녹조류 테트라스포라 Sp. CU2551에서 추출한 항균 단백질의 정제 및 식별

Tanaporn Klinsanit; Yothawut Tonawut; Natwikar Laokua; Rawirat Pansomsuay; Wanthanee Khetkorn; Cherdsak Maneeruttanarungroj

doi:10.3791/70066

이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

녹조류 테트라스포라 Sp. CU2551에서 추출한 항균 단백질의 정제 및 식별

329 조회수

⸱

DOI:

10.3791/70066

⸱

2026년 2월 17일

Tanaporn Klinsanit¹ , Yothawut Tonawut¹ , Natwikar Laokua¹ , Rawirat Pansomsuay¹ , Wanthanee Khetkorn² , Cherdsak Maneeruttanarungroj¹^,³

¹Department of Biology, School of Science, King Mongkut's Institute of Technology Ladkrabang, ²Division of Biology, Faculty of Science and Technology, Rajamangala University of Technology Thanyaburi, ³Bioenergy Research Unit, School of Science, King Mongkut's Institute of Technology Ladkrabang

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 단백질 추출 완충제 최적화, 조류 세포 파괴, 이온 교환 크로마토그래피에 의한 단백질 분획, SDS-PAGE에 의한 단백질 분리, 항균 활성 분석 등 다양한 기법을 사용하여 온전한 항균 단백질을 조사하는 워크플로우를 설명합니다. 활성 단백질은 이후 LC-MS/MALDI-TOF 분석을 통해 확인되고 확인되었습니다.

초록

항생제 내성(AMR)은 전 세계적으로 심화되는 보건 위협으로, 새로운 항생제의 발견이 필요합니다. 조류 유래 단백질과 펩타이드는 생체 활성 잠재력으로 점점 더 주목받고 있습니다; 그러나 특히 Tetraspora sp. CU2551 등 녹조류에서 항균 펩타이드(AMP)를 조사하는 표준화된 프로토콜은 여전히 제한적입니다. 이 프로토콜은 녹조류 Tetraspora sp. CU2551에서 항균 단백질을 분리, 정제 및 특성화하는 단계별 워크플로우를 설명합니다. 이 절차는 최적화된 단백질 추출, 크로마토그래피 분획, 전기영동 분리, 항균 활성 스크리닝, 단백질 식별을 통합합니다. 단백질 추출 조건은 먼저 완충 성분에서 비롯된 배경 억제 효과를 줄이도록 최적화됩니다. 활성 펩타이드의 정체가 알려지지 않을 때는 풀다운 분석법을 적용하여 다양한 이온 교환 수지 간 단백질 결합을 평가하고 적절한 정제 기질 선택을 안내합니다. DEAE-세파로스 이온 교환 크로마토그래피는 항균 단백질 분획을 농축하는 데 적합한 방법입니다. 모든 분획은 항균 활성에 대해 체계적으로 평가되고 SDS-PAGE에 의해 분석됩니다. 가장 높은 항균 활성과 뚜렷한 전기영동 프로필에 해당하는 단백질 밴드를 절제하여 LC-MS/MALDI-TOF 분석을 통해 단백질 식별을 수행합니다. 이 워크플로우는 공개된 생물정보학 도구를 이용한 인 실리코 분석으로 보완되어 항균 펩타이드 관련 특성을 예측합니다. 이 프로토콜은 항균 단백질 발견을 위한 다재다능한 틀을 제공하며, 다른 조류 종 및 관련 생명공학 응용 분야에 쉽게 적용할 수 있습니다.

서론

항생제 내성(AMR)은 점점 커지는 전 세계 보^{건 도전 과제}를 대표하며, 자연 공급원에서 새로운 항생제를 식별하는 지속적인 전략의 중요성을 강조합니다. 조류에서 유래한 단백질과 펩타이드의 항균 특성에 대한 연구가 증가하고 있지만^{, 2,3}. 대부분의 연구는 펩타이드 또는 가수분해물 기반 접근법에 초점을^{맞추고 있으며}, 전체 조류 단백질의 활성 보존 및 평가를 위한 표준화된^{방법은 여전히 제한}적입니다. 이 글에서는 녹조류(Tetraspora sp. CU2551)에서 온전한 단백질을 분리, 정제 및 평가하여 항균 활성을 갖추는 방법을 설명합니다.

