의 효율을 통계적으로 비교하여 TPC 분석에서 최대 흡광도를 얻는 조건을 식별합니다.

마이크로플레이트 및 HPTLC 정량화
마이크로플레이트 분석과 HPTLC 분석의 표준 교정 곡선은 그림 5에 제시되어 있습니다. Folin–Ciocalteu 마이크로플레이트 방법과 동일한 시약으로 유도화된 HPTLC 플레이트를 통해 총 페놀 함량(TPC) 측정을 위해, 갈릭산을 기준 화합물로 사용하여 보정 곡선이 설정되었습니다. 갈릭산이 선택된 이유는 TPC 정량에 가장 널리 사용되는 표준 중 하나이기 때문일 뿐만 아니라, 석회와 만다린 샘플에 적용된 동일한 이동상 조건에서 용출될 수 있기 때문입니다. 퀘르세틴은 HPTLC 분석의 잠재적 표준으로 평가되었으며; 그러나 용매 전면과 함께 용출되어 신뢰성 있게 정량화할 수 없어 이 크로마토그래피 시스템에는 적합하지 않았다. 그럼에도 불구하고, TFHC는 쿼세틴을 기준 표준으로 결정했는데, 갈릭산은 플라보놀도 5-하이드록시플라본도 아니기 때문에 염화알루미늄과 색복합체를 형성하지 않기 때문입니다.

그림 5: 석회, 만다린, 갈릭산, 케르세틴의 HPTLC 플레이트에서 MP1 다음에 MP2를 순차적으로 현상하고, 각각 염화알루미늄(AlCl₃)과 Folin–Ciocalteu(FC) 시약으로 유도화됨. AlCl₃ 유도화 후의 크로마토그래피 프로파일이 나타난다. 약어: FC, Folin–Ciocalteu 파생; AlCl₃, 염화알루미늄 유도체화; W, 백색광 조명; 366 nm에서 자외선 조명. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

총 페놀 함량(TPC)과 총 플라보노이드 및 하이드록시시나믹산 함량(TFHC)의 결과는 표 3에 제시되어 있습니다. 예상대로 TFHC 값은 TPC 값보다 현저히 낮았으며, 석회 샘플에서는 약 5배, 만다린 샘플에서는 12배 낮았습니다.

표 3: 마이크로플레이트 기법을 이용한 만다린 및 석회 총 페놀 함량 결과. 약어: Abs: 흡수도, CV: 변동 계수, DF: 희석 인자, GAE: 갈릭산 당량, IR: 독립 복제, QE: 퀘르세틴 당량, Rep: 반복, SD: 표준편차, TFHC: 총 플라보놀 및 5-하이드록시플라본 화합물, TPC: 총 페놀 함량, 그리고 평균. *건물질을 기반으로 계산됨. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

마찬가지로, HPTLC 분석에서 얻은 결과는 표 4에 요약되어 있습니다. 크로마토그래피 분리는 서로 다른 화합물에 대응하는 개별 밴드를 시각화할 수 있게 합니다. 석회 샘플에서는 4개의 페놀 성분, 만다린 샘플에서는 6개의 페놀 성분이 검출되었습니다. 이들 밴드는 모두 사용된 기준(갈릭산과 케르세틴)의 유지율과 일치하지 않아 기대와 일치합니다.

표 4: 총 페놀 함량과 AlCl₃ 에 대응하는 밴드 결과는 HPTLC에 의해_AlCl3로 유도된 화합물을 발견했습니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

표 4는 또한 HPTLC 분석에서 추정된 총 페놀 함량을 보고하는데, 이는 크로마토그래피(TPC와 유사)로 계산된 개별 화합물들의 합으로 계산됩니다. 또한 표에는 플라보놀 또는 5-하이드록시플라반에 할당된 밴드의 누적 함량도 포함되어 있습니다(석회에서는 Rf = 0.46, 0.62; 만다린에서는 검출되지 않음). 이 밴드는 AlCl₃으로 유도화된 후 노란색으로 나타났고, 366 nm 자외선 조명 아래에서는 노란빛 형광을 보였습니다. 그러나 도면 5에 나타난 것처럼 파생화 전에는 눈에 띄는 색소가 관찰되지 않았습니다.

