쥐 사회 행동 네트워크의 2색 다섬유 광도 측정 기록

요약

섬유 광도측정은 심부 뇌 신경 집단에서 칼슘 활동을 기록하는 데 가장 흔히 사용되는 기법 중 하나입니다. 여기서는 마우스의 심부 뇌 신경 집단에서 나오는 칼슘 활동 및 기타 동적 형광 신호를 맞춤형으로 다중 부위 2색 영상화하는 프로토콜을 설명합니다.

초록

광섬유 광도계는 광섬유 케이블을 통해 신호를 대량으로 기록하는 방법으로, 자유롭게 움직이는 설치류 내 신경세포 그룹에서 칼슘 활동을 기록하는 데 유용합니다. 특히, 이 방법은 뇌의 더 복측적이고 접근하기 어려운 부위에 있는 소수의 유전적으로 지정된 뉴런을 표적으로 삼는 것이 해결 가능한 문제를 만듭니다. 세포 해상도로 기록하는 것이 여전히 어렵기 때문입니다. 이 기술은 번들된 다중 섬유 접근법을 통해 여러 부위에서 동시에 기록할 수 있으며, 각 기록된 부위에서 유전적 전략을 사용하여 여러 세포 유형을 표적으로 삼을 수 있습니다. 여기서는 마우스 사회적 행동 네트워크(최대 12개 사이트)를 타겟팅하기 위한 맞춤형 멀티파이버 배열을 구축하고 삽입하는 방법에 대한 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜은 맞춤형 다중 섬유 배열을 이용한 다중 부위를 성공적으로 표적화하는 데 필요한 외과적 수술 절차와, 각 부위에서 두 개의 유전적으로 확인된 신경 집단을 동시에 촬영하기 위해 칼슘 활성의 녹색 및 적색편이 형광 지표를 전달하는 바이러스 접근법을 상세히 설명합니다. 우리는 상업적으로 판매되는 상보성 금속 산화물 반도체(CMOS) 카메라 시스템을 사용하여 사회적 행동 중 이러한 영역에서 기록하는 방법을 시연합니다. 또한 이 프로토콜은 품질 관리 방법을 시연하고 잡음 보정 및 표준화를 위한 전처리 파이프라인을 상세히 설명합니다. 마지막으로, 대규모 뇌 네트워크에 관한 새로운 발견을 밝히기 위한 도구의 잠재적 응용 사례에 대해 논의합니다.

서론

광섬유 광도측정은 광섬유 케이블을 통해 형광 신호를 대량으로 기록하는 기술로, 심부 뇌 영역에서 신경 집단 활동을 측정하는 강력한 기술로 부상했습니다. 이러한 부위들은 종종 미세내시경이나 전통적인 전기생리학적 접근법으로는 쉽게 접근하기 어렵습니다 ^1,2,3. 현대 시스템 신경과학의 주요 목표 중 하나는 행동 생성에 관여하는 대규모 세포 유형별 뇌 네트워크가 사용하는 계산을 식별하고 해명하는 것입니다. 신경 픽셀 탐침과 시판 멀티파이버 페룰은 선형 정렬된 신경 집단 ^4,5,6,7에서 기록하는 데 뛰어나며, 광시야 피질 영상은 표재 피질 역학 ^8,9를 훌륭하게 커버합니다. 그러나 공간적으로 분산되어 있으면서도 기능적으로 연결된 피질하 신경 집단으로부터 동시에 기록하는 것은 기술적으로 여전히 어려운 과제로 남아 ^있다. 또한, 여러 개의 단일 섬유 페룰을 이용해 여러 뇌 심부 구조를 표적으로 삼을 수 있지만, 이 방법은 여러 개의 페룰을 이식할 수 있을 만큼 서로 충분히 떨어진 신경 집단에 한정^됩니다. 맞춤형 다중 광섬유 광도 배열은 자유롭게 행동하는 동물의 여러 피질하 영역에서 최소한의 제약으로 동시에 기록할 수 있게 하여 복잡한 행동 중 네트워크 수준의 조정을 독특하게 엿볼 수 있는 창을 제공합니다.

사회행동 네트워크(SBN)는 대규모 뇌 네트워크 역학을 연구하는 데 이상적인 시스템을 나타냅니다. SBN은 사회적 행동 생성에 관여하는 밀집 상호 연결되고 진화적으로 보존된 피질 하 구조의 집합으로, 모든 척추동물 분류^{13, 14, 15}에서 확인되었습니다. 이 구조들은 전통적으로 외측 중격, 시전부, 말단 선조의 바닥핵, 전부 및 복측 시상하부 핵, 내측 편도체, 종이핵, 그리고 수도관 주변 회색 13,14,15를 포함하지만 이에 국한되지 않습니다. SBN 내에서는 분자 마커로 정의된 특정 신경 집단이 사회적 행동 조절에 중요한 역할을 합니다. SBN ɣ-아미노부티르산 에르성(GABAergic) 뉴런(소포성 GABA 수송체 발현으로 표시)과 글루타마트성 뉴런(소포성 글루타메이트 수송체, VGlut의 발현으로 표시됨)은 네트워크 내에서 주요 흥분성 및 억제성 세포 유형을 나타내며, 사회적 행동 조절에 있어 해리 역할을 할 가능성이 높습니다 16,17,18,19. 이러한 고전적인 신경전달물질 시스템을 넘어, 성호르몬 신호전달은 네트워크 기능에서 중요한 역할을 합니다. 예를 들어, 많은 남성과 여성의 사회적 행동은 에스트로겐 수용체 알파의 발현을 필요로 하며, 이 수용체를 발현하는 SBN 뉴런의 활동이 인과적으로 이러한 행동을 유도합니다. 16,20,21,22,23,24,25,26. 또한 SBN 신경 집단은 도파민, 아르기닌 바소프레신, 옥시토신, 오피오이드, 타키키닌, 신경펩타이드 Y, 프로락틴, 오렉신, 아구티 관련 펩타이드, 멜라노코르틴, 키스펩틴, 그리고 생식선 자극호 르몬 17,18,19,27,28,29,30 등 다양한 신경조절계의 리간드와 수용체로 풍부합니다.³¹, 그리고 최근 유전적으로 인코딩된 센서의 발전으로 이들 다양한 신호 분자 중 많은 부분을 추적할 수 있게 되었습니다 (32,33,34,35,36,37,38). SBN 신경 집단이 피질하 구조 전반에 공간적으로 분산되어 있기 때문에, 전통적인 실험 준비(예: 세포외 전기생리학, 피질 표면 영상, 초기 다중 섬유 광도 측정법)는 이 대규모 뇌 네트워크 전반의 순간순간 활동 역학을 포착할 수 없습니다. 그럼에도 불구하고, 유전적으로 정의된 신경 집단의 칼슘 역학과 신경조절자 방출 패턴을 함께 모니터링함으로써, 맞춤형 다중 부위 섬유 광도 측정 플랫폼은 특정 세포 유형과 신호 분자가 사회적 행동의 특정 특징을 암호화하는지 밝혀내어 새로운 메커니즘적 통찰을 제공합니다.

여기서 우리는 자유롭게 행동하는 쥐의 최대 12개 뇌 영역에서 동시에 기록할 수 있는 다중 부위 2색 섬유 광도 측정을 위한 맞춤형 플랫폼을 개발했습니다. 이 접근법을 사용하여 11개의 SBN 뇌 영역에 분포한 22개의 확인된 신경 집단에서 칼슘 활성의 2색 광도 측정을 수행했으며, GPCR 활성화 기반 DA 센서(GRAB-DA1m^)를 이용해 핵 대위의 도파민 변동도 측정했습니다(표 1). 이 프로토콜(그림 1)은 맞춤형 다중 섬유 배열 구축, 여러 뇌 심부 부위 표적 지정을 위한 외과적 절차, 이중 칼슘 지표 발현을 위한 바이러스 전달 전략(GCaMP³⁹ 및 RCaMP⁴⁰), 상업용 CMOS 카메라 기반 광도 측정 시스템을 이용한 데이터 수집, 품질 관리 방법, 그리고 잡음 보정 및 신호 표준화를 위한 전처리 파이프라인을 상세히 설명합니다. 특히 저희 전처리 파이프라인에는 이소스베스틱 제어 파장 기록이 포함되어 있어 모션 아티팩트 보정이 가능합니다. 우리는 회귀 기반 접근법⁴¹을 사용하여 움직임 아티팩트를 보정하여 탑승이나 싸움과 같은 격렬한 사회적 행동 시 신호 정확도를 보장합니다. 저희 맞춤형 다중 섬유 광도 측정 방법은 유전적 표적^42,43을 통해 기록의 세포 유형 특이성을 유지하면서 근위와 원위 뇌 모두에 분산된 활동을 동시에 모니터링할 수 있어, 심부뇌 대규모 뇌 네트워크 전반에 걸친 신경 활동 역학 기록에 있어 대안적 접근법에 비해 상당한 이점을 제공합니다.