프로토콜은 전체 단백질 추출, 이온 교환 크로마토그래피에 의한 분획, 항균 특성 평가, 겔 기반 단백질 분리, 질량분석법을 통한 단백질 식별, 그리고 in silico 기술을 이용한 항균 펩타이드 예측 등 단계별 과정을 개괄합니다. 항균제의 효과는 일반적인 그람 양성 및 음성 박테리아 균주에 대한 표준 한천 확산 및 액체 성장 억제 검사를 통해 평가됩니다 ^4,6. 이 접근법은 소화된 펩타이드 혼합물이나 표준 데이터베이스 정의 외에 항균 단백질이나 AMP 유사 서열을 식별하지 못할 수 있는 계산적 예측에만 의존하는 대신, 특정 단백질 분획이나 전기영동 밴드와 식별된 항균 활성을 연결할 수 있게^합니다.

이 프로토콜을 따르면 독자는 향후 검증 및 기능 평가에 적합한 잠재적 항균 단백질 서열을 포함하는 생리활성 단백질 분획을 신뢰성 있게 얻을 수 있습니다. 대표적인 결과는 알려진 단백질 후보와 미지의 단백질 후보를 모두 포함하는 생체 활성 분획의 확인을 나타냅니다. 이 프로토콜은 조류 및 기타 생물학적 원천에서 얻은 온전한 단백질에서 항균 물질을 식별하는 다재다능하고 실용적인 틀을 제공합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

이 연구는 인간 참가자, 동물, 척추동물 대상을 포함하지 않았습니다. 모든 실험 절차는 태국 킹몽쿳 공과대학(KMITL) 과학부의 기관 생물안전 및 연구 윤리 지침에 따라 수행되었습니다. 모든 미생물 실험은 WHO와 국가 생물안전 기준⁹에 따른 생물안전 레벨 2(BSL-2) 실험실 조건 하에서 수행되었습니다.

모든 실험 절차 동안 실험실 코트, 장갑, 마스크 등 적절한 개인 보호 장비를 착용하세요. 허가된 폐기물 관리 회사에 보내기 전에 기관의 유해 폐기물 관리 지침에 따라 화학 및 은 함유 폐기물을 수집 및 폐기해야 합니다.

화학 연기 후드에서 도데실 황산나트륨, β-머캅토에탄올, 포름알데히드 함유 은 염색 시약 등 유해 화학물질의 농축 용액을 준비합니다. 표준 실험실 안전 관행에 따라 낮은 작업 농도와 작은 부피를 실험대에서 수행합니다.

1. 조류 양식

참고: 조류 재배 기간 내내 무균 상태를 유지하세요.

스타터 배양 준비
1. 멸균 TAP 배지(pH 7.0)¹⁰ 을 준비하고 150mL를 멸균 500mL Erlenmeyer 플라스크에 투여합니다.
2. 클래스 I 생물안전 캐비닛에서 무균 기법을 사용하여 1% (v/v) 접종량 1박 1박 체( Tetraspora sp. CU2551) 접종액으로 배양지를 접종합니다.
3. 배양물을 조명이 장착된 흔들기 인큐베이터에서 35°C, 120rpm, 45.9 μmol/^{m 2}/s 속도로 48시간 배양합니다. 완전히 성장한 배양을 확장의 출발점으로 활용하세요.
스케일업 배양 및 세포 채취
1. 스타터 배양 25mL를 신선한 멸균 TAP 배지 275mL에 옮깁니다. 같은 조건에서 48시간 동안 배양합니다.
2. 조류 세포는 3,800 × g 에서 25°C에서 15분간 원심분리하여 채취합니다.
3. 셀 펠릿을 멸균 증류수로 한 번 세척한 후 3,800 × g 에서 25 °C에서 15분간 원심분리합니다.
4. 상정액을 완전히 제거하고 조류 세포 펠릿을 −20 °C에 보관하여 추가 가공을 기다립니다.

2. 용해 완충제 제형 및 배경 억제 스크리닝

주의: SDS와 β-머캅토에탄올은 고무 장갑이나 니트릴 장갑을 끼고 다룰 때는 반드시 사용하세요. 농축된 β 머캡토에탄올 병을 화학 훈기 후드에서 열어보세요.