HPTLC 분석에서는 Folin-Ciocalteu(FC) 유도화를 통해 페놀 화합물을 포괄적으로 검출할 수 있으나, 약간의 간섭이 발생할 수 있습니다. 또한, 염화알루미늄(AlCl₃) 유도화는 일부 플라보노이드를 선택적으로 염색합니다. 두 시약의 결합 적용은 방법의 표준화를 개선하고 두 접근법의 내재적 한계를 완화합니다. 특히, 비플라보노이드 화합물이 FC에서 특징적인 파란색 색과 AlCl₃ 하에서 노란-적색 흡수를 모두 나타낼 가능성은 낮습니다. 또한, 기존의 크로모포어는 유도화 이전에 같은 강도로 관찰되면 간섭에서 제외할 수 있습니다.

그림 5에서 보듯, 석회 추출물은 Rf 0.62와 0.46에 두 개의 밴드를 보였으며, 미현상 판에서는 검출되지 않았으나 Folin–Ciocalteu(FC)와 AlCl₃ 유도화 후 명확히 관찰되었다. 이러한 행동은 이들의 플라보노이드 특성을 뒷받침하며, 이는 네오에리오시트린과 헤스페리딘²³과 유사할 수 있습니다. 석회에서는 Rf 0.21과 0.37, 만다린에서는 Rf 0.36, 0.39, 0.42, 0.46, 0.54, 0.89에서 추가 페놀 성분이 관찰되었습니다. 이 밴드는 FC 유도화 후에는 검출되었으나 AlCl₃ 처리 후에는 검출되지 않아 비플라보노이드 페놀 화합물과 연관될 수 있음을 시사합니다. 문헌에 따르면, 만다린에서 보고된 주요 비플라보노이드 페놀릭에는 클로로겐산과 트랜스-페룰산이 포함됩니다^24,25. 석회에서는 앞서 언급한 다른 화합물로는 쿠마르산과 디하이드록시페룰산²³이 있습니다. 그럼에도 불구하고, 이러한 과제를 확인하려면 추가적인 참고 기준을 포함한 분석이 필요합니다.

HPTLC 이동상 비교
두 이동 단계는 이전에 보고된^{시스템 26, 27, 28}의 변형으로 개발되었습니다. 더 극성 이동상(MP1, 그림 6A)은 MP2에 비해 페놀 성분의 분리가 우수했습니다. 반면, 덜 극성 이동성 위상(MP2)(그림 6B)는 동일한 크로마토그래피 실행 내에서 시료 성분과 기준 표준체를 동시에 보존할 수 있게 했습니다. 그러나 MP2 조건에서는 샘플 성분의 Rf 값이 비교적 낮았으며, 일부 화합물은 그림 6에서 보듯이 원점 근처에 남아 있었습니다. 이 한계를 해결하기 위해 MP1 뒤에 MP2를 사용하는 이중 개발 절차가 구현되었습니다. 이 전략은 동일한 크로마토그래피 조건에서 동일한 플레이트의 갈릭산 표준과 비교하여 정량화할 수 있도록 샘플 성분의 이동과 해상도를 개선했습니다. Quercetin은 AlCl₃ 처리 전에는 희미한 노란색을 띠었으나, 유도화 후에는 그 색이 더 강해졌다. 석회와 만다린 추출물 모두에서 두 개의 뚜렷한 띠가 관찰되었으며, 원산지에 남아 있는 띠도 있었습니다. 더불어, AlCl₃ 유도화 후 Rf 값 0.14의 노란색 띠가 뚜렷하게 보였습니다.