이 프로토콜은 자유롭게 행동하는 동물의 공간적으로 분산된 피질 하 뇌 영역(≥4 부위)에서 동시 기록이 필요한 실험에 최적화되어 있으며, 특히 유전적으로 정의된 세포 유형 간 네트워크 수준의 역학을 연구하거나 신경 활동과 함께 신경조절자 방출을 추적할 때 적합합니다. 이 접근법은 격렬한 움직임(예: 사회적 상호작용)을 포함하는 자연주의적 행동을 연구하는 데 특히 가치가 있으며, 우리의 모션 아티팩트 보정 파이프라인이 신호 충실도를 보장합니다. 그러나 단일 세포 해상도, 체세포 신호와 축삭 신호의 구분, 또는 표재 피질 영역에서의 기록을 원하는 연구자들은 미니어처 현미경, 뉴로픽셀, 광시야 영상 등 대체 접근법이 더 적합할 수 있습니다. 주요 실질적 고려사항으로는 수술의 복잡성, 맞춤형 다중 섬유 배열 제작의 필요성, 그리고 필요한 재료 인프라(3D 프린팅 능력, 광섬유 도구)의 구축이 포함됩니다.

프로토콜

참고: 이 프로토콜은 8주에서 25주 사이의 성체 쥐를 대상으로 시험 및 검증되었습니다. 쥐들은 21–26°C, 습도 30%-70%의 환경에서 12시간 역방향 어두운 빛 주기(OFF: 오전 10:00; ON: 오후 10시). 실험은 오직 주관적 활동(어두운) 단계에만 진행되었습니다. 음식과 물은 자유롭게 제공되었다. 모든 동물 시술은 프린스턴 대학교 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았으며, 국립보건원(NIH) 기준에 부합했습니다.

1. 멀티파이버 어레이 및 패치코드 제작 (그림 1A)

1. 패치코드 제작 (그림 2A).
   1. 12 섬유 분기 패치코드를 구하고, 제공된 패치코드 커넥터와 입체 정관 드릴링 액세서리(보조 파일 1, 보조 파일 2, 보조 파일 3)를 수지(인장 강도: 8.7킬로파운드/제곱인치 [ksi], 전자 모듈: 377 ksi, 열 편향: 138 °F, 길이 8%)를 사용해 출력하세요.
   2. 제공된 폴리싱 퍽(보충 파일 4)을 2인치 직경의 스테인리스 스틸 막대로 만들고, 퍽 중앙에 멀티파이버 배열 크기의 컷아웃을 포함하세요.
   3. 1.22mm x 11mm 드릴 비트로 멀티파이버 배열의 더웰 핀 관통구멍에서 남는 수지를 수동으로 제거하세요. 정밀 3D 프린팅을 해도 도웰 핀 구멍이 막대가 통과하기에는 약간 너무 작습니다.
   4. 섬유 구멍을 뚫으세요.
      1. 입체 정위 드릴링 액세서리의 4핀 구멍 모두에 합금강 막대 핀(1.19mm x 12.7 mm)을 삽입하고, 패치코드 커넥터를 아래쪽이 위로 향하게 하여 멀티파이버 배열의 막대 핀 관통 구멍을 통과합니다.
      2. 나사구멍에 M4 크기 세트 스크류를 조여 패치코드 커넥터를 고정하고, 입체 정식 드릴링 액세서리를 입체 정위 프레임에 고정하세요.
      3. 입체 정위 드릴에 0.25 mm x 5.5 mm 드릴 비트를 삽입하고 드릴을 입체 정위 프레임에 장착하세요. 이 드릴 비트를 사용해 다중 섬유 배열의 요, 피치, 롤을 최대 편차 허용 ±.03 mm로 평탄하게 조정합니다.
         참고: 3D 프린트의 가장 앞쪽과 후방 위치에서 요와 피치를 수평 조절하고, 멀티파이버 배열의 네 모서리에서 수평 롤을 사용하세요.
      4. 3D 프린팅된 섬유 구멍 중 하나를 중심에 드릴링하고, 입체 정의 프레임 X/Y 좌표를 관련 뇌 영역의 ML (X) 및 AP (Y) 좌표로 설정합니다(표 1). 드릴을 입체 고정 프레임의 새로운 (0, 0) 좌표로 이동시켜 드릴을 앞쪽 도웰 핀 관통 구멍 위에 중앙에 맞춥니다.
      5. 0.25mm x 5.5mm 드릴 비트를 사용해 각 섬유 관통 구멍을 입체적으로 정의된 좌표에서 5.5mm 깊이까지 뚫으세요(표 1).
         참고: 입체 정관 프레임에서 멀티파이버 배열을 제거하기 전에 모든 구멍이 완전히 뚫렸는지 긴 여분 광섬유를 사용하세요. 이렇게 하면 멀티파이버 배열을 통과 구멍을 제거하기 위해 평탄하게 조정하고 드릴링해야 하는 횟수를 줄일 수 있습니다.
   5. 패치코드 커넥터와 분기 패치코드를 연결하세요
      1. 패치코드 섬유를 > 10cm 노출하세요. 섬유 스크라이브로 섬유를 다듬어 길이가 같은지 확인하세요. 그 다음, 패치코드의 12개 섬유 주위에 각각 3/16인치와 5/16인치 열수축 튜브 한 조각씩을 감싸세요.
         참고: 튜빙은 커넥터에 접착된 후 노출된 섬유를 보호합니다.
      2. 각 광섬유를 패치코드 커넥터의 통과 구멍 중 하나에 삽입하여 하단 표면에 약 0.3mm 두께의 광섬유가 노출되도록 합니다. 모든 섬유를 삽입한 후, 21–27G 바늘 끝으로 패치코드 커넥터 상단에 순간접착제를 발라서 섬유를 고정합니다.
      3. 패치코드 커넥터 상단에 0.5–1cm 높이의 피라미드 모양으로 에폭시를 발라줍니다. 섬유가 삽입된 표면 외에는 에폭시가 덮이지 않도록 하세요. 에폭시는 실온에서 하룻밤 경화시키세요.
      4. 열풍기를 가장 낮은 설정으로 사용해 에폭시와 그 위에 노출된 섬유 위로 열수축 튜브를 수축시키세요(<3–5cm).
         참고: 화상을 방지하기 위해 열 수축 튜브를 만지지 마세요.
      5. 내경 3mm의 부드러운 플라스틱 튜브를 남은 노출된 섬유 길이만큼 잘라내고, 튜브 가장자리를 따라 틈을 내어 남은 노출된 섬유를 튜브 안에 감싸세요.
