방법 논문

행동 실험을 기반으로 한 제브라피시 유충에서 MPTP 유도 파킨슨 유사 행동 표현형의 표현형 프로파일링

DOI:

10.3791/70041

⸱

2026년 5월 15일

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1Department of Medicinal Chemistry, State Key Laboratory of Discovery and Utilization of Functional Components in Traditional Chinese Medicine, Key Laboratory of Chemical Biology (Ministry of Education), NMPA Key Laboratory for Technology Research and Evaluation of Drug Products, School of Pharmaceutical Sciences, Cheeloo College of Medicine, Shandong University, 2College of Information Engineering, Ningde Normal University, 3Digital Fujian Research Institute of Big Data for Elderly Rehabilitation and Nursing, 4Department of Neurology, Qilu Hospital Cheeloo College of Medicine, Shandong University, 5Key Laboratory of Bioactive Materials, Ministry of Education, Nankai University, 6Jinan Microecological Biomedicine Shandong Laboratory

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 MPTP 처리된 제브라피시 유충에서 파킨슨병 유사 운동 및 비운동 결손을 평가하기 위한 행동 표현형 패러다임을 확립합니다.

초록

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이 글은 유생 제브라피시에서 MPTP 유발 파킨슨병(PD)에 대한 독특한 다중 매개변수 행동 표현형 분석 프로토콜을 소개합니다. 제브라피시에서 PD 유사 병리의 화학적 유도는 고처리량, 유전적으로 다루기 쉬운 시스템을 제공하지만, 대부분의 연구는 기본적인 운동 분석이나 단순한 밝은-어둠 전이에만 좁게 초점을 맞추고 있습니다. 이러한 제한적인 접근법은 서맥운동, 감각운동 장애부터 불안 유사 행동, 수면 장애에 이르기까지 PD 관련 기능 장애의 광범위한 스펙트럼을 포착하지 못합니다. 이 격차를 해소하기 위해 본 연구는 6가지 보완 검사로 구성된 통합 분석을 개발했습니다: 일반적인 운동 및 탐색 구동 평가를 위한 운동 검사; 불안 관련 경계 선호 행동을 탐지하기 위한 Thigmotaxis 평가; 서맥 및 운동 반응성 저하를 기록하기 위한 놀람 반응 검사; 위험 감수와 스트레스 반응성을 평가하기 위한 밝은-어두운 도전 실험; 감각운동 및 반사 운동을 정량화하기 위한 광운동 반응 패러다임(스트로브 라이트 자극 포함); 그리고 수면-각성 행동을 측정하는 수면-각성 조절 모니터링. 유충 얼룩말피시는 수정 후 1일(dpf)부터 5 dpf까지 비치명적 MPTP 농도에 노출되며, 행동 평가는 4에서 6 dpf 사이에서 시작됩니다. 고해상도 자동 추적은 각 분석마다 여러 행동 평가 결과를 생성합니다. 이 접근법은 이전에 발견되지 않았던 PD와 유사한 변화, 예를 들어 수면 구조의 무질서, 습관 학습 장애, 감각운동 및 반사 운동 등을 밝혀내며, 이는 초기 비운동 증상을 반영합니다. 이러한 검사들을 결합함으로써 연구자들은 인간 파킨슨병의 복잡성을 더 잘 반영하는 포괄적인 행동 증상을 얻을 수 있습니다. 이 프로토콜은 PD 병태 연구, 후보 치료제 선별, 환경 조절 요인 탐색의 패러다임을 확장합니다. 이 컬렉션은 견고하고 다면적인 표현형을 통해 번역적 관련성을 높이는 혁신적인 동물 모델을 제시하는 이 컬렉션의 목표를 잘 보여줍니다.

서론

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파킨슨병(PD)은 알츠하이머병 다음으로 두 번째로 유병이 많은 신경퇴행성 질환입니다. 최근 몇 년간 유병률과 영향을 받는 인원 수가 꾸준히 증가하여 전 세계적으로 중요한 공중보건 도전 과제를 제기하고 있습니다. 파킨슨병 발생률은3, 4세에 걸쳐 눈에 띄게 증가합니다. 임상적으로 PD는 운동장애, 서맥, 안정 시 떨림, 자세 불안정과 같은 운동 증상과 인지 장애, 불안, 수면 장애 등 다양한 비운동 증상으로나타납니다. 현재 PD 진단은 주로운동 증상의 존재에 의존합니다. 하지만 이러한 증상이 나타나기 전에는 흑질의 도파민 뉴런의 60% 이상이이미 손실된 상태입니다. 비운동 증상은 종종 더 일찍 나타나지만, 구체적이고 객관적인 평가 기준이 부재하여 조기 진단과 개입을 복잡하게 만듭니다8. 현재 PD의 주요 치료는 뇌에서 도파민으로 전환되는 레보도파9 투여를 통해 선조체 내 도파민 수치를 보충하는 것입니다. 이 치료법은 일시적으로 증상을 완화할 수 있지만, 질병의 진행을 멈추지는 못합니다10. 따라서 PD의 발병 기전과 약물 선별 검사에 대한 추가 연구가 필수적입니다.