그림 6: 이동상 1(A)과 이동상 2(B)로 개발된 석회, 만다린, 갈산, 케르세틴의 HPTLC 배지. 각 판에 대해 왼쪽에서 오른쪽으로 이어지는 트랙은 개발(비파생화), Folin–Ciocalteu 유도화, AlCl₃ 유도화 샘플에 해당합니다. 시각화는 백색광 조명 아래에서 수행되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

토론

샘플 수집과 보관은 식물화학 분석의 무결성을 보장하는 데 매우 중요한 단계입니다. 채취 후에는 분해를 최소화하기 위해 샘플을 냉장 상태로 운송하고 가능한 한 빨리 동결 건조해야 합니다. 건조된 생물학적 물질은 일반적으로 안정적이지만, 추출물은 냉장 보관 하에도 훨씬 더 불안정합니다. 따라서 분석적 결정은 신선하게 준비된 추출물에 대해 수행하는 것이 바람직합니다. 며칠간 차갑고 빛이 차단된 환경에서 보관하거나 실온에서 몇 시간 보관하면, 크로마토그래피 프로파일에 관찰 가능한 변화가 나타나 밴드 강도 변화와 침전물 형성 등이 발생할 수 있습니다. 이러한 변화는 일반적으로 산화, 가수분해, 또는 복합체 반응과 같은 화학적 변환과 관련이 있습니다. 따라서 모든 시약과 추출물은 화학적 안정성을 유지하기 위해 차갑고 어두운 환경에서 보관 및 취급되어야 합니다.

두 기법(표 3 과 표 4)을 비교할 때 체계적인 정량적 차이가 뚜렷하게 나타납니다. 석회와 귤 모두에서 마이크로플레이트 분석으로 얻은 TPC 값은 HPTLC가 추정한 값의 약 세 배 높았습니다. 석회에서는 마이크로플레이트 시 TPC가 74.2 mmol/g, HPTLC는 22.0 mmol/g DM에 비해 높았으며, TFHC 값은 각각 15.5 mmol/g과 13.4 mmol/g이었습니다. 만다린에서는 마이크로플레이트 기준 TPC가 72.8 mmol/g에 도달한 반면, HPTLC는 20.8 mmol/g에 이를 수 있었습니다. TFHC의 경우, 마이크로플레이트 방법은 6.0 mmol/g을 얻었으나, HPTLC에서는 해당 밴드가 검출되지 않았습니다.

이러한 불일치는 각 방법의 내재적 한계와 반응 메커니즘으로 설명할 수 있습니다. Folin–Ciocalteu(FC) 분석법은 페놀 화합물뿐만 아니라 아스코르빈산, 티로신, 개미산, 아세트산²⁹ 등 다양한 비페놀 환원 물질과 반응하는 것으로 알려져 있으며, 기타 저분자량 환원제들과도 반응합니다. 이러한 화합물들은 전체 분광광도 신호에 기여하여 TPC의 과대평가로 이어질 수 있습니다. 또한, 소량의 페놀 성분들은 개별 농도가 너무 낮아 HPTLC에서 뚜렷하고 정량화된 밴드를 형성하지 못하더라도 마이크로플레이트 분석에서 총 흡수도를 집단적으로 증가시킬 수 있습니다. 일부 작거나 극성이 강한 대사산물은 크로마토그래피 조건 하에서 보존, 해상도 또는 시각화되지 못할 수도 있습니다.

그림 7: 플라보놀과 5-하이드록시플라본으로 형성된 AlCl₃ 복합물의 도식적 표현. (A) 플라보놀과 (B) 5-하이드록시플라본. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

검출 화학의 방법론적 차이도 관찰된 변이에 기여합니다. FC 반응은 시약의 환원으로 인해 흡광도가 크게 증가하여 높은 분석 감도를 가져옵니다. 반면, AlCl₃ 방법은 비교적 비특이적이며 특정 플라보노이드와의 복합체 형성에 의존합니다. 플라보놀은 일반적으로 약 410 nm 부근에서 최대 흡수를 보이는 반면, 5-하이드록시플라본은 약 440 nm¹⁸ 거리에서 흡수하며, 이들의 Al³⁺ 복합체는 그림 7에 나타난다. 그러나 복합체 형성 후 흡수도 증가는 비교적 미미하여 AlCl₃ 분석법은 플라보노이드 자체를 포함한 색 매트릭스 성분의 간섭에 더 취약합니다.