      6. 투명 튜브에 불투명한 검은색 마커를 사용해 섬유가 더 이상 보이지 않게 하여 영상 실험 중 노출된 섬유로 인한 조명을 최소화합니다.
   6. 패치코드를 닦아라.
      1. 맞춤 폴리싱 퍽에 패치코드 커넥터를 하단 아래로 고정하세요. 패치코드 커넥터를 6 μm, 3 μm, 1 μm 그리고 0.01 μm 그립 연마 시트에 10–20회 동작으로 무한대 심볼/시트 모양으로 연마합니다. 1 μm 및 0.01 μm 그릿 시트의 경우, 연마 전에 증류수 5방울 떨어뜨립니다.
      2. 커넥터 표면을 닦아 과도한 증류수를 제거하세요. 패치코드 커넥터의 광택 표면에 섬유 흠집이나 균열이 있는지 밝시야 현미경으로 확인하고, 있다면 다시 연마하세요.
   7. 패치코드 출력을 확인하세요.
      1. 패치코드의 Sub-miniature 버전 A(SMA) 커넥터 끝을 CMOS 카메라 기반 광섬유 광도 측정 이미징 시스템에 연결합니다. 시각적 코딩 소프트웨어를 사용해 광도 측정 이미징 시스템의 매뉴얼을 따라 CMOS 카메라를 패치코드의 SMA 쪽에 초점을 맞추세요.
         참고: 매뉴얼은 소프트웨어 업데이트에 맞춰 정기적으로 업데이트됩니다. 광도 측정 시스템의 시각적 코드는 새로운 소프트웨어 릴리스에 따라 자주 변경되기 때문에, 이 매뉴얼은 최신 소프트웨어 릴리스에 대한 최신 정보를 담고 있습니다.
      2. 광파워미터로 20% 출력으로 470nm 패치코드 출력을 측정하세요. 패치코드 출력이 2.5 mW< 경우 1.1.7 단계를 반복합니다.
2. 멀티파이버 어레이를 제작하세요.
   1. 제공된 멀티파이버 배열(보충 파일 5, 보충 파일 6)을 1.1.1 단계에서 설명한 기술 사양에 따라 수지를 사용해 출력합니다.
   2. 멀티파이버 어레이 준비.
      1. 멀티파이버 배열 측면 모서리의 네 개 슬롯 각각에 M0.6 황동 육각 너트를 삽입하고, 육각 너트 구멍을 개구부 중앙에 맞춥니다.
      2. 각 육각 너트 슬롯 옆에 21–27 G 바늘 끝으로 순간접착제 한 방울을 바르고, 필요하면 보강을 위해 추가 방울을 추가하세요. 접착제를 실온에서 5분간 말린 후 다음 단계로 넘어가세요.
      3. 면도날로 멀티파이버 배열 옆면의 접착제를 면도하여 광택 퍽에 잘 맞도록 하세요.
      4. 멀티파이버 배열 표면 쪽에 과도한 순간접착제가 마른 경우, 맞춤형 연마 퍽과 30 μm 그릿 연마 시트를 사용해 접착제가 제거되고 멀티파이버 배열 표면이 평평해질 때까지 연마합니다.
      5. 멀티파이버 배열의 도웰 핀 관통 구멍에서 1.22mm 드릴 비트로 남은 수지를 수동으로 제거하세요.
   3. 섬유 통과 구멍을 뚫으세요(그림 2B-C).
      1. 입체 정위 드릴링 액세서리의 4개 핀 구멍 모두에 합금강 막대 핀(1.19mm x 12.7 mm)을 삽입하고, 멀티파이버 배열의 표면 측면(평면 측면)을 위쪽으로 올려 놓으며, 막대 핀은 멀티파이버 어레이의 막대 핀 관통 구멍을 통과합니다.
      2. 1.4.2 단계를 반복하여 1.4.5 단계를 반복합니다.
   4. 멀티파이버 배열에 사용할 광섬유를 준비하세요.
      1. 광섬유 스트리퍼를 사용해 200 μm, 0.39 NA 광섬유 단면의 플라스틱 케이스를 제거하세요. 섬유질을 에탄올로 깨끗이 청소하세요.
      2. 섬유를 섬유 절단기를 사용해 ~3–5cm 길이의 조각으로 절단합니다. 섬유 스크라이브를 사용해 이 부분들을 다시 반으로 쪼개세요. 밝시야 현미경을 사용해 절단된 부분의 적어도 한쪽 끝에 흠집이나 흠집이 없는지 확인하세요. 한쪽 끝이 깨끗한 섬유만 사용하세요.
      3. 최소 15mm 길이의 정밀 자를 밝시야 현미경 아래에 테이프로 붙입니다. 섬유의 흠집 없는 면을 자의 0mm 위치에 놓으세요(그림 2D). 각 목표 영역에 대해 원하는 길이로 섬유를 절단합니다(표 1).
         참고: 광섬유 길이는 가장 깊은 광섬유의 입체 정위 D/V 좌표에 6mm를 추가한 후, 모든 광섬유의 D/V 좌표와 가장 깊은 광섬유의 D/V 좌표 차이를 맞추도록 조정하여 계산합니다.
   5. 멀티파이버 배열에 광섬유를 삽입하세요.
      1. 멀티파이버 배열을 제작 홀더에 표면이 아래로 향하게 배치하세요. 도웰 핀으로 작품을 정렬하고 고정하세요.
      2. 광섬유 길이를 사이트와 일치시키고(표 1), 절단된 광섬유를 다중섬유 배열의 적절한 관통구멍에 삽입하여 흠집 없는 면을 위로 향하게 합니다. 다음 단계에 들어가기 전에 모든 섬유가 완전히 밀려 들어가도록 하세요.
      3. 21–27G 바늘 끝으로 순간접착제를 발라 모든 섬유를 제자리에 붙이세요. 접착제를 실온에서 최소 30분간 구동한 후 계속 작업하세요.
   6. 멀티파이버 배열을 표면이 아래로 향하게 하여 1.1.6 단계를 반복하여 연마합니다(그림 2E).
   7. 멀티파이버 어레이 효율을 점검하세요.
      1. 멀티파이버 배열의 광택 있는 표면을 에탄올로 깨끗이 닦은 후 인덱스 매칭 젤을 바르세요. 패치코드 커넥터에 4개의 도웰 핀을 삽입하고 G5 드라이브 나사와 관련 드라이버로 멀티파이버 배열을 고정합니다(그림 2F).
      2. 파워미터를 사용해 멀티파이버 배열에서 나오는 470nm와 560nm LED 방출을 측정하세요. 다음 값으로 효율을 계산합니다:
         