용해 완충제 준비
1. 10 mM 트리스-HCl(pH 9.0)에 0.1% w/v SDS, 38 mM β-머캅토에탄올을 보충한 기준 용해 버퍼¹¹ 을 준비합니다.
  참고: 중요한 단계: 위양성 항생제 활성을 피하기 위해 SDS와 β-머캅토에탄올 농도를 최적화하세요.
2. 도데실 황산나트륨(SDS)(0, 0.01, 0.05, 또는 0.1% w/v)과 β-머캅토에탄올(0, 0.5, 1, 또는 2 mM)을 변화시켜 전체 분해 완충 세트를 준비하여 16가지 제형을 생성합니다.
  참고: 모든 시험된 용해 버퍼 제형의 조성은 표 1에 요약되어 있습니다. 사용 직전에 β-머캅토에탄올을 바로 첨가하세요.
배경 항균 스크리닝
1. No. 42 Whatman 종이로 6mm 디스크를 만들기 위해 페이퍼 펀치를 사용하세요. 각 용해 버퍼 제형을 5μL씩 종이 디스크에 적용하고 CLSI 지침⁶에 따라 디스크 확산 분석법을 수행합니다. 분석판을 37°C에서 20시간 배양하고 억제 영역을 평가합니다.
  1. Bacillus subtilis TISTR 1248, Staphylococcus aureus TISTR 746, Escherichia coli TISTR 074, Pseudomonas aeruginosa TISTR 2370에 대한 시험 제형.
2. 이후 단백질 추출을 위해 억제 활성이 없는 제형을 선택하세요.

3. 단백질 추출

참고: 초음파 및 원심분리 시 샘플을 저온에서 유지하세요.

1.2.5단계의 얼린 조류 펠릿을 37°C에서 해동한 후 −20°C에서 다시 냉동합니다. 동결-해동 사이클을 3회 반복합니다(-20 °C / 37 °C).
최적 용해 버퍼(10 mM Tris-HCl, pH 9.0, 0.01% SDS, 2 mM β머캅토에탄올)를 최종 5mL 부피에 첨가하고, 샘플을 냉각 상태로 유지하여 처리 과정 내내 보관합니다. 프로브 소닉네이션(25 kHz, 500 W, 40% 진폭, 1초 켜/끄기, 5분)으로 셀을 교란시킵니다.
제조사 지침에 따라 프로테아제 억제 칵테일을 넣고 부드럽게 섞으세요.
원심분리기는 3,800 × g에서 4°C에서 15 분간 용 해한 후, 상청액을 조단백질 추출물로 수집합니다.
추출물을 10,000 × g 에서 4 °C에서 10분간 원심분리하여 정제합니다. 상청액을 4°C에서 수집하여 보관하세요.

4. 항균 활성 평가

디스크 확산 분석
1. 병원성 박테리아(Bacillus subtilis TISTR 1248, Staphylococcus aureus TISTR 746, Escherichia coli TISTR 074, Pseudomonas aeruginosa TISTR 2370)를 37°C의 영양 한천에서 16-18시간 배양합니다.
2. 멸균 알루미늄 루프를 사용해 한천 표면에서 군락을 긁어내고 0.9% (w/v) NaCl에 재현탁합니다. 박테리아 현탁액을 0.5 맥팔랜드 표준으로 조정하고 뮐러-힌튼 한천 플레이트에 고르게 면봉을 채취합니다.
3. 멸균 종이 디스크를 접종된 한천 표면에 놓고 5 μL 시험 샘플을 도포합니다. 플레이트를 37°C에서 16-20시간 배양하고, 버니어 캘리퍼스로 억제 구역을 측정하세요.
  참고: 모든 디스크의 간격을 균등하게 유지하세요.
MIC와 MBC 판정
1. 2× 10⁶ CFU/mL 용량의 박테리아 현탁액을 4x Mueller-Hinton 육수에 준비합니다.
2. 박테리아 현탁액 50 μL와 연속 희석된 단백질 샘플 100 μL을 96웰 플레이트에 피펫 흡입하고, 10 mM 트리스-HCl 버퍼(pH 7.5)를 사용해 모든 웰을 최종 부피 200 μL로 조정합니다.
3. 양성 대조군으로 5 μL 스트렙토마이신(50 μg)을 사용하세요. 음성 대조군으로 10 mM 트리스-HCl(pH 7.5)과 0.9% (w/v) NaCl을 사용하세요.
4. 37°C에서 20시간 배양한 후 MIC를 가장 낮은 농도로 판단하여 박테리아 증식이 눈에 보이지 않습니다.
5. 투명 우물에서 뮐러-힌튼 한천에 판 분할을 하여 MBC를 결정합니다.
박테리아 성장 곡선 결정
1. 1× 10⁶ CFU/mL 용량의 박테리아 현탁액을 2x Mueller-Hinton 육수에 준비합니다.
2. 96웰 플레이트에서 37°C에서 박테리아 배양 100 μL과 단백질 샘플 100 μL을 20시간 배양합니다.
3. 양성 대조군으로 5 μL 스트렙토마이신(50 μg)을 사용하세요. 멸균 증류수, 10 mM 트리스-HCl(pH 7.5), 500 mM NaCl을 10 mM 트리스-HCl(pH 7.5)에 넣어 대조군으로 사용하세요.
4. 측정 2분 전에는 마이크로플레이트 리더를 사용해 안와 간헐적 흔들림을 사용하여 30분마다 OD₆₀₀₀를 측정합니다.
5. 성장 곡선과 특정 성장률을 계산하세요.
  참고: 높은 단백질 농도는 광학 밀도 측정에 방해가 될 수 있습니다.