이러한 한계에도 불구하고, HPTLC에서 FC와 AlCl₃ 유도체화의 결합 사용은 페놀 분석에 있어 강력한 보완 전략을 제공합니다. 이 접근법은 FC 반응의 높은 감도와 AlCl₃ 복합체 및 크로마토적 분리로 이루어진 구조적 구별을 결합합니다. 더불어, 여러 플라보놀은 자외선 조명³⁰ 아래에서 특징적인 노란빛 띠를 보이는 것으로 알려져 있어, 화합물 분류와 확인을 뒷받침합니다.

마이크로플레이트 방법은 특히 고처리량 스크리닝에 유리합니다. 이들은 최소한의 시료 준비, 낮은 시약 소비, 수십 개의 시료를 동시에 분석할 수 있게 합니다. 일반적인 실험실 조건에서는 널리 사용되는 장비를 사용하여 약 4시간 내에 완전한 마이크로플레이트 분석을 수행할 수 있습니다. 이러한 특성들은 마이크로플레이트 분석법을 신속한 비교 연구, 일상적인 품질 관리, 대규모 샘플 세트의 예비 평가에 매우 적합하게 만듭니다. 반면 HPTLC는 시간과 노동이 더 많이 소요되며, 전체 분석 워크플로우는 보통 7–8시간이 소요됩니다. 또한 모든 실험실에서 제공되지 않는 특수 기기에 의존하며, 전용 판과 유도화 시약의 사용은 분석 당 비용을 증가시킵니다. 또 다른 한계는 매우 낮은 농도의 대사산물이 표준 시각화 조건에서 검출되지 않을 수 있다는 점입니다. 그러나 이러한 실용적이고 감도 관련 한계는 크로마토그래피 분리^30,31의 주요 장점으로 상쇄됩니다. HPTLC는 복잡한 식물 매트릭스에서 개별 성분의 해명, 진정한 분석 반응의 확인, 잠재적 간섭 화합물 검출을 가능하게 합니다. 더불어, 선택적 크로마토그래피 이후 유도화는 화합물을 플라보놀과 5-하이드록시플라본과 같은 기능기로 간단히 분류할 수 있게 하여, 총 성분 추정을 넘어 화학적 해석을 향상시킵니다.

따라서 대규모 연구에서는 분석 워크플로우가 마이크로플레이트 분석으로 시작하여 표적 화합물 농도가 높은 샘플을 신속히 식별할 수 있습니다. 선정된 샘플은 HPTLC 분석을 통해 개별 성분을 시각화하고, 선택성을 평가하며, 이중 유도화를 통한 가능한 간헐 가능성을 평가할 수 있습니다. 이 통합 전략( 그림 8에 나타난 것)은 속도와 처리량을 화학적 특이성과 구조적 통찰과 결합합니다.

그림 8: 샘플 스크리닝 및 분석을 위한 제안된 워크플로우. (A) 대량 샘플의 고처리량 마이크로플레이트 스크리닝. (B) Folin–Ciocalteu 방법을 이용한 정량을 위한 선택된 샘플의 HPTLC 분석과 AlCl₃ 유도체화를 통한 플라보놀 및 5-하이드록시플라본 식별. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