적절한 동물 모델 구축은 PD 및 항 PD 약물 선별 연구에서 매우 중요합니다. 현재 PD 연구에는 세 가지 주요 모델이 있습니다: 화학적 유도 모델11, 유전자 편집 모델12, 그리고 인간 이종이식 모델13. 일반적으로 사용되는 모델 동물로는 쥐와 같은 설치류와 원숭이같은 비인간 영장류가 있습니다. 최근 제브라피시(Danio rerio)는 작은 크기, 빠른 성장, 인간과의 높은 유전적 상동성,투명한 배아 등 PD 연구에서 점점 더 주목받고 있습니다. 신경독소 MPTP(1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘)를 이용해 도파민 뉴런 손상을 유도하는 것은 PD 모델을 구축하는 고전적인 방법입니다. 아치명적 MPTP 농도에 노출된 제브라피시는 다양한 PD 유사 행동 표현형을 보인다19.

그러나 현재 대부분의 제브라피시 PD 연구는 기본적인 운동 행동이나 단순한 밝은 어둠 전이(16,20)에 주로 집중하고 있으며, 단차원 행동 검사로는 PD의 복잡한 행동 특성, 특히 비운동 기능의 행동 변화를 완전히 반영하기 어렵다. PD는운동 조절을 넘어 여러 신경행동 시스템이 관여하는 질병임을 고려할 때, 다기능 표현형을 포착하기 위해 다중 매개변수 행동 표현형 평가 방법이 시급히 필요합니다24.

따라서 본 연구는 MPTP 처리된 제브라피시 유충에서 PD 유사 행동 표현형을 보다 포괄적으로 설명하기 위한 다중, 모수적, 신속한 행동 표현형 분석 프로토콜을 구축하였습니다. 수정 후 1일에서 5일 사이에 유충에게 MPTP(50 μM)25의 아치치명량을 적용하였다(dpf)16, 20, 26. 4부터 6 dpf16, 20, 24까지 6가지 행동 검사를 실시했습니다: 수면-각성 조절 모니터링, 광운동 반응 패러다임, 주행성 평가, 운동 운동 평가, 놀람 반응 검사, 그리고 빛-어둠 도전 검사. 이 행동 평가는 운동 결핍, 감각운동, 습관화 학습, 위험 감수, 스트레스 반응성, 수면-각성 리듬 등 운동 및 비운동 측면 모두를 포함합니다.

Zebrabox 고처리량 비디오 추적 시스템과 정량적 분석 방법을 활용하여 다양한 행동 매개변수를 추출 및 정량화하고, MPTP 처리 그룹과 야생형(WT) 그룹 간의 행동 차이를 통계로 비교하였습니다. 기존의 제브라피시 PD 분석과 비교하여, 이 다중 매개변수 행동 배터리는 표준화된 틀 내에서 운동 및 비운동 표현형을 포착합니다. 자동화된 추적 시스템은 객관적인 행동 데이터 수집과 높은 재현성을 보장합니다. 또한 유충의 작은 몸집 크기 덕분에 개별 개체를 다중 웰 플레이트에 배치할 수 있어 고처리량 평가가 가능합니다. 이러한 장점들은 PD의 병리학적 기전을 심층적으로 분석하고, 후보 약물이나 화합물을 선별하며, 환경적 요인이 PD의 발생 또는 발병에 미치는 영향을 탐구하는 데 유익합니다.