5. 풀다운 분석법 및 단백질 정제

풀다운 분석
1. 10 mM 트리스-HCl 완충제(pH 8.0) 또는 CM-세파로스 수지에 10 mM 인산 완충제(pH 7.0)를 사용한 평형 DEAE-세파로스 수지입니다.
2. 평형 수지 100 μL과 조단백질 추출물 500 μL를 혼합한 후, 해당 평형 버퍼 100 μL(DEAE 시 10 mM Tris-HCl, pH 8.0; CM 시 10 mM 인산 완충제, pH 7.0)를 추가합니다. 부드러운 반전(10회 반전)으로 부양하세요.
3. 원심분리기를 짧게 하고, 상청액을 채취한 후 디스크 확산 분석으로 항균 활성을 평가합니다.
4. 작동하는 수지(DEAE-Sepharose)를 선택하세요. pH 최적화를 위해 수지를 10 mM Tris-HCl과 pH 7.0, 7.5, 8.0, 8.5 또는 9.0에서 평형으로 만들고 5.1.1-5.1.3 단계를 따르세요.
5. 이온 교환 크로마토그래피를 위해 항균 활성이 나타나는 pH 조건을 선택하세요.
이온 교환 크로마토그래피 기반 단백질 정제
1. DEAE-세파로스 수지를 유리 크로마토그래피 컬럼(16 mL 베드 부피)에 포장하고, 10 mM 트리스-HCl 버퍼(pH 7.5)와 25°C에서 10 컬럼 부피로 평형을 맞춥니다.
2. 원시 단백질 추출물 15mL(섹션 3.6)를 분당 8mL의 유량으로 적재합니다.
3. 컬럼을 평형 버퍼로 세척하여 280 nm에서 흡수율이 0.05 이하로 떨어질 때까지 유지합니다.
4. 선형 0-500 mM NaCl 구배를 이용한 10 mM 트리스-HCl(pH 7.5)에서 500 mL, 분당 8 mL 투여 시 유출물 결합 단백질.
5. 5mL 분획을 수집하고, 280 nm와 220 nm에서 흡수율을 모니터링하며, 분획을 얼음 위에 보관하세요. 분획은 항균 스크리닝과 단백질 분석을 거쳐 4°C에 보관합니다.

6. SDS-PAGE 및 은염색

참고: 화학 연기 후드에서 은 염색 용액을 준비하고 적절한 개인 보호 장비를 착용하세요. 모든 용액을 새로 준비하세요.

12% SDS-PAGE¹² 를 사용해 단백질 분획을 분리하고, 은염색¹³을 통해 밴드를 시각화합니다.
표적 단백질 밴드를 절제하고 MALDI-TOF MS 분석을 위해 샘플을 제출합니다.
NCBInr에 대한 데이터베이스 검색을 통해 단백질을 식별합니다.