HPTLC와 비교할 때, HPLC는 고해상도 질량분석법(HPLC–HRMS)과 결합되어 문헌에서 가장 흔히 보고된 대안으로, 개별 화합물의 감도와 명확한 구조적 식별을^{제공합니다.} 그럼에도 불구하고 HPLC–HRMS 분석은 각 크로마토그래피 작업이 순차적으로 수행되어야 하며, 계측, 용매 순도 요구, 용매 소비 등 비용이 크게 증가하기 때문에 본질적으로 느립니다. 더불어, 기능류 스크리닝은 복잡한 데이터 처리와 화합물별 해석을 요구하는 반면, HPTLC는 유도화 후 화합물의 직접 시각적 그룹화를 가능하게 합니다. 따라서 HPTLC는 빠른 마이크로플레이트 스크리닝과 포괄적인 HPLC–MS 분석 사이에서 처리량, 비용, 화학적 선택성을 균형 있게 고려하는 효과적인 중간 플랫폼을 제공합니다.

플라보노이드 및 페놀 분석은 식품 과학, 영양보생제, 제약, 농업, 재료 연구 등 다양한 분야에 널리 응용됩니다. 식품 과학에서는 주스, 와인, 차 등 제품의 항산화 능력, 진정성, 유통기한, 품질 관리를 평가하는 데 사용되며, 페놀 숙성도를 기반으로 한 최적의 수확 시기 결정 등 농학 연구를^{지원합니다.} 영양기능식품 분야에서 페놀 프로파일링은 녹차 추출물 캡슐, 포도씨 추출물 보충제, 쿼세틴 정제, 감귤류 바이오플라보노이드 제형과 같은 식물 추출물과 상업 제품의 표준화 및 품질 보증에 필수적입니다. 제약 및 생의학 연구에서는 항산화, 항염증, 항균 잠재력을 가진 생리활성 화합물의 스크리닝을 지원합니다^. 농업과 식물 생리학에서 페놀 결정은 식물 스트레스 반응을 평가하고 작물 개선 전략을 안내하는 데 도움을 줍니다. 또한, 재료 과학, 특히 식물유래 부식 억제제 연구(^34,35)에서는 페놀 특성 분석이 화학 조성과 흡착 행동 및 보호 효율을 연관시키는 데 도움을 줍니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1.5 mL 에펜도르프 튜브	에펜도르프
10 mL 부피 플라스크	아이스코 연구소	CH0451B	10/19 폴리프로필렌 마개, 붕실리케이트 유리, 호박 - 흰색 눈금, 허용 및 플러스먼; 0.025 ml
100 & 마이크로; L과 1000 및 마이크로; L 마이크로피펫 팁	제네릭
100– 1000 & 마이크로; L 마이크로피펫	에펜도르프	리서치 플러스
10– 100 & 마이크로; L 마이크로피펫	에펜도르프	리서치 플러스
15 mL 캡 유리관	제네릭
50 mL 비커	제네릭
8채널 멀티채널 마이크로피펫	ThermoSciecntific
96웰 마이크로플레이트	그라이너	655891	폴리실클로올레핀, 유리 바닥, 검은색
분석적 균형			± 0.0001 g
자동 TLC 샘플러	카마그	ATS4
원심분리기	ThermoSciecntific	소르발 ST8R	≥ 850 & 시간; g
여과지	왓맨		챔버 포화
동결건조기	라브콘코	모델 10
플라스틱 시약 저장소	에펜도르프
평평한 끝과 숟가 끝난 주걱	머크 화학	HS15906
시너지 HT 다중 검출 마이크로플레이트 리더	바이오텍 인스트루먼츠	시너지 HT
TLC 실리카 젤 60 F254 알루미늄 뒷면 플레이트 (10 & times; 20 cm)	머크
TLC 분무기	시그마-올드리치		20 mL
TLC 시각화 도구	카마그	2
초음파 목욕/세척기	크레웍스	ZX-040	온도 조절은 40도 이하로 조절하며; C
UV 램	UPV	UVGL-58
VisionCATS 소프트웨어	카마그
지퍼락 가방	제네릭		1/4 갤런