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프로토콜

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이 제브라피시를 대상으로 한 연구는 동물 관리 및 사용에 관한 기관 지침을 준수하여 수행되었으며, 산둥대학교 약학부 윤리위원회(No.YXDW2025-0056)의 승인을 받았습니다. 시약과 사용된 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. MPTP 준비

  1. 100× E3 스톡 용액을 1:100 초순수수와 희석하여 1× E3 배지를 준비합니다(예: 100 mL 5mL× 초순수수 495 mL를 혼합해 1× E3 배지 500 mL를 만듭니다).
    참고: E3 미디엄은 사용 당일에 신선하게 준비하세요.
  2. 50 mL 원심분리관에 5.0 mg MPTP 분말을 추가하고 E3 배지를 최종 부피 25 mL에 첨가하여 1 mM MPTP 스톡 용액을 준비합니다(원심분리관을 혼합 용기로 사용하되 원심분리는 필요 없습니다). 용액을 1 mM MPTP 기본 용액으로 라벨링하세요. 기본 용액은 어두운 곳에 보관하세요.
  3. 50 μM MPTP 용액 제제: 1 mM MPTP 스톡 용액 2.5 mL를 깨끗한 용기에 옮기고, 47.5 mL의 E3 배지와 희석하여 최종 부피 50 mL, 최종 농도는 50 μM MPTP 상태로 만듭니다. 남은 스톡 용액은 계속 어둠 속에 보관되었다.
    주의: MPTP는 강력한 신경독소이므로 극도의 주의가 필요합니다. 항상 장갑, 실험복, 보호 안경 등 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용하세요. 기관 생물안전 지침에 따른 MPTP 폐기물 처리.

2. 제브라피시 배아 준비 및 그룹 분석

  1. 성적으로 성숙한 수컷과 암컷 성체 제브라피시를 선별하고, 분리 가능한 번식 탱크를 이용해 통제된 번식을 수행합니다. 오후 8시에 수컷과 암컷 제브라피시를 번식 수조에 2:3 비율로 분리하고, 칸막이로 분리하세요.
  2. 다음 날 오전 8시에 칸막이를 제거하여 교미를 허용하고 산란을 시작하세요. 1시간 후에 배아를 채취하고, 깨끗한 시스템용 물로 세 번 세척하세요.
  3. 배아는 신선한 E3 배지와 함께 100mm 페트리 접시에 보관하고, 28°C에서 14시간 조명/10시간 어두운 주기(오전 8시부터 오후 10시까지 조명 켜짐)에 배양합니다.
    참고: 정상적인 발달을 위해 20mL 배지를 사용해 접시당 50개를 초과하지 마십시오.
  4. 1 dpf 상태에서 수정되지 않았거나 기형이 있거나 비정상적인 배아를 조심스럽게 파스퇴르 피펫으로 제거하고, 제브라피시 배아가 포함된 용액을 교체합니다. WT 그룹의 경우, 기존 배지를 신선한 E3 배아 배지로 교체하세요. MPTP 처리된 그룹의 경우, 배지를 50 μM MPTP 용액으로 교체한 후 두 그룹 모두 인큐베이터로 돌려보냅니다.
  5. 두 그룹 모두 용액을 교체하고, 죽거나 건강하지 않은 배아는 24시간마다 제거하세요. MPTP 처리군의 경우, 1 dpf 아침부터 4 dpf 아침까지 매일 MPTP 용액을 교체합니다(그림 1A). 그 후 5 dpf 아침부터 실험 종료까지 MPTP 처리군을 E3 매개체로 전환합니다.
    참고: 용액은 Pasteur 피펫을 사용해 부드럽게 교체하세요. 배양지 가장자리에서 배지를 천천히 흡입한 후, 배아 손상을 최소화하기 위해 배지 벽을 따라 신선한 용액을 추가하세요.