      3. 효율이 <75%라면 1.2.7.1–1.2.7.2단계를 반복합니다.
         참고: 재연마가 효율을 개선하지 않고 섬유에 흠집이 없다면, 멀티파이버 배열의 섬유가 패치코드 커넥터와 정렬이 어긋났을 가능성이 있습니다.
   8. 멀티파이버 배열을 준비하여 사용하세요(그림 2G).
      1. 멀티파이버 배열의 관통구멍에 4개의 더웰 핀을 삽입합니다. 다웰 핀이 멀티파이버 배열의 뇌 쪽에서 1mm 이상 튀어나오지 않도록 주의하세요.
      2. 도웰 핀에 순간접착제 브레인 사이드를 붙이세요. 멀티파이버 배열을 사용하기 전에 접착제를 실온에서 최소 10분간 건조시키세요.

2. 수술 (그림 1B)

1. 수술 공간과 도구를 준비하세요.
   1. 무균 작업 공간을 보장하기 위해 깨끗한 입체 정위 프레임을 사용하세요.
   2. 멸균 흡수성 봉합선을 구하세요.
   3. 고양이 겸자 두 개, 가위, 불독 클램프 두 개를 오토클레이브하세요.
   4. 베이퍼라이저에 아이소플루란이 채워져 있는지 확인하세요. 등유, 진공, 산소 라인을 위한 튜빙이 증기기, 유도실, 그리고 입체 정관 프레임의 노즈 콘에 단단히 연결되어 있는지 확인하세요.
2. jRCaMP1b, GCaMP6f, GRAB-DA1m 아데노 관련 바이러스를 확보하세요.
   주의: 바이러스를 다룰 때는 항상 개인 보호 장비를 착용하세요.
   1. 필요하다면 바이러스를 1x10¹³ 에서 4x10¹³ ppit/mlip리터 사이의 작동 농도로 희석하세요.
   2. jRCaMP1b와 GCaMP6f 아데노 관련 바이러스를 1:1로 혼합하여 준비합니다.
   3. 1:1 jRCaMP1b:GcaMP6f 바이러스 혼합물과 GRAB-DA1m 바이러스 한 조각을 얼음에 올려 4°C의 온도를 유지합니다.
3. 마취를 유도하세요.
   1. 마우스를 유도실에 넣고 챔버 문을 닫으세요. 분당 1리터로 산소를 증발기에 공급하기 시작하세요.
   2. 가스 흐름을 유도실로 유도하고 진공 라인을 켜서 챔버 내 과잉 가스를 제거합니다. 베이퍼라이저를 3%에서 5% 사이의 이소플루란 농도로 설정하세요.
4. 마우스를 입체 프레임으로 옮깁니다.
   1. 마우스의 호흡이 1 호흡/초로 느리게 되면, 마우스를 입체 정위 프레임 위로 이동시킵니다. 마우스의 앞 앞니를 코 콘 마우스피스의 슬롯에 걸고 코 콘을 쥐 코 위에 조이세요.
   2. 마취를 유지하기 위해 이소플루란 농도를 1%–2%로 설정한 입체 정관 프레임으로 가스 흐름을 전환합니다. 진공 라인을 전환해서 노즈 콘에서 가스를 제거하세요.
      참고: 수술 중 생쥐의 호흡을 모니터링하고, 심마취를 유지하기 위해 필요에 따라 이소플루란 농도를 조절하여 호흡 속도가 1/s로 유지되도록 하세요. 심부 마취는 수술 중 주기적으로 확인하여 쥐가 발가락 꼬집기에 반응하지 않도록 해야 합니다.
   3. 난방 시스템을 체온을 35°C로 유지하도록 설정하고, 쥐의 눈이 건조해지는 것을 막기 위해 시각 연고를 발라주세요.
   4. 입체 정위 귀 봉을 삽입하여 두개골 양쪽, 즉 귀관보다 약간 뒤쪽과 앞쪽에 밀어붙이게 하세요. 귀걸이를 조이고, 쥐 머리 꼭대기에 부드럽게 압력을 가해 두개골이 고정되도록 하세요.
5. 절개 준비를 하세요.
   1. 쥐 머리 위의 털을 짧게 다듬거나 밀어주세요. 제모 젤을 쥐 머리 위에 바른 후 약 1분간 두세요. 깨끗한 면봉으로 남은 젤을 제거하세요.
   2. 필요에 따라 2.5.1을 반복하여 머리 위의 모든 털이 제거됩니다.
   3. 머리 위 피부를 면봉으로 베타딘(10% 포비돈-아이오드 용액)을 바르고 70% 에탄올 용액을 발라서 소독하세요.
6. 두개골을 노출시켜.
   1. 두개골 중앙선을 따라 람다 뒤쪽에서 앞쪽 비정맥 앞쪽까지 절개를 한다.
      참고: rhostral 비정맥은 후각과 전전두엽 피질 사이의 뇌 등쪽 표면에 위치한 혈관입니다.
   2. 절개 부위 주변의 깎은 피부를 잘라내어 눈물방울 모양의 절개를 만들어 두정골, 두정내골의 앞쪽 끝, 그리고 앞쪽 비강정맥 앞쪽 부분을 노출시킵니다(그림 2H).
   3. 0.9% 식염수와 깨끗한 면봉으로 두개골 표면을 부드럽게 닦으세요.
7. 해골을 평평하게 만든다.
   1. 앞쪽 비정맥이 시상봉합선과 만나는 지점을 찾아보세요. 이 지점을 멸균 메스 칼날로 표시하세요.
   2. 입체 정위 드릴에 #92 카바이드 드릴 비트를 삽입하고 드릴을 입체 정위 프레임에 장착하세요. 입체 정위 조작기를 사용해 드릴 끝을 두개골 표면에 표시된 지점에 위치시키고, 드릴의 X, Y, Z 좌표를 0으로 맞추세요.
   3. 표시된 지점과 그 뒤쪽 -8.25mm 지점에서 Z 깊이를 측정하여 두개골의 피치를 평평하게 조정합니다. 표시된 지점과 위치 -8.25 후방 사이의 측면 거리를 측정하여 두개골의 요를 수평화합니다. 수평 롤은 표시된 지점에 대해 중앙선에서 -2.0, -4.5, -7.0 mm 위치에서 Z 깊이를 측정하여 측정±합니다.
8. 개골 절개술과 경화 수술을 수행하세요.
   1. 드릴 비트를 #76 또는 #78 카바이드 드릴 비트로 교체하세요. 시상실, 늑방 비정맥, 두개골 표면이 만나는 지점에 드릴을 제로로 맞추세요.
   2. 드릴을 각 뇌 영역의 A/P 및 M/L 좌표로 이동시킵니다(표 1). 각 부위마다 두개골 절개술을 뚫고, 27G 이하의 빈 주사기 끝을 사용해 경막을 조심스럽게 제거하세요.
9. 바이러스를 주사하세요.
   1. 유리 마이크로피펫을 뽑아 팁이 최소 7mm 동안 점점 가늘어지고, 팁 개구부는 10–30 μm로 만듭니다.
      참고: 이후 단계들 중 어느 하나 후에 마이크로피펫에 공기 방울이 있으면 2.9.2–2.9.12 단계를 다시 시작하세요.
   2. 빈 유리 마이크로피펫 팁에 미네랄 오일을 다시 채우세요. 마이크로피펫 팁을 나노리터 인젝터에 삽입하고 고정하세요. 나노리터 인젝터 인터페이스를 사용해 마이크로피펫에서 가능한 한 많은 미네랄 오일을 배출하세요.
   3. 나노리터 인젝터를 입체 진압 프레임에 장착하세요. 작은 파라핀 왁스 시트 조각을 잘라서 쥐 머리 위에 올려놓으세요.
   4. jRCaMP1b:GCaMP6f 바이러스 혼합물 1 μL 피펫을 파라핀 왁스에 부릅니다. 나노리터 인젝터의 끝을 낮춰 유리 마이크로피펫 팁이 바이러스 혼합물에 들어가도록 하고, 인젝터의 인터페이스를 이용해 마이크로피펫에 바이러스를 다시 채웁니다.
   5. 2.9.4를 반복하여 사용할 모든 바이러스가 나노리터 인젝터로 옮겨질 때까지 반복합니다(표 1). 파라핀 왁스는 제거하여 생물학적 위험 폐기물 용기에 버리세요.
   6. 시상실, 두개골 정맥, 두개골 표면이 만나는 지점에 표시된 위치에 주입기 마이크로피펫 팁을 제로로 맞추세요.
   7. 가장 배쪽에서 가장 배쪽에서 가장 배쪽으로 가까운 주사 부위(표 1)부터 시작하여 마이크로피펫 팁을 각 부위로 옮기고, 뇌 표면에 닿도록 내리고, 입체정관 프레임의 Z 위치를 0으로 맞추세요.
   8. 각 부위에서 마이크로피펫 팁을 뇌 안으로 낮춰 주입 부위에 대해 복측 0.1mm가 되도록 합니다. 그 후 마이크로피펫 팁을 최종 주입 부위로 0.1mm 올립니다. 주변 조직이 마이크로피펫 끝 주변에 30초간 가라앉도록 두세요.
   9. 나노리터 인젝터 인터페이스를 사용해 1:1 jRCaMP1b:GcaMP6f 바이러스 혼합물을 1–2 nL/s 속도로 주입하여 현재 주입 부위에 혼합물을 분산시킵니다.
   10. 주입 완료 후 최소 5분간 마이크로피펫 팁을 주입 부위에 머물게 하세요. 바이러스가 주사 경로를 따라 배쪽으로 퍼지는 위험을 줄이기 위해 마이크로피펫 팁을 천천히 뇌에서 들어 올려 보세요.
   11. 각 부위에 1:1 jRCaMP1b:GcaMP6f 바이러스 혼합물을 주입한 후, 나노리터 주입 인터페이스로 나노리터 주입기의 플런저를 원래 위치로 되돌립니다. 마이크로피펫을 제거하여 생물학적 위험 용기에 폐기하세요.
   12. 필요 시 GRAB-DA1m 발현을 표적으로 하는 각 뇌 영역에 대해 2.9.2–2.9.11 단계를 반복합니다. 각 표적 부위에는 바이러스 혼합물에 사용된 300 nL 대신 150 nL을 주입하세요.
10. 멀티파이버 어레이 이식.
    1. 멀티파이버 배열을 입체 고정 프레임에 고정하여 이식 시 안정적으로 유지할 수 있는 다웰 핀으로 고정하세요(그림 2I).
    2. 다섬유 배열의 위치를 조정하여 각 섬유가 해당 두개골 절개 중심과 뇌 표면에 위치한 가장 긴 섬유와 정렬되도록 합니다. 이 위치에서 입체 조작기를 0으로 전환하고, 멀티파이버 배열을 천천히 낮춰 가장 깊은 바이러스 주입의 D/V 위치보다 0.25mm 위까지 올립니다(표1, 그림 2J).
    3. 차가운 혼합 접시를 얼음 위에 올려놓고 시멘트 가루 1스쿱, 액체 염기 4방울, 촉매 1방울을 넣으세요. 20초 동안 섞어.
       참고: 액체 시멘트를 사용할 때 더 많은 시멘트가 필요할 때마다 이 단계를 반복하세요.
    4. 주사기와 23–31G 바늘을 사용해 다섬유 배열과 두개골 사이 공간에 액체 시멘트를 옮깁니다.
    5. 얇은 플라스틱 어플리케이터나 주사기 바늘을 사용해 다중 섬유 배열의 네 면을 완전히 덮어 두개골에서 피라미드 모양을 형성합니다(그림 2K). 시멘트를 최소 15분 정도 말리세요.
    6. 절개 부위를 따라 피부를 봉합해 두개골이 노출되지 않도록 하세요.
11. 마우스가 회복할 시간을 주세요.
    1. 이소플루란 농도를 0으로 낮추세요.
    2. 마우스를 입체 고정 프레임에서 온열 패드로 옮기고, 마우스가 깨어 있고 움직일 수 있을 때까지 기다렸다가 다시 케이지로 옮깁니다.
    3. 실험을 시작하기 전에 최소 2주간 쥐가 회복할 시간을 주세요.

3. 다중 부위 2색 칼슘 영상 (그림 1C)