7. 항균 펩타이드 예측

NCBInr 분석에서 후보 단백질 서열을 검색합니다.
공개된 AMP 예측 도구(예: DBAASP, APD3, AMPScanner, CAMPR4)와 데이터베이스를 사용하여 항균 잠재력을 평가합니다.
항균제 확률 점수, 예측 분류, 물리화학적 특성(순전하, 소수성 잔류 함량, GRAVY 지수 [ExPASy ProtParam], 양피파시티)을 포함한 예측 산출물을 추출합니다.
플랫폼 간 계산 결과를 통합하여 후보 항균 단백질의 우선순위를 정하여 후속 검증을 수행합니다.
참고: In silico 예측은 후보 선택을 지원하며 항균 펩타이드의 최종 분류를 구성하지 않습니다.

8. 통계적 검정

모든 실험을 생물학적 삼중으로 수행하세요. 일원 ANOVA를 사용한 후 던컨의 다중 범위 검정 또는 적절한 사후 분석을 95% 신뢰수준에서 분석합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

최적화된 단백질 추출, 이온 교환 분획, 항균 스크리닝, 단백질 식별을 통합한 온전한 단백질 기반 워크플로우는 Tetraspora sp. CU2551에서 생리활성 단백질 분획을 성공적으로 검출할 수 있게 했습니다. 이 프로토콜은 배경 인위를 최소화하면서 천연 단백질의 무결성을 유지하도록 설계되어, 항균 활성을 정의된 크로마토그래피 분획 및 전기영동 밴드와 직접 연관시킬 수 있도록 합니다.

해석 가능한 결과를 얻기 위해서는 용해 버퍼의 최적화가 매우 중요했습니다. 원래 버퍼는 내재성 항균 활성을 보였으며(표 2), 거짓 양성 억제를 초래했습니다. 16가지 제형에 대한 체계적 시험 결과, 0.01% (w/v) SDS와 2 mM β-머카프토에탄올을 포함한 최적화된 버퍼가 확인되어 배경 효과를 제거했습니다(표 1). 풀다운 분석은 항균 활성이 DEAE...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

이 프로토콜을 사용해 신뢰할 수 있는 항균 측정값을 얻기 위해서는 단백질 추출과 초기 생활성 스크리닝 과정에서 여러 중요한 단계를 신중히 관리해야 합니다. 용해 버퍼의 최적화는 필수적이며, 완충 성분에 의한 배경 억제는 항균 단백질 스크리닝에서 위양성 결과의 빈번한 원인이 되기 때문입니다. 원래 버퍼 제형에서 관찰된 항균 활성은 이^{문제를 부각}시키는데, SDS는 인지질 이중층에 삽입하여 박테리아 막을 파괴할 수^{있고, β}-머캅토에탄올 농도가 높아지면 산화환원 균형을 교란하고 세포 외피 관련 단백질을 불안정하게 하여 박테리아의 생존 능력을 저해할 수 있기 때문입니다^15,16. 따라서 SDS를 0.01% (w/v)로 낮추고 β-머캅토에탄올을 2 mM으로 줄이는 것이 중요한 변형으로 입증되...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자들은 이해 상충을 선언할 필요가 없습니다.