3. 수면 - 각성 조절 모니터링

  1. 4 dpf 시, 오후 6시에 각 그룹에서 제브라피시 유충을 선별하고, 개조된 3mL 파스퇴르 피펫을 사용해 팁을 잘라낸 상태에서 96웰 플레이트에 유충 1마리씩 옮깁니다(그림 1B). 처음 네 줄은 WT 그룹을, 마지막 네 줄은 MPTP 그룹(각 그룹에 48마리의 제브라피시)을 나타냅니다.
    참고: 제브라피시를 자극하거나 손상시키지 않으려면, 파스퇴르 피펫을 10mm로 잘라서 4 dpf 제브라피시 유충 크기보다 더 넓은 구경을 만들어 주세요(몸 길이 3.7mm이상).
  2. 각 웰을 입체 현미경으로 관찰하여 각 제브라피시 유충의 외관이 건강한지, 지느러미가 열려 있고 규칙적으로 흔들리고 몸이 똑바로 서 있고, 부레가29도 팽창되어 있는지 확인하세요. 각 웰의 제브라피시가 건강한 상태임을 확인한 후, 각 웰마다 E3 매체를 채우세요.
    참고: 각 우물에는 E3 중간에서 거의 부풀어 오르는 상태로 채워 표면 장력을 유지하세요. 거품과 우물 넘침을 방지하기 위해 액체를 조심스럽게 넣으세요.
  3. 물고기와 액체를 96웰 플레이트에 옮긴 후, 수면-각성 행동 검사 전에 30분간 Zebrabox 챔버에 넣어 적응시킵니다.
    참고: 96웰 플레이트를 Zebrabox 챔버에 넣기 전에, 비디오 트래킹 결과에 오염물이 영향을 미치지 않도록 플레이트 하단을 꼼꼼히 청소하세요.
  4. Zebralab 비디오 추적 소프트웨어를 열고 퀀타이즈 모드를 선택한 후 96웰 플레이트가 Zebrabox 챔버 하단 중앙에 위치하는지 확인하세요.
  5. 조명 조절을 오후 10시에 끄고 오전 8시에 켜도록 설정하는데, 이는 제브라피시가 사육될 때의 빛 조건과 일치합니다. 주간 백색광은 일반적으로 약 1000럭스입니다. 소프트웨어 매개변수를 다음과 같이 설정하세요:29: 검출 임계값 40; 버스트, 25(이동 시 임계값); 이동 시 임계값인 얼림 4; 빈 크기 60 s; 총 모니터링 시간은 52시간(첫날 오후 8시부터 셋째 날 오후 0시까지). 수면-각성 절차를 오후 8시에 시작하세요.
    참고: 절차가 시작되면 실험 내내 외부의 소음과 진동을 금지하여 제브라피시의 정상적인 수면-각성 리듬에 영향을 주지 않도록 하세요. 장기 모니터링 중 수분 증발을 방지하기 위해 96웰 플레이트를 투명 랩으로 덮으세요.
  6. 52시간 후에는 절전-각성 실험을 중단하고 데이터 파일을 저장하세요. ZebraBox에서 96웰 플레이트를 제거하세요.
    참고: MATLAB과 엑셀을 사용하면, 수면 횟수(수면 기간은 최소 1분 이상 지속되는 비활동 기간으로 정의됨), 평균 수면 기간(평균 수면 기간), 총 수면 시간(모니터링 기간 동안 모든 수면 지속 시간), 수면 잠복기(가벼운 전환에서 첫 수면 시작까지의 시간) 등 필요한 매개변수를 포함합니다. 평균 활동(모든 모니터링 기간 동안의 운동 활동으로 정의됨)과 깨어 있는 활동(수면 기간 제외의 각성 시간에만 운동 활동으로 정의됨)이 데이터 파일에서 추출되어 분석되었습니다.
    1. 학생 t-검정을 사용하여 WT 그룹과 MPTP 처리 그룹 간의 차이를 비교합니다. 추가로, MATLAB 소프트웨어를 사용해 52시간 동안 제브라피시의 수면 곡선, 깨어 활동 곡선, 평균 활동 곡선을 그려보세요.

4. 광동기 반응 패러다임

참고: 광운동 반응 패러다임(스트로브 라이트 포함)은 5 dpf 유충을 대상으로 하는 고처리량 행동 검사로, 빛의 갑작스러운 전환에 반응하는 감각운동 및 반사적 운동 변화를 정량화합니다. 이 테스트는 96웰 플레이트를 사용하여 수행되었으며, 두 가지 패러다임을 포함했습니다: (1) 1분간의 어둠에서 1분간의 지속적인 빛(1000 lx)으로의 빛 전환, (2) 1분 어둠에서 1분 스트로브 빛으로 10Hz 스트로브 빛으로 전환하는 스트로브 라이트 응답.