1. 데이터 수집 장치(DAQ)를 구성하세요.
   1. GND를 전선을 사용해 Ch7 포트 위의 AGND 포트에 연결하세요.
   2. DIO0를 전선으로 Ch0 포트에 연결하세요.
2. 광도 측정 시스템을 DAQ에 연결하세요.
   1. 스플릿 BNC 케이블(한쪽 끝에 BNC 커넥터, 다른 쪽 끝에 빨간색과 검은색 전선)의 베이비 닐 콘스턴트(BNC) 커넥터 끝을 광도 측정 시스템의 입력 포트에 연결하세요. 또 다른 분할 BNC 케이블의 BNC 커넥터 끝을 광도 측정 시스템의 출력 포트에 연결하세요.
   2. 광도 측정 시스템의 입력 포트에 연결된 분할 BNC 케이블을 빨간 선 끝을 DAQ의 DIO1 포트에 연결하세요. 광도 측정 시스템의 출력 포트에 연결된 분할 BNC 케이블을 빨간 선 끝을 DAQ의 Ch1 포트에 연결하세요.
   3. 두 개의 분할 BNC 케이블에서 검은색 접지선을 DAQ GND 포트에 연결하세요.
3. 거동과 광도 측정 카메라를 동기화하세요.
   1. 여러 개의 행동 카메라를 데이지 체인으로 연결해 여러 각도에서 동시에 행동을 기록합니다.
      1. 1차 카메라의 광학 절연 출력(핀 4, 흰색 선)을 2차 카메라의 비절연 입력(핀 1, 녹색선)에 3.3 KΩ 저항으로 연결합니다. 주 카메라의 3.3V 출력(핀 3, 빨간 선)을 같은 3.3 KΩ 저항기와 DAQ의 Ch2에 연결하세요.
      2. 각 보조 카메라의 광절연 출력을 3.3 KΩ 저항을 사용해 3.3V 출력에 연결합니다.
      3. 주 카메라의 접지(핀 6, 갈색 선)를 각 보조 카메라의 접지에 연결하세요. 모든 카메라 접지선을 CH2 포트 위의 DAQ AGND 포트와 광도 측정 시스템의 출력 접지에 연결하세요.
4. 관련 영상 소프트웨어를 사용해 행동 카메라 설정을 설정하세요.
   1. "획득 프레임 속도"를 45Hz로, 게인을 1로 설정하세요.
   2. 노출 시간을 2998 μs, 하한은 100 μs, 상한은 150,000 μs로 설정합니다.
      참고: "획득 프레임 속도"는 실제 캡처되는 프레임 속도가 아닐 수 있습니다. 노출 시간과 요청된 데이터 대역폭에 따라 이 값은 최종 영상 주파수보다 높게 설정해야 할 수도 있습니다. 필요하다면 "획득 프레임 속도"를 조정하여 표시되는 "결과 프레임 속도"가 40 Hz가 되도록 합니다.
5. DAQ 소프트웨어 구성(보충 파일 7).
   1. DAQ 소프트웨어에서 DAQ를 '장치'로 추가하고 '구성 패널'로 전환합니다.
   2. '채널' 탭의 '아날로그 입력' 아래에서 채널 0–2를 활성화하세요. '디지털' 아래에서 채널 0을 활성화하세요.
      참고: Ch0는 트랜지터-트랜지터 논리(TTL) 신호, Ch1은 광도 측정 시스템, Ch2는 데이지 체인 카메라에 해당합니다.
   3. '아날로그 입력' 항목에 채널 0을 "TTL", 채널 1을 "Photometry_system", 채널 2를 "Behavior_cameras"로 지정하는데, 이는 "트랜지터-트랜지스터 로직"을 의미합니다. '디지털' 항목에 채널 0을 "TTL_trigger"로 지정하세요.
   4. '트리거' 탭에서 트리거를 수동으로 설정하세요. '샘플 레이트' 탭에서 샘플 레이트를 350 Hz로 설정하세요.
   5. '디스플레이 패널'로 전환해서 '스트립', '스칼라', '출력' 창을 그래픽 사용자 인터페이스에 넣으세요.
6. 광도 측정 시스템 소프트웨어 구성 (보충 파일 8).
   1. 시각 코딩 소프트웨어에서 5V TTL 펄스를 수신하여 녹화를 트리거하고, 각 프레임의 타임스탬프, 각 광섬유의 빨간색 및 녹색 채널의 형광 방출, 그리고 광도 측정 시스템 매뉴얼에 명시된 원본 비디오를 저장하는 워크플로우를 개발하세요.
   2. 워크플로우에서 광도 측정 시스템 노드를 사용하면, 시스템이 120Hz에서 560, 470, 415nm LED의 프레임을 교대로 녹화하도록 설정되어 기능적으로 40Hz의 프레임레이트를 달성하도록 설정해야 합니다.
      참고: 이 시분할 다중화(TDM) 접근법은 GCaMP와 RCaMP의 여기를 시간적으로 분리하여 각 지표가 연속된 프레임에서 독립적으로 여기되도록 하여 스펙트럼 중복을 해결합니다. 여기서 사용되는 기록 시스템은 최적화된 밴드패스 방출 필터(녹색 채널: 500–530 nm; 빨강 채널: >580 nm 롱패스)를 사용하여 각 지시기에서 주로 방출되는 파장으로 검출된 광자를 제한하여 스펙트럼 크로스토킹을 더욱 최소화합니다. 415 nm 이소스틱 파장은 GCaMP와 RCaMP를 동등하게 여기시키지만, 칼슘 의존적 형광 변화를 최소화하여 모션 아티팩트 제어 신호를 제공합니다. TDM 여기와 스펙트럼 필터링은 470 nm 프레임이 주로 GCaMP 활성을 포착하고(그림 3A), 560 nm 프레임이 주로 RCaMP 활동을 포착하며(그림 3B), 415 nm 프레임이 모션 보정을 위한 칼슘 독립적 참조 신호를 제공합니다.
7. 생체 내 광도 측정 기록을 수행하세요.
   1. 2단계에서 설명한 대로 바이러스 주입과 다중 섬유 배열 이식을 받은 마우스를 확보하세요.
   2. 패치코드와 이식된 멀티파이버 배열의 연결 표면을 에탄올과 면봉으로 청소하세요. 시각적 코딩 워크플로우의 광도 측정 시스템 노드와 광도계를 사용해 415, 470, 560 LED 전력 레벨 각각을 패치코드에서 약 1.2 mW의 조명을 출력하도록 설정했습니다.
   3. 패치코드의 연결 면에 인덱스 매칭 젤을 바르세요. 패치코드를 마우스의 이식된 멀티파이버 배열에 정렬하고, 배열의 막대 핀으로 고정한 후, 패치코드를 이식된 멀티파이버 배열 표면과 평평하게 밀어 내려가세요.
   4. 멀티파이버 배열을 패치코드에 고정하기 위해 패치코드 나사를 조이세요. 실험을 시작하기 전에 쥐가 익숙해지도록 기다려 두세요(그림 2L–M).
   5. 파일 이름을 설정하세요.
      1. 각 행동 카메라에 대해 빨간 원 '녹화' 버튼을 눌러 행동 카메라 녹화 소프트웨어에서 녹화 창을 열고 파일 이름을 지정하세요.
      2. DAQ 소프트웨어를 열고 기어 버튼을 클릭한 후 '로깅 옵션'으로 이동한 후 파일명을 지정하세요.
      3. 포토메트리 시스템 시각 코딩 워크플로우의 'PhotometryWriter' 노드를 클릭하여 파일명을 지정하세요.
   6. 행동 카메라 녹화 창에서 각 카메라별로 '녹화 시작'을 클릭하세요. 다음으로, 광도 측정 시스템의 시각 코딩 워크플로우에서 재생 버튼을 누르고 DAQ 소프트웨어에서 녹화를 누르세요.
   7. TTL 스위치를 클릭하면 모든 카메라에서 동기화 녹화를 시작하세요.
   8. 녹화 종료.
      1. 동기식 카메라 녹화를 종료하려면 TTL 스위치를 클릭하세요
      2. 광도 측정 시스템의 시각적 코딩 워크플로우에서 중지 버튼을 누르고, 행동 카메라 소프트웨어 녹화 창에서 "녹화 중지"를 누르세요.
   9. 실험이 끝날 때까지 3.7.5–3.7.8 단계를 반복한 후 마우스를 분리합니다.
      참고: 다음 실험, 광도 측정 및 행동 카메라 데이터 스트림은 DAQ 소프트웨어의 출력을 이용해 맞춤형 코드와 정렬할 수 있습니다. 구체적으로, (1) TTL 전압 변화는 TTL 시작 및 오프셋 시간을 나타내고, (2) 카메라 동작 전압 변화는 각 동작 영상 프레임을 캡처하기 위해 셔터가 열리고 닫히는 시점을 나타내며, (3) DAQ에 기록된 초기 광도 측정 시스템 전압 변화를 TTL 시작 시간과 비교하여 시각 코딩 소프트웨어가 출력한 광도 측정 카메라 타임스탬프를 결정할 수 있습니다.

4. 데이터 처리 (그림 1D, 보충 파일 9)

1. 칼슘 영상 데이터를 전처리하세요.
   1. 칼슘 영상 데이터의 분리 프레임을 분리하여 415 nm, 470 nm, 560 nm LED에 반응하는 별도의 신호 흐름을 생성합니다.
   2. 기본 드리프트를 보정하기 위해 적응형 반복 재가중치 페널라이드 최소제곱법(airPLS)⁴⁴ 를 사용하세요.
   3. ΔF/F를 다음을 사용하여 계산합니다:
      
      참고: 기준 기간은 실험적 조작 이전의 안정적인 시기(예: 사회적 파트너를 도입하기 전)여야 합니다. 기준선 주기가 너무 짧거나(<2–3분) 또는 움직임 아티팩트로 오염될 수 있는 큰 변동이 있다면, 제한된 기준선 주기 대신 전체 세션의 평균 형광을 사용해 정규화하는 것을 고려하세요.
2. 모션 아티팩트에 대한 보정(그림 4A).
   1. 회귀 기반 접근법을 사용하되, 대안적인 방법도 적합하다( 표 2 참조)
   2. 중앙값을 이용한 Z-스코어 ΔF/F 신호는 영역 간 신호 크기를 정규화하는 방식입니다:
      
   3. L1 정규화를 적용한 라쏘 회귀를 적용하세요. Lasso(최소 절대 수축 및 선택 연산자)는 정보 없는 예측 인자의 계수를 0으로 축소하여 자동 특징 선택을 수행합니다.
      1. 정규화 매개변수(α = 0.0001, 0.001, 0.01, 0.1, 1, 10, 100)에서 격자 탐색을 수행합니다. 그리드 탐색은 모델 복잡성과 과적합 사이의 최적 균형을 식별합니다. 이 단계는 표준 머신러닝 라이브러리(예: 파이썬의 scikit-learn)에서 제공하는 교차 검증 루틴을 사용하여 완전 자동화할 수 있습니다.
      2. 이중 색상 광도 측정(권장 접근법)의 경우, 12개 기록 영역 전반에 걸쳐 모든 415nm 등질성 제어 채널을 예측 변수로 사용하세요( 참고 4B–C 및 결과 참조). 단색 광도측정(GCaMP 전용, RCaMP 전용)의 경우, 예측 행렬을 보정 대상 칼슘 신호와 동일한 섬유의 등질적 신호만으로 제한하세요.
      3. 예측 신호와 관측 신호 간의 평균 제곱 오차를 최소화하는 모델을 선택하세요.
   4. 신호에서 예측된 운동 성분을 빼면 보정된 활성도를 얻을 수 있습니다.
3. 725ms 윈도우를 가진 Savitzky-Golay 필터를 사용해 신호를 부드럽게 만듭니다.