감사의 글

이 연구는 킹몽쿳 공과대학 라드크라방 과학부의 연구비(C. 마니루타나룽그로지(RA/TA-2566-M-013)와 킹몽쿳 공과대학의 라드크라방 연구비(KREF016329)에게 지원되었습니다. 질량분석은 태국 마히돌 대학교 의료기술학부 단백질체학 서비스 부서에서 수행되었습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아크릴아마이드/비스-아크릴아마이드 용액	바이오-래드 연구소	1610156	SDS-PAGE 겔 제제 카테고리: 화학
알코올 램프 / 분젠 버너	다양한	—	무균 기술 카테고리: 기기
AMPS캐너	조지 메이슨 대학교 (Veltri 등)	—	딥러닝 기반 AMP 예측 도구 카테고리: 소프트웨어 / 데이터베이스
항균 펩타이드 예측 도구 (DBAASP, APD3, AMPscanner, CAMPR4)	다양한 학술 자료	—	실리코 AMP 분석 카테고리: 소프트웨어 / 데이터베이스
APD3	왕 연구실, 네브래스카 대학교	—	항균 펩타이드 데이터베이스 카테고리: 소프트웨어 / 데이터베이스
오토클레이브	토미	—	매체 및 재료의 멸균 카테고리: 기기
생명안전 캐비닛 클래스 I/II	다양한	—	무균 취급 분류: 기기
바이오툴 2.0	브루커 달토닉스	—	MS 스펙트럼 및 펩타이드 시각화 도구 카테고리: 소프트웨어
브래드포드 리어시터	머크	B6916	단백질 정량 분류: 화학
캠프4	인도 공과대학교 봄베이	—	항균 펩타이드 수집 카테고리: 소프트웨어 / 데이터베이스
원심분리기, 에펜도르프 5415R 냉장 마이크로 원심분리기	에펜도르프	—	마이크로 원심분리 분류: 기기
원심분리기, Thermo Scientific Megafuge 8R	써모피셔 사이언티브	—	대용량 원심분리< br/> 카테고리: 기기
크로마토그래피 컬럼 (유리)	다양한	—	이온 교환 크로마토그래피 카테고리: 유리제품
CM-세파로스 수지	머크	CEF100	양이온 교환 수지 분류: 화학 (수지)
면봉	다양한	—	박테리아 접종 카테고리: 플라스틱 용기
쿠벳, 쿼츠	헬마 애널리틱스	—	UV 분광광도< > 분류: 유리기구
DBAASP	러시아 생물유기화학 연구소	—	항균 활성 및 펩타이드 구조 데이터베이스 카테고리: 소프트웨어 / 데이터베이스
DEAE-세파로즈 수지	머크	DEFF100	음온 교환 수지 분류: 화학물질(수지)
얼렌마이어 플라스크, 100 mL	다양한	—	조류 재배 카테고리: 유리제품
에를렌마이어 플라스크, 500 mL	다양한	—	조류 재배 카테고리: 유리제품
대장균 TISTR 074	TISTR, 태국	—	시험 미생물< br/> 분류: 생물학적 물질
ExPASy ProtParam	스위스 생물정보학 연구소	—	단백질의 물리화학적 특성 계산을 위한 온라인 도구 카테고리: 소프트웨어 / 데이터베이스
포름알데히드	머크	1.04002	은 염색 분류: 화학
냉동고 (-20도 & 도; C)	다양한	—	샘플 저장 카테고리: 기기
젤 전기영동 시스템 (미니 프로티안 테트라)	바이오-래드 연구소	—	SDS-PAGE 카테고리: 기기
유리 시험관 (16 & times; 150 mm)	파이렉스 / 듀란	—	샘플 취급 카테고리: 유리 제품
장갑, 니트릴	다양한	—	개인 보호 카테고리: 플라스틱 제품
Halt 프로테아제 억제제 칵테일 (100x)	써모피셔 사이언티브	87786	프로테아제 억제 분류: 화학적