  1. 5 dpf 유충을 96웰 플레이트(웰당 유충 1마리)에 넣고(그림 1B), 각 웰마다 E3 배지를 채웁니다. 총 96마리의 유충을 평균적으로 WT 그룹과 MPTP 그룹으로 나누어 보라.
  2. 다크-상수 빛 패러다임:
    1. 5개의 dpf 유충이 담긴 96웰 플레이트를 Zebrabox에 넣고, 분석하기 전에 어둠 속에서 5분간 유충이 적응하도록 합니다.
    2. 추적-온라인 분석 모드를 열어라.
    3. 빛 전환 프로그램을 다음과 같이 설정하세요: 0-60초: 어둡고, 60-120초: 일정한 빛 (1000 lx).
    4. 프로토콜을 시작하고, 120초 동안 6초마다 관련 운동 파라미터를 수집하세요.
    5. 프로토콜을 120초 에서 중지하고 데이터 파일을 내보내세요. 유충을 완전히 어둠 속에 5분간 두어 환경에 적응시키고, 다음 암흑 스트로브 라이트 검사를 준비시킵니다.
  3. 다크 스트로브 라이트 패러다임:
    1. 빛 전환 프로그램을 다음과 같이 설정하세요: 0-60초: 어둡고, 60-120초: 스트로브 라이트(1000 lx, 10 Hz).
      참고: 10Hz 스트로브는 초당 10번의 빛 펄스에 해당합니다. ZebraLab에서는 100ms마다 빛 세기를 0에서 1000 lx로 번갈아 가며 구현합니다.
    2. 5분 암흑 적응을 완료하면 어둡고 스트로브 빛 분석법을 시작하세요. 120초 측정 기간 동안 6초마다 운동 매개변수를 수집합니다.
  4. 데이터 분석: 분석이 끝나면 데이터 파일을 내보내세요. MATLAB 소프트웨어를 사용해 6초마다 수영 거리를 추출하세요. 두 검사 모두 2분 동안 이동한 총 거리(6초당 평균 값)를 그래프로 표시하세요. 어둠 속에서 1분 동안 이동한 총 거리를 빛 속에서 이동한 총 거리30에서 빼서 동결 지수를 계산합니다.
    참고: 얼음 지수 < 0은 얼음 현상을 나타냅니다; 프리즈 인덱스 > 0은 탈출을 의미하며; 동결 지수 = 0은 반응이 없다는 뜻입니다. 학생 t-검정과 양측 ANOVA를 사용하여 WT 그룹과 MPTP 처리 그룹 간의 차이를 비교합니다. 각 그룹마다 총 48마리의 제브라피시 유충(n = 48)이 사용되었습니다.

5. 촉박성 평가

  1. 6웰 플레이트 두 개를 선택하고, 각 웰에 4mL E3 배지를 채웁니다.
  2. 5 dpf 시, WT 그룹과 MPTP 처리 그룹의 제브라피시 유충을 수집하여 두 개의 6웰 플레이트(하나는 WT 그룹, 다른 하나는 MPTP 처리그룹, 각 웰당 유충 1마리)에 넣었습니다(그림 1C).
    참고: 유충의 초기 위치가 우물의 중앙에 있는지 확인하세요.
  3. 탐욕성 평가 전에 웰 플레이트를 15분 전에 Zebrabox의 적절한 위치에 배치하여 이를 조정해야 합니다.
  4. 데이터 수집 및 분석: Draw Area 함수를 사용하여 각 우물의 관측 영역에 동심원 두 개를 그리면(중심 원의 반지름이 구멍 반지름의 1/2를 차지함) (그림 1C), 나머지 매개변수는 운동 평가와 동일하게 설정됩니다. 5분 단위 주행성 평가 프로토콜을 시작하고, 병행 실험을 진행하세요.
    참고: 프로그램 종료 후 Zebralab 소프트웨어는 5분 이내에 제브라피시 유충의 궤적과 다양한 관련 움직임 매개변수를 생성합니다. 데이터 파일에서 an1은 각 우물의 전체 면적을, an2는 각 우물의 내부 구역을 나타냅니다. 따라서 총 dis(an1)와 총 dur(an1)은 전체 우물에서 머무는 총 수영 거리와 총 시간을 나타내며, 총 dis(an²)와 총 dur(an²)는 각각 내부 구역에서 머무는 거리와 시간을 나타냅니다.
    1. 다음 공식으로 삼가성을 계산합니다:
      외곽 구역에서 수영한 거리의 백분율을 계산하세요:
      figure-protocol-1
      외곽 구역에서 머무는 시간의 비율을 계산하세요:
      figure-protocol-2
    2. 학생의 t-검정을 사용하여 WT 그룹과 MPTP 처리 그룹 간의 주둔성 차이를 비교합니다. 각 그룹마다 총 24마리의 제브라피시 유충(n = 24)이 사용되었습니다.