결과

최대 12개의 SBN 뇌 영역을 동시에 기록하기 위해, 위 프로토콜에 따라 맞춤형 멀티파이버 배열을 구축했습니다. 수술 후 회복 후, 쥐들은 사회적 상호작용 중에 기록되었습니다(그림 5). 모든 실험에서 CD1 대상 수컷 쥐는 집 케이지에서 수컷 Balb/c 마우스와 상호작용할 수 있도록 허용되었습니다. 우리는 Vgat-Cre 마우스를 사용해 11개의 SBN 뇌 영역에서 GABA성 신경세포에서 Cre 의존적으로 jRCaMP1b⁴⁰을 발현시켰고, 비GABA성^{세포에서는 동일한} 뇌 영역에서 Cre-배제 방식으로⁴⁵개를 발현했으며, GRAB-DA1m³³은 핵^{측근 42}에서 발현하였습니다(표 1). 섬유 표적화의 조직학적 확인은 이전 논문들^42,43에서 확인할 수 있습니다. 여기서는 모션 아티팩트 보정을 위한 다양한 방법들의 성능을 테스트하고자 했습니다. 구체적으로, 우리는 다음 방법을 비교했습니다: (1) 중앙값 필터 단독; (2) 동일 섬유 등질성 신호만을 이용한 L1 정규화 라쏘 회귀(단일 예측자 접근법)¹¹ 및 (3) 모든 섬유의 등질성 신호를 예측자로 사용하는 라쏘 회귀(다중 예측기 접근법)^41,42 (그림 4A). 중요한 점은, 라쏘 기반 방법은 등순 주파수(415 nm) LED에 반응하여 생성된 활성 무관형 형광 신호를 사용해 원시 신호를 보정하는 반면, 중앙 필터 평활수는 활도에 의존하지 않는 신호를 고려하지 않는다는 점입니다.

우리는 절대 고주파 잡음과 지터라는 두 가지 다른 측정 방법으로 모션 보정을 평가했습니다. 고주파 잡음은 신호의 1차 미분의 표준편차로 정의되었으며, 이는 급격한 신호 변동의 크기를 반영합니다. 지터는 신호의 미분의 변동 계수로 정의되었으며, 이는 신호 미분의 평균에 대한 프레임 간 신호 변동성의 크기를 반영합니다. 우리는 두 가지 Lasso 기반 접근법(단일 예측기 및 다중 예측기)이 고주파 잡음과 지터 감소 측면에서 중앙값 필터보다 훨씬 우수한 성능을 보였으며, 다중 예측기 보정이 단일 예측기 보정보다 약간 더 우수한 성과를 보였음을 발견했습니다(그림 4C–D; 고주파 잡음, 18회 녹음 세션에서 23개 신호에 대해 n=414: Kruskal-Wallis 테스트, H = 501.9420, p < 0.001; 사후 Mann-Whitney U 판정 본페로니 보정: 평활화 vs 단일 사이트 회귀 ***p < 0.001, 부드화 대 다사이트 회귀***p < 0.001, 단일 사이트 대 다중 사이트 **p = 0.0073; 지터: 크루스칼-월리스 테스트, H = 495.6685, p < 0.001; 사후 Mann-Whitney U 판정 보정: 부활화 대 단일 사이트 회귀 ***p < 0.001, 부드화 대 다부지 회귀***p < 0.001, 단일 사이트 대 다중 사이트 ***p = 0.0006). 구체적으로, 다중 예측자 접근법(모든 섬유 등질성 사용)은 적색 채널(RCaMP) 신호에 대해 이점을 보였다: 12개 적색 신호 중 5개가 단일 예측자 보정(n=18개 기록/영역)에 비해 잔여 잡음이 유의미하게 낮았다. 지터의 경우, BNST(t-검정, t = 5.42, ***p < 0.001), POA(t-검정, t = 2.68, *p = 0.011), AH(t-검정, t = 2.66, *p = 0.012), PAG(Mann-Whitney U 검정, U = 279, ***p < 0.001)에서 다중 예측 변수 우위성을 보였다. 고주파 잡음에 대해 BNST(Mann-Whitney U 검정, U = 285, ***p < 0.001), POA(Mann-Whitney U 검정, U = 292, ***p < 0.001), AH(t-검정, t = 7.10, ***p < 0.001), PAG(t-검정, t = 13.72, ***p < 0.001), LHb(t-검정, t = 5.47, ***p < 0.001)에서 다중 예측 변수 우위성을 보였다. 그린 채널(GCaMP) 신호는 지터 또는 고주파 잡음 지표 모두에서 12개 영역 모두에서 두 Lasso 접근법 간에 유의미한 차이가 없었습니다(모두 p>0.05, 통계 검정 전체 목록은 표 3 참조). 이는 이중 색상 광도측정에서 교차 채널 등질성 정보를 포함하면 빨간 신호의 모션 보정이 개선된다는 것을 시사하는데, 이는 녹색 채널 등석이 더 깨끗한 움직임 정보를 제공하기 때문일 가능성이 큽니다. 이 데이터는 이소스틱 기반 회귀 방법을 이용한 모션 아티팩트 보정이 단순 필터링 기법보다 훨씬 우수하며, 다중 채널 회귀가 듀얼 컬러 녹화에 구체적인 이점을 제공함을 보여줍니다.

그림 1. 소셜 행동 네트워크에서 다중 사이트 2색 광도 측정을 이용한 기록. (A) 다중 섬유 배열 구축 방법의 회로도 표현. (B) 수술 워크플로우의 회로식 표현. (C) 2색 칼슘 영상 실험의 도식적 표현. (D) 등질 신호를 사용해 모션 보정 신호를 계산하는 예시. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 2. 제작 및 수술을 위한 주요 절차 이미지. (A) 녹음에 사용할 준비가 된 제작된 패치코드. (B) 0.25mm x 5.5mm 드릴 비트가 섬유 관통 구멍 위에 위치한 맞춤형 입체 고정 홀더에 멀티파이버 배열을 설치합니다. (C) 모든 광섬유 관통 구멍을 제거하고 육각 너트를 접착한 다중 광섬유 배열. (D) 섬유 스크라이브를 이용해 섬유를 절단합니다. (E) 모든 섬유를 슈퍼글루로 붙여 맞춤형 광택 퍽에 부착한 멀티파이버 배열. (F) 멀티파이버 배열에 패치코드 커넥터를 정렬하고 나사로 고정하는 확대 뷰. (G) 완전 제작된 멀티파이버 배열, 도웰 핀이 접착된 상태. (H) 두피 절개를 하여 두개골을 노출시키는 입체 고정 프레임에 부착된 쥐. (I) 수술 중 다중 섬유 배열을 조작하기 위해 입체정위 조작기에 부착된 제작된 다섬유 배열. (J) 뇌 안으로 내려가는 다중 섬유 배열의 확대 뷰. (K) 다섬유 배열을 완전히 내려 두개골에 치과 시멘트로 부착. (L) 녹음 전에 패치코드에 단단히 연결된 동물의 멀티파이버 배열. (M) 녹화 전후 또는 녹화 중에 패치코드를 연결된 우리 안에 있는 동물의 줌아웃 뷰. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 3. 스펙트럼 분리. 칼슘 지시자 간 최소한의 스펙트럼 교차 토킹을 보여주는 예시 트레이스. GCaMP6f(파란색) 신호는 470nm 여기 시 강한 활성화를 보이지만, 560nm 여기에서는 무시할 정도로 반응이 없습니다. jRCaMP1b(적색) 신호는 560 nm에서 강한 활성화를 보이지만 470 nm 조명에는 거의 반응하지 않는 역패턴을 보입니다. (A) GCaMP6f와 jRCaMP1b 신호를 470nm 조명만으로 동시에 기록함. (B) (a)와 동일하지만 560 nm 조명만 사용합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 4. 다중 섬유 신호 처리를 위한 다양한 방법 비교. (A) 광도 측정 신호의 다중 지점 회귀 보정을 나타내는 개식도. 이 접근법은 모든 415nm 등질성 신호를 각 칼슘 의존 신호에 선형적으로 매핑하는 순차적 처리 단계를 포함합니다. 예측된 운동 성분을 이 신호에서 빼면 최종 활동 판독값이 산출됩니다. 두 신호에서 강한 움직임 아티팩트가 존재하는 z-점수 ΔF/F 신호. (B) 위에서 아래로: 동일한 섬유/영상 채널에서 동작 아티팩트를 묘사하는 등질적 신호, 부활화된 RCaMP(왼쪽) 또는 GCaMP(오른쪽) 신호(중앙값 필터링, 녹색), 동일한 섬유/영상 채널 회귀 보정 신호(청록색), 다중 섬유 회귀 보정 신호(파란색). (C) 왼쪽: 각 녹음된 신호에 대한 평균 고주파 잡음 점수(n = 21회 세션). 고주파 잡음은 각 신호의 1차 미분의 표준편차로 계산됩니다. 노이즈 점수는 1) 기준선 보정 및 보정되지 않은 신호(회색), 2) 기준선 보정 및 중앙값 필터링 신호(분홍색), 3) 사비츠키-골레이 평법을 사용한 기준선 및 단일 섬유 회귀 보정 신호(청록색), 4) 사비츠키-골레이 평활화를 사용한 기준선 및 다중 섬유 회귀 보정 신호(파란색)에 대해 표시됩니다. 센터: 평활화, 단일 섬유 또는 다중 섬유 회귀만을 사용하여 제거된 노이즈 평균 비율을 23개 신호 모두에 걸쳐 집계한 값입니다. 제거된 잡음의 비율은 보정으로 인한 고주파 잡음의 비율과 원시 기준선 보정 신호의 전체 잡음 수준에 대한 비율로 계산됩니다. 데이터는 SEM 평균± 보고됩니다(Kruskal-Wallis 검정, H = 501.9420, p < 0.001; 사후 Mann-Whitney U 검정과 Bonferroni 보정: 평탄화 대 단일 부전 회귀 ***p <0.001, 평활화 대 다중 부전 회귀***p < 0.001, 단일 부지 대 다부지 **p = 0.0073). 오른쪽: 신호 유형별로 구분된 단일 섬유 회귀 보정 후 고주파 잡음이 통계적으로 차이가 나는 신호의 비율. 23개 신호 각각에 대해 단일 사이트 보정 후 잡음 수준을 독립 t-검정(정규분포 시) 또는 Mann-Whitney U 검정(비모수 대안)을 사용하여 다중 부위 보정 후 잡음 수준을 비교하였습니다. 파란색 구간은 다중 사이트 보정이 단일 사이트 보정보다 현저히 낮은 잡음을 낸 신호를 나타냅니다(p < 0.05). 회색 구간은 보정 방법 간에 유의미한 차이가 없는 신호를 나타냅니다. 청록색 구간은 단일 지점 보정으로 인해 현저히 낮은 잡음이 발생한 신호를 나타냅니다. E: Vgat- GCaMP6f. DA: 잡아. I: Vgat+ jRCaMP1b. (D) (C)와 동일하지만 프레임 간 변동성(지터)을 나타내며, 각 신호의 변동 계수의 미분으로 계산됩니다 (Kruskal-Wallis 검정, H = 495.6685, p < 0.001; 사후 Mann-Whitney U 검정 및 Bonferroni 보정: 평활화 대 단일 사이트 회귀 ***p < 0.001, 평법화 vs 다중 사이트 회귀***p < 0.001, 단일 사이트 대 다중 사이트 ***p = 0.0006). 통계적 검정 및 결과의 전체 목록 은 표 3을 참조하세요. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 5. 이중 색상 광도 측정의 다중 현장 전시. 사회적 행동 중 동시에 기록된 여러 지표 유형의 대표 신호(거주자-침입자 테스트, 침입자 진입 시기). 추적 결과는 동일 동물 내 사회 행동 네트워크 부위에서 정규화 및 기준선 감량되지 않은 GCaMP6f(Cre-음성 뉴런), jRCaMP1b(GABAgat-Cre+ 뉴런), GRAB-DA1m(핵 종위의 도파민 센서)을 보였으나 운동 아티팩트 보정은 하지 않았습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