인큐베이터	다양한	—	박테리아 배양 카테고리: 기기
인큐베이터 셰이커	다양한	—	조류 문화 분류: 기기
접종 루프	어떤 실험실 공급업체든	—	미생물 전이 분류: 소비성
KCl	머크	P5405	완충제 준비 분류: 화학물질
말디-TOF 질량분석기 (Reflex IV)	브루커 달토닉스	—	단백질 식별 분류: 기기
마스코트	매트릭스 사이언스	—	MS 데이터를 통한 단백질 식별 검색 엔진 카테고리: 소프트웨어 / 데이터베이스
마스코트 2.2	매트릭스 사이언스	—	단백질 식별 카테고리: 소프트웨어
측정 실린더	파이렉스	—	부피 측정 카테고리: 유리 제품
마이크로 원심분리기 튜브 (1.5 mL)	-	—	샘플 가공 카테고리: 플라스틱 제품
마이크로 원심분리기 튜브 (2.0 mL)	-	—	샘플 가공 카테고리: 플라스틱 제품
마이크로피펫 (100– 1000 & 마이크로; L)	-	—	액체 취급 카테고리: 기기
마이크로피펫 (1– 10 & 마이크로; L)	-	—	액체 취급 카테고리: 기기
마이크로피펫 (1– 5 & 마이크로; L)	-	—	액체 취급 카테고리: 기기
마이크로피펫 (1– 5 mL)	-	—	액체 취급 카테고리: 기기
마이크로피펫 (20– 200 & 마이크로; L)	-	—	액체 취급 카테고리: 기기
마이크로플레이트 리더	바이오텍	—	OD600 측정 카테고리: 계측기
뮐러와 대시; 힌튼 아가/브로스	다양한	—	항균 분석 분류: 중체
나노드롭 / 바이오드롭 분광광도계	다양한	—	단백질 측정 분류: 기기
NCBInr 데이터베이스	국립 생명공학 정보 센터	—	비중복 단백질 데이터베이스 카테고리: 소프트웨어 / 데이터베이스
영양 한천	-	—	박테리아 배양 카테고리: 매체
종이 디스크 (6mm)	왓먼 42호	—	디스크 확산 분석 카테고리: 플라스틱웨어
페트리 접시	다양한	—	미생물 배양 카테고리: 플라스틱웨어
pH 측정기	메틀러 톨레도	—	pH 조정 카테고리: 기기
인산염 완충제(10 mM, pH 7.0)	-	—	크로마토그래피 버퍼 카테고리: 버퍼
프로브 소닉케이터 (VCX500)	소닉스 & 머티리얼즈 주식회사	—	셀 교란 500 W, 20 kHz, 프로브 포함 카테고리: 기기
냉장고 (4 & deg; C)	다양한	—	샘플 저장 카테고리: 기기
질산은	시스코 연구소	94118	은 염색 분류: 화학
염화나트륨(NaCl)	머크	S9888	용출 버퍼 카테고리: 화학
도데실 설페이트 나트륨 (SDS)	바이오-래드 연구소	11667289001	용해와 PAGE 분류: 화학
분광광도계	시마즈	—	흡광도 측정 카테고리: 기기
스핀다운 원심분리기	에펜도르프	—	빠른 원심분리 카테고리: 기기
황색포도상구균 TISTR 746	TISTR, 태국	—	시험 미생물< br/> 분류: 생물학적 물질
스트렙토마이신	머크	S9137-25G	양성 통제 분류: 화학
테트라스포라 속 CU2551	KMITL 문화 컬렉션	—	조류 균주 분류: 생물학적 물질
트리스 아세테이트 인산염(TAP) 배양체	-	—	조류 문화 카테고리: 미디엄
트리스-HCl	머크	—	버퍼 준비 카테고리: 버퍼
버니에 캘리퍼	다양한	—	존 측정 분류: 계측기
워터 배스	다양한	—	온도 조절 카테고리: 계측기
XMASS	브루커 달토닉스	—	MALDI-TOF 질량분석법 소프트웨어 카테고리: 소프트웨어
&알파;-시아노-4-하이드록시신나믹산 (CHCA)	브루커 달토닉스	—	MALDI 매트릭스 분류: 화학