6. 운동 평가

  1. 5 dpf 시, WT 그룹과 MPTP 처리된 그룹에서 선택된 제브라피시 유충을 각각 두 개의 12웰 플레이트(하나는 WT 그룹, 다른 하나는 MPTP 처리된 그룹, 웰당 유충 1마리, 2 mL E3 배지)로 옮깁니다(그림 1D).
    참고: 제브라피시 유충의 크기가 비슷한지 확인하고, 선택된 유충은 지느러미가 열려 있고, 자세가 곧게 서 있으며, 부레가 잘 확장되어 있고, 규칙적인 움직임을 가져야 합니다.
  2. 로코모터 평가 전에 웰 플레이트를 Zebrabox의 시험 위치에 15분 전에 배치하여 적응하세요.
    참고: 적응 과정의 빛 조건이 시험 중 빛 조건과 일치하는지 확인하세요.
  3. 15분간의 적응 기간 후, 추적 모드-온라인 분석을 선택하고 자동 컴퓨터 비디오 추적 시스템을 사용해 각 유충의 운동 활동을 5분간 기록합니다. Zebralab 소프트웨어를 사용해 60초마다 움직임 경로와 다양한 관련 운동 매개변수를 수집하고, 전체 데이터 파일을 내보내 MATLAB을 사용해 5분 동안 각 유충의 총 거리와 평균 속도를 분석합니다.
    1. 학생 t-검정과 양측 ANOVA를 사용하여 WT 그룹과 MPTP 처리 그룹 간의 차이를 비교합니다. 각 그룹마다 총 24마리의 제브라피시 유충(n = 24)이 사용되었습니다.

7. 놀람 반응 검사

참고: 이 검사는 갑작스러운 어둠 전환에 의해 유발되는 시각 깜짝 반응(VSR), 즉 어둠 섬광 유발 놀람을 측정합니다. 이 놀람 반응 검사는 갑작스럽고 밀리초 규모의 어두운 섬광에 의해 유발된 광 유발 시각 놀람을 평가합니다. 지속적인 행동 반응을 평가하기 위해 반복적인 빛 펄스를 사용하는 다크 스트로브 라이트 패러다임과 달리, 이 검사는 급성 시각 자극에 대한 빠르고 반사적인 운동 반응에 초점을 맞춥니다.

  1. 준비: 5 dpf 상태에서 WT 그룹과 MPTP 처리 그룹에서 제브라피시 유충을 선택하여 각각 두 개의 12웰 플레이트(하나는 WT 그룹, 다른 하나는 MPTP 처리 그룹, 웰당 유충 1마리, 2 mL E3 배지를 사용함)로 옮깁니다(그림 1D).
  2. 스타플 반응 테스트 전에 적응하기 위해 5분 전에 웰 플레이트를 Zebrabox 테스트 위치에 놓으세요.
  3. 자극 매개변수를 설정하세요: Zebralab 소프트웨어를 열고, 추적 온라인 분석 모드를 실행하고, 빛 트리거 인터페이스를 열고, 아래 3가지 트리거 방법 중 하나를 선택하세요. 향상된 자극을 활성화하고, 세션 시작 시점으로 설정; 전환 일정에서 다크 플래시 리듬은 다음과 같이 정의됩니다(프로그램은 21초 후 트리거 시작): 전환 1: 5 ms, 100% 빛 강도; 전환 2: 2890 ms, 100% 빛 강도; 전이 3: 5 ms, 빛 강도 0%; 전이 4: 100 ms, 빛 강도 0%; 주기적인 깜빡임을 보장하기 위해 전환 목록을 반복 하세요.
  4. 프로토콜 시작: Numeriscope 비디오 녹화 기능이 켜져 있는지 확인하세요. 고처리량 자동 추적이 이 90초 테스트에서 30개의 행동 엔드포인트를 포함하는 다차원 데이터셋을 생성합니다.
  5. 데이터 분석: 놀람 반응 분석이 완료된 후 원시 데이터 파일을 내보내 MATLAB 소프트웨어에 입력하여 분석합니다. 각 유충의 수영 거리를 3초 간격으로 계산하고, 평균 수영 속도를 계산하세요.
    1. 각 그룹별로 플래시 자극 후 최대 이동 거리, 최대 속도, 반응 지연을 식별하세요. 학생 t-검정과 양측 ANOVA를 사용하여 WT 그룹과 MPTP 처리 그룹 간의 차이를 비교합니다. 각 그룹마다 총 24마리의 제브라피시 유충(n = 24)이 사용되었습니다.