표 1. 각 대상 사회행동 네트워크 뇌 영역별 바이러스 좌표와 섬유 길이. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

표 2. 다중 사이트 광도 측정을 위한 운동 아티팩트 보정 방법 비교. 다음 모션 아티팩트 보정 방법의 기본 원리, 최적의 사용 사례, 장단점: 단순 선형 회귀, L1 정규화가 포함된 라쏘 회귀(다중 예측자 접근법 사용), 베이지안 생성 모델링, 주파수 기반 스케일링, 반복 재가중 최소제곱법. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

표 3. 그림 4에 사용된 통계 검정의 세부 사항과 결과. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충 파일 1. 패치코드 커넥터용 3D 프린트 파일.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충 파일 2. 3D 통과 구멍이 없는 패치코드 커넥터용 인쇄 파일입니다.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

입체 정위 드릴링 액세서리3. 3D 인쇄 파일 보조 파일이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충 파일 4. 맞춤형 폴리싱 퍽 설계도.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충 파일 5. 3D 12개의 SBN 사이트를 대상으로 한 다중 사이트 광도 측정 배열의 인쇄 파일입니다.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충 파일 6. 3D 관통구멍 없이 사이트를 타겟팅하는 다중 사이트 광도 측정 배열용 인쇄 파일입니다.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충 파일 7. DAQ 소프트웨어용 DAQ 구성 파일.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충 파일 8. 광도 측정 시스템용 시각 코딩 파일입니다.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충 파일 9. 프로토콜 단계 4와 모션 아티팩트 보정에 사용되는 파이썬 코드. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

토론

섬유 광도측정은 자유롭게 움직이^{는 동물의} 심부 뇌 영역이나 특정 세포 유형에서 개체군 칼슘 활동을 기록하는 데 유용하고 비용 효율적인 기법입니다. 여러 뇌 영역에서 동시에 녹음하면 자연주의적 행동이나 머리 고정 준비 중 영역 간 역학이나 투영을 비교할 수^{있습니다. 5, 7, 12}. 여기서는 맞춤형 섬유 배열과 상업적으로 이용 가능한 카메라 시스템을 사용해 뇌의 피질하 '사회적 행동 네트워크' 전반에 걸쳐 최대 12개의 뇌 영역에서 두 가지 색상으로 기록하는 방법을 자세히 설명합니다. 아래에서는 이 방법 구현의 주요 단계, 잠재적 수정 및 문제 해결 전략, 그리고 기존 접근법에 비해 그 중요성과 한계에 대해 논의합니다.

프로토콜은 세 가지 주요 단계로 구성됩니다. 첫째, 멀티파이버 어레이와 패치코드 제작은 입체 좌표에 맞춤 3D 프린팅 부품을 뚫고, 이어서 광섬유 삽입, 연마, 품질 관리를 통해 ≥75%의 빛 투과 효율을 보장합니다. 정확한 드릴링 정렬(±0.03 mm 허용오차)과 철저한 연마가 매우 중요합니다. 일반적인 고장으로는 낮은 빛 투과 효율(<75%)과 광섬유 통과 구멍 막힘이 있습니다. 낮은 효율은 보통 절단 시 섬유 얼룩이나 부적절한 연마 때문에 발생합니다. 해결책으로는 삽입 전 밝은 영역 현미경에서 각 섬유 끝이 흠집이 없는지 확인하는 것(단계 1.1.6.2), 완전한 입자 진행(6 μm → 0.01 μm, 단계 1.1.6.1)을 사용한 재연마, 그리고 섬유 절단기 칼날의 날카로움 확인 등이 포함됩니다. 처리량을 높이기 위해 실험실은 정밀 변환 단계를 이용한 맞춤형 섬유 절단 지그나 레이저 기반 절단 시스템(단계 1.2.4)과 같은 워크플로우 수정을 구현할 수 있습니다. 고정밀 시스템을 갖춘 상업용 3D 프린팅 제조업체는 수동 드릴링 필요성을 줄일 수 있습니다(1.1.3–1.1.4, 1.2.3 단계), 다만 배치마다 치수 정확도는 다를 수 있습니다.

둘째, 외과적 이식은 두개골 평탄화(±0.03 mm 허용), 11–12개 부위에 바이러스 주입, 다중 섬유 배열 이식 후 시멘트 고정을 포함합니다. 스컬 레벨링이 허용 범위를 초과하면 조준 정확도가 저하됩니다. 이는 8.25mm 간격으로 여러 전후면 지점에서 피치를 측정하고, ±2.0–2.5mm 측면 위치에서 롤을 측정하면서 귀 막대가 두개골을 완전히 안정시키도록 함으로써 완화할 수 있습니다. 바이러스 주입 마이크로피펫 내 공기 방울은 정확한 전달을 방해하여 마이크로피펫 준비를 재시작해야 합니다(2.9단계). 다중 섬유 배열 이식 시에는 두개골 표면에서 위쪽으로 시멘트 피라미드를 만들어 섬유 끝과 시멘트 접촉을 피하고(2.10.3–2.10.5단계), 충분한 건조 시간을 확보하세요(≥15분).