참고문헌

Antimicrobial Resistance Collaborators. Global burden of bacterial antimicrobial resistance in 2019: a systematic analysis. Lancet. 399 (10325), 629-655 (2022).
Vasquez-Moscoso, C. A., Merlano, J. A. R., Olivera Gálvez, A., Volcan Almeida, D. Antimicrobial peptides (AMPs) from microalgae as an alternative to conventional antibiotics in aquaculture. Prep Biochem Biotechnol. 55 (1), 26-35 (2025).
Mekhalfi, M., Berteina-Raboin, S. Microalgae, cell factories for antimicrobial peptides: a promising response to antibiotic resistance. Antibiotics. 14 (10), 959(2025).
Singh, L. A., et al. Microalgae-derived antioxidants and antimicrobials: a sustainable approach for natural food preservatives. Front Sustain Food Syst. 9, 1669731(2025).
Wang, X., Ma, S., Kong, F. Microalgae biotechnology: methods and applications. Bioengineering. 11 (10), 965(2024).
Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. CLSI supplement M100. , 35th ed, Standards Institute Clinical and Laboratory. (2025).
Sun, S. Progress in the identification and design of novel antimicrobial peptides against pathogenic microorganisms. Probiotics Antimicrob Proteins. 17 (2), 918-936 (2025).
Yang, R., et al. Advances in antimicrobial peptides: from mechanistic insights to chemical modifications. Biotechnol Adv. 81, 108570(2025).
Laboratorybiosafety manual. , 4th ed, World Health Organization. (2020).
Bolton, J. Algal culturing techniques. J Exp Mar Biol Ecol. 336, 262-262 (2006).
Tonawut, Y., et al. In silico encrypted peptide from green alga Tetraspora sp. CU2551 showed high antimicrobial activities. Algal Res. 78, 103382(2024).
Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
Oakley, B. R., Kirsch, D. R., Morris, N. R. A simplified ultrasensitive silver stain for detecting proteins in polyacrylamide gels. Anal Biochem. 105 (1), 361-363 (1980).
Zhu, Q., et al. Effect of sodium dodecyl sulfate (SDS) on microbial community structure and function in lake-terrestrial ecotones: a simulation experiment. Environ Technol Innov. 34, 103594(2024).
Mattern, K. L., Evans, C. A., Lara, J. C. Selective antibacterial action of 2-mercaptoethanol on propionibacteria in skin cultures. Appl Environ Microbiol. 37 (1), 177-179 (1979).
Click, R. E. Review: 2-mercaptoethanol alteration of in vitro immune functions of species other than murine. J Immunol Methods. 402 (1-2), 1-8 (2014).
Ishak, A., Mazonakis, N., Spernovasilis, N., Akinosoglou, K., Tsioutis, C. Bactericidal versus bacteriostatic antibacterials: clinical significance, differences and synergistic potential in clinical practice. J Antimicrob Chemother. 80 (1), 1-17 (2025).
Vaisbourd, E., et al. Principles of bacteriostatic and bactericidal antibiotics at subinhibitory concentrations. mBio. 16 (11), e0206625(2025).
Marciano, C. L., et al. A comprehensive overview of antimicrobial peptides: broad-spectrum activity, computational approaches, and applications. Antibiotics. 14 (11), 1115(2025).
Lu, Z., et al. Studies on the antibacterial activity of the antimicrobial peptide Mastoparan X against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Front Cell Infect Microbiol. 15, 1552872(2025).
Keeratikunakorn, K., Aunpad, R., Ngamwongsatit, N., Kaeoket, K. The effect of antimicrobial peptide (PA-13) on Escherichia coli carrying antibiotic-resistant genes isolated from boar semen. Antibiotics. 13 (2), 138(2024).
Maneeruttanarungroj, C., Lindblad, P., Incharoensakdi, A. A newly isolated green alga, Tetraspora sp. CU2551, from Thailand with efficient hydrogen production. Int J Hydrogen Energy. 35, 13193-13199 (2010).
Brizuela, C. A., Liu, G., Stokes, J. M., de la Fuente-Nunez, C. AI methods for antimicrobial peptides: progress and challenges. Microb Biotechnol. 18 (1), e70072(2025).
Maccari, G., Di Luca, M., Nifosì, R. In silico design of antimicrobial peptides. Methods Mol Biol. 1268, 195-219 (2015).
Huan, Y., Kong, Q., Mou, H., Yi, H. Antimicrobial peptides: classification, design, application and research progress in multiple fields. Front Microbiol. 11, 582779(2020).
Alzain, M., et al. Antimicrobial peptides: mechanisms, applications, and therapeutic potential. Infect Drug Resist. 18, 4385-4426 (2025).
Rivero-Pino, F., Millan-Linares, M. C., Montserrat-de-la-Paz, S. Strengths and limitations of in silico tools to assess physicochemical properties, bioactivity, and bioavailability of food-derived peptides. Trends Food Sci Technol. 138, 433-440 (2023).
Curnutte, J. T., Babior, B. M. Biological defense mechanisms: the effect of bacteria and serum on superoxide production by granulocytes. J Clin Invest. 53 (6), 1662-1672 (1974).
Eleftheriadis, T., Pissas, G., Liakopoulos, V., Stefanidis, I. Cytochrome c as a potentially clinically useful marker of mitochondrial and cellular damage. Front Immunol. 7, 279(2016).
Min, L., Jian-xing, X. Detoxifying function of cytochrome c against oxygen toxicity. Mitochondrion. 7 (1), 13-16 (2007).
Mühlhaus, T., et al. Quantitative shotgun proteomics using a uniform N-labeled standard reveals new insights into the heat stress response of Chlamydomonas reinhardtii. Mol Cell Proteomics. 10 (9), M110.004739(2011).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

녹조류 테트라스포라 Sp. CU2551에서 추출한 항균 단백질의 정제 및 식별

이 논문에서

요약

초록

서론

프로토콜

결과

토론

공개 사항

감사의 글

재료

참고문헌

재인쇄 및 허가

태그