8. 빛-어둠 도전 분석

  1. 5 dpf에서 제브라피시 유충을 개별적으로 두 개의 24웰 플레이트(그림 1E)로 옮기며, 각 웰당 유충 1마리, 웰당 1mL의 E3 배지를 투여합니다. 각 판에는 24마리의 유충이 있었고, 두 개의 24웰 판은 WT 그룹과 MPTP 처리된 그룹으로 균등하게 나뉘어 있었습니다(그룹당 n = 24개).
  2. 테스트 전에 24웰 플레이트를 Zebrabox 내부 지정된 테스트 구역에 놓아 5분간 가벼운 적응 시간을 가해 테스트 환경에 적응하세요. 추적-온라인 분석 모드를 활성화하세요. 조명 프로그램을 다음과 같이 구성하세요: 6분간 지속적인 빛 후 4분간 완전한 어둠 상태(그림 1E). 총 테스트 시간은 10분이며, 데이터 수집 간격은 60초입니다.
    참고: 전 지구 6분의 빛은 적응과 습관화를 위한 것이며, 안정적인 기초 운동 능력과 특별한 빛-어둠 반응을 보장합니다31,32.
  3. 10분이 되면 행동 기록을 중단하고 데이터를 저장하세요. 조심스럽게 제브라박스에서 플레이트를 분리하세요.
  4. 각 유충마다 60초 간격에서 수영 거리를 추출합니다. 빛 단계(0th-6분), 어두운 단계(7th-10분), 그리고 총 10분 동안 이동한 거리를 계산합니다. 어둠 단계에서 삼각성 행동과 습관화 학습 성과를 정량화하세요.
    참고: 습관 학습은 동물이 연속적인 자극/환경에 노출되었을 때 행동 반응이 감소하는 것으로 정의되며, 밝음에서 어두운 전환 후 1분과4분 동안 이동한 평균 총 거리(mm)를 통계적으로 비교하여 평가되었습니다. 학생 t-검정과 양측 ANOVA를 사용하여 WT 그룹과 MPTP 처리 그룹 간의 차이를 비교합니다. 각 그룹마다 총 24마리의 제브라피시 유충(n = 24)이 사용되었습니다.

9. MPTP 폐기물 처리

참고: 각 행동 실험 후에는 MPTP 접촉 표면(예: 실험실 작업대와 ZebraBox)에 갓 준비한 차아염소산나트륨(표백제; ≥10% v/v)으로 뿌리고 닦아주세요.

  1. MPTP의 액체 폐기물(남은 노출 용액과 세척 배지 포함)과 고형 폐기물(예: 파스퇴르 피펫, 장갑, 페트리 접시, 다중 웰 플레이트)을 수집합니다. 명확히 유해 신경독성 폐기물로 표시하세요.
  2. 오염된 액체 폐기물 및 고체 물질은 신선하게 준비된 차아염소산나트륨(표백제; ≥10% v/v)으로 최소 24시간 이상 처리하여 제염을 보장하고, 이후 기관 규정에 따라 폐기합니다.
  3. MPTP 처리된 제브라피시 유충을 희석된 차아염소산나트륨 용액(예: 6% 표백제 1:5 비율)에 5분35분간 담가 안락사시킵니다. 움직임과 심장 박동 부진으로 인한 사망이 확인되었습니다. 오염 제거된 유충과 매체는 기관에서 승인한 프로토콜을 준수하여 유해 생물학적 폐기물로 처리합니다.

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결과

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수면-각성 조절 모니터링
52시간 수면-각성 조절 모니터링은 4 dpf에서 시작되었으며 96웰 플레이트를 사용해 수행되었습니다. MPTP 처리된 제브라피시는 WT 그룹에 비해 수면 구조에 유의미한 장애가 나타났습니다. 대표적인 수면 곡선, 각성 활동 플롯, 평균화된 활동 흔적은 그림 2에 나와 있습니다. 제브라피시 유충의 수면-각성 조절 분석 매개변수는 그림 3에 나와 있습니다. MPTP 그룹의 총 수면 시간은 WTs에 비해 유의하게 증가했습니다(학생 t-검정 p < 0.01). MPTP 그룹은 WT에 비해 수면 발작 횟수가 감소했으며(p < 0.001), 평균 수면 발작 시간은 증가했습니다(p < 0.0001). 수면 잠복기는 그룹 간 유의미한 차이가 없었습니다. MPTP 그룹에서는 웨이크 활동도 저하되었고(p < 0.01),...