셋째, 녹화 및 데이터 처리는 DAQ 시스템을 통한 카메라 동기화, LED 전력 보정(0.1 mW 출력/광섬유, 1.2 mW 출력/12광섬유 패치코드), 그리고 등질적 제어를 통한 신호 전처리를 포함합니다. 여기서 소개된 모션 보정 파이프라인은 Lasso 회귀를 사용하는데, 이는 다중 채널 예측기 구성에 적합한데, 이는 정보 없는 예측 변수를 자동으로 0으로 축소시키고, 인공물 수정에 의미 있는 기여를 하는 변수만 유지하기 때문입니다. 이 특성은 특히 이중 색상 광도계에 유리합니다: 빨강과 초록 채널 모두의 등질적 신호를 예측자로 포함함으로써, Lasso는 실제 움직임 정보를 담고 있는 채널을 선택적으로 활용하여, 동일 섬유 보정 단독 보정에 비해 빨강 채널(RCaMP) 신호에서 현저히 더 나은 노이즈 감소를 제공합니다(그림 4C–D). Lasso는 가장 유익한 예측 변수를 자동으로 식별하기 때문에, 모든 이용 가능한 이소스베틱 채널을 입력으로 사용하는 것이 강력히 권장됩니다. 그렇긴 해도, 올가미 회귀는 여러 유효한 보정 방법 중 하나이며; 대안으로는 베이지안 생성 모델링⁴⁶, 빈도 기반 스케일링⁴⁷, 반복 재가중 최소제곱법(IRLS)⁴⁸이 있으며, 모두 유사한 인위팩트 감소를 제공할 가능성이 높으며, 구현 지침은 표 2에 제공됩니다. 최적화된 전처리에도 불구하고 지속적으로 낮은 신호 품질은 하드웨어나 외과적 문제를 시사하며, 1–2단계를 다시 검토해야 합니다

이러한 절차적 고려사항 외에도, 이중 색상 광도측정은 스펙트럼 분리와 관련된 추가적인 기술적 도전 과제를 도입합니다. 이중 색상 광도측정에서 중요한 고려사항은 녹색과 적색 칼슘 지표 간의 스펙트럼 겹침을 관리하는 것입니다. GCaMP와 RCaMP의 발광 스펙트럼이 겹쳐 스펙트럼 교차 스펙트럼을 완전히 제거하는 것은 어렵지만, 교차 LED 여기(GCaMP는 470nm, RCaMP는 560nm, RCaMP는 415nm 등석 방출)와 최적화된 밴드패스 방출 필터를 통한 시간적 다중화 접근법은 이 문제를 상당히 완화합니다. 실제로는 교차 대화가 최소화됩니다: 470 nm 자극은 빨간 채널에서 거의 활동이 나타나지 않고, 560 nm 자극은 녹색 채널에서 거의 활동이 나타나지 않습니다(그림 3). 잔류 스펙트럼 중복에 우려하는 연구자들은 특정 지시 조합에 따라 최대 스펙트럼 분리를 가진 좁은 대역통과 방출 필터를 선택하여 시스템을 더욱 최적화할 수 있습니다.

대규모 신경 기록을 위한 다른 접근법과 비교할 때, 맞춤형 2색 다중 사이트 광도 측정은 많은 중요한 장점을 제공합니다. 첫째, 단일 섬유 광도^{측정 1,2,3}, 현대 세포외 기록 ^4,6, 또는 피질 표면 영상 접근법 ^8,9는 단일 또는 공간적으로 제한된 뇌 영역(예: 피질 표면)에 제한되어 있지만, 여기서 공유하는 맞춤형 3D 프린트 설계는 200 μm 광섬유로 뇌 내 어디든 최대 12개의 뇌 영역을 표적화할 수 있게 합니다. 비교하자면, 상업적으로 구할 수 있는 멀티파이버 페룰 ^5,7은 100 μm 광섬유만 지원하며, 페룰의 선형 배열 바로 아래쪽에 위치한 제한된 뇌 영역에만 제한되어 있습니다. 특정 뇌 영역에서 표적화하고 기록하는 데 있어 주요 트레이드오프는 섬유 직경과 광도 측정 시스템의 시야 사이에 있습니다. 200 μm 광섬유가 장착된 3D 프린팅 멀티파이버 배열은 상업용 멀티파이버 페룰에 비해 각 사이트에서 더 넓은 면적을 기록합니다. 현재 프로토콜에서는 광도 측정 시스템의 카메라 시야각이 200 μm에서 12개의 광섬유로 기록할 수 있도록 제한합니다. 이 제약은 최대 60개의 광섬유에 대해 섬유 직경을 100 μm로 줄이거나, 더 큰 카메라 대물을 가진 맞춤형 광도 측정 시스템을 구축함으로써 극복할 수 있습니다.

마지막으로, 이 맞춤형 2색 다중 부위 광도 측정 플랫폼은 11-12개의 뇌 영역에 걸쳐 두 유전적으로 구분되는 신경 집단의 신경 활동 역학을 종단적으로 추적하는 데 사용되었습니다. Vgat-cre 마우스에서 SBN 집단 전반에 걸쳐 Cre 의존적 RCaMP와 Cre-배제형 GCaMP를 표현하는 Cre-in/Cre-excluding 전략을 사용하여, 공격적 경험과 관찰이 미래 방어적 사회적 상호작용 시 SBN 전체 활동 역학의 공유 패턴을 촉진하는 것으로 나타났^다. 동일한 바이러스 전략을 Esr1-cre 마우스에서 에스트로겐 수용체 알파 발현 및 비발현 뉴런에서 기록하면, 영역별 사회적 행동 패턴이 SBN 전체 사회 행동 코드의 빠르고 호르몬에 민감한 재스케일링과 연관되어 본토 내 행동 관련 활동을 증진시켰다⁴³. 이러한 영역별 행동과 네트워크 부호화 차이는 수컷 쥐에서 순환하는 테스토스테론을 필요로 합니다. 이 연구들은 바이러스 접근법과 단일 Cre 라인을 사용했으나, 향후 연구에서는 교차성 바이러스 접근법, 유전적으로 발현된 칼슘 지표, 또는 신경조절자 및 신경펩타이드 신호의 형광 보고체 등으로 이 방법을 확장할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
#76 드릴 비트	드릴 비트 시티	#76
#78 드릴 비트	드릴 비트 시티	#78
#92 드릴 비트	드릴 비트 시티	#92
0.01 & mu; M 그릿 폴리싱 시트	토르랩스	LFCF2
0.25mm x 5.5mm 드릴 비트	드릴 비트 시티	맞춤형 제품	0.25 x 5.5 mm 드릴 비트, 제작 업체에 연락
1 & mu; M 그릿 폴리싱 시트	토르랩스	LF1D
12 섬유 가지기 패치코드	도릭 렌즈	CustomBBP(12)_200/220/3000-0.37 _5m_SMA-12xCL_LAF
200 & mu; M 광섬유	토르랩스	FT200UMT
3 & mu; M 그릿 폴리싱 시트	토르랩스	LF3D
30 & mu; M 그릿 폴리싱 시트	토르랩스	LF30D
6 & mu; M 그릿 폴리싱 시트	토르랩스	LF6D
흡수성 봉합사	에티콘	J421H
적응형 반복 가중 재가중 벌점 최소제곱 문서	구글	해당 없음	https://code.google.com/archive/p/airpls/
합금강 도웰 핀	맥마스터-카	98381a983
행동 카메라	텔레다인 FLIR	블랙플라이 S
분재	분재 소프트웨어 재단	버전 2.9.0
브라이트필드 현미경	라이카	ES2
불독 클램프	파인사이언스툴스	18038-45
DAQ	측정 컴퓨팅	MC USB-200 시리즈 DAQ
DAQ 소프트웨어	측정 컴퓨팅	다카미
훈련	코프 악기	모델 1911 입체 탐색 드릴
섬유 도끼	토르랩스	XL411/CLVB
광섬유 광도 측정 시스템	신경광도 측정	FP3002
광섬유 광도 측정 시스템 매뉴얼	신경광도 측정	해당 없음	웹페이지 호스팅 장치 매뉴얼: https://neurophotometrics.com/documentation
파이버 스크라이브	토르랩스	S90C
섬유 스트리퍼	토르랩스	T10S13
미세 겸자	파인사이언스툴스	11252-00
가위 좋은 사람	파인사이언스툴스	14084-08
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G5 드라이버	열린 Ephys 생산 사이트	OEPS-7121
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그랩다	애드진	hSyn-GRAB_DA1m-WPRE-hGHpA
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메타본드 시멘트 시약 및 도구	파켈	S380
MicroFine ABS 유사 수지 3D 프린트	프로토랩스	맞춤형 제품	보충법 파일 1-3, 5, 6을 참조하세요
나노리터 인젝터	드럼몬드 사이언티픽 컴퍼니	나노젝트 II	나노리터 인젝터
파라핀 왁스 시트	암코어	파라필름 M 다목적 실험실 필름
피페터	서모피셔 사이언티픽	4641310N
광택 퍽	프린스턴 대학교 물리학과 기계 작업장	맞춤형 제품	보충 코드 파일 4 참조
파워미터	토르랩스	PM100D
푸랄루브 광학 연고	데크라	P1490-1
파이썬	파이썬 소프트웨어 재단	해당 없음
패치코드용 부드러운 플라스틱 튜브	맥마스터-카	3774N4
스핀뷰	텔레다인 FLIR	버전 1.25.0.52	행동 카메라를 제어하는 영상 소프트웨어
입체 정찰 프레임	코프 악기	모델 1900
TMAC 문서	해당 없음	해당 없음	TMAC 코드: https://github.com/Nondairy-Creamer/tmac
입체 진정 프레임용 튜빙	생고뱅	E-3603
베이퍼라이저	켄트 사이언티픽	벳플로 베이퍼라이저