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토론

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이 연구는 MPTP 유발 PD와 유사한 행동 표현형을 평가하고 분석하는 포괄적인 프로토콜을 개발하고 검증하였습니다. 이 프로토콜은 6가지 검사, 운동 운동 평가, 주행성 검사, 놀람 반응 검사, 광운동 반응 패러다임(스트로브 라이트 자극 포함), 빛-어둠 도전 검사, 수면-각성 조절 모니터링을 통합하여 파킨슨병의 운동 및 비운동 결함을 평가하고 묘사하였습니다. 결과는 WT 그룹과 비교했을 때, MPTP 처리된 제브라피시 유충은 운동 및 비운동 행동 변화를 보였으며, 여기에는 운동 감소, 감각운동 반응 저하, 수면-각성 리듬 장애 등이 포함되며, 이는 PD와 유사한 증상을 보였습니다. 이 발견들은 제브라피시 모델의 견고성과 이 다중 행동 검사 방법의 파킨슨병 유사 증상 포착 가능성 및 가능성을 입증했습니다.

실험은 1 dpf에서 제브라피시 배아 준비로 시작되었습니다. 유충은 50 μM MPTP(MPTP 처리군) 또는 E3...

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공개 사항

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저자들은 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

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이 연구는 중국 국가자연과학기금(번호 21906095), 산둥대학교 청년 학자 미래 프로그램 후원, 산둥 자연과학재단(번호)의 보조금으로 지원받았습니다. ZR2019BB018), 산둥대학교 기초 연구 기금(번호 2017GN0030), 중국박사후 과학기금(번호 2018M640640)을 포함합니다. 또한 2025년 디지털 푸젠 빅데이터 연구소의 노인 재활 및 간호 공개 연구 기금(보조금 번호) 지원도 받고 있습니다. BDRI202502) 및 난카이 대학교 교육부 생리활성 소재 핵심 연구소의 2025년 공개 연구 기금(보조금 번호) SWHX-202503). 산둥성 지난 미세생태생물의학 연구소 연구 프로젝트(연구비 번호 JNL-2023002KF). 저자들은 실험 기간 동안 도움을 주신 산둥대학교 칠루병원 실험동물센터와 산둥대학교 칠루병원 임상실험실의 쑨청시 박사님께 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
100번; E3 스톡 해법상하이 페이시 바이오테크놀로지해당 없음NaCl 34.8g, KCl 1.6g, CaCl2middot 5.8g 함유; 2H2O, 그리고 9.78g MgCl2middot; 리터당 6H2O
12웰 세포 배양 플레이트NEST 생명공학712011비처리, 비발열, 멸균, 폴리스티렌. 제브라피시 유충 행동 검사에 사용됨
24웰 세포 배양 플레이트NEST 생명공학702011비처리, 비발열, 멸균, 폴리스티렌. 제브라피시 유충 행동 검사에 사용됨
3 mL 파스퇴르 피펫바이오로직스30-0238A1
6웰 세포 배양 플레이트NEST 생명공학703011비처리, 비발열, 멸균, 폴리스티렌. 제브라피시 유충 행동 검사에 사용됨
96웰 세포 배양 플레이트NEST 생명공학701011비처리, 비발열, 멸균, 폴리스티렌. 제브라피시 유충 행동 검사에 사용됨
MATLAB R2020aMathWorks, 미국;해당 없음MATLAB R2020a, 산둥대학교 소프트웨어 포털(softms.sdu.edu.cn)에서 발급한 캠퍼스 전체 라이선스. 제브라피시 유충 행동 데이터의 통계 분석에 사용됩니다.
마이크로소프트 엑셀마이크로소프트해당 없음Microsoft Excel(Microsoft Office 일부), 산둥대학교 라이선스 소프트웨어 포털(softms.sdu.edu.cn)을 통해 설치된 버전.
MPTP(1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘) 및 nbsp;비요타임411252815mg
페트리 접시NEST 생명공학704202100mm, 멸균, 손잡이가 쉬워, TC-처리됨
차아염소산나트륨 용액맥클린S817439기본 가정용 표백제(활성 염소 베이스 6-14%), 희석하여 &GE; 표면 및 폐기물 정화에 10% v/v; 또한 MPTP 처리한 제브라피시 유충의 안락사를 위해 1:5 희석(표백제: 물 6%)을 사용했습니다.
입체 현미경올림포스SZX2 시리즈
제브라박스 고해상도 비디오 추적 시스템 뷰포인트, 프랑스  해당 없음
제브라랩 소프트웨어 뷰포인트, 프랑스  해당 없음버전 (3,52,3,87)

참고문헌

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