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방법 논문

중추신경계 병원체 검출을 위한 뇌척수액의 메타게놈 차세대 시퀀싱

292 조회수

⸱

DOI:

10.3791/70075

⸱

2026년 4월 17일

 ,  ,  , 
1University of California, San Francisco Weill Institute for Neurosciences, Department of Neurology, University of California, San Francisco

이 논문에서

요약

이 연구 프로토콜은 뇌척수액의 메타게놈 차세대 시퀀싱(mNGS)을 위한 최적화된 워크플로우를 개괄합니다. 저생물량 샘플에 고유한 문제를 해결함으로써, 이 방법은 다양한 자원 환경에서 강력한 병원체 검출을 가능하게 하여 신경감염병 연구 응용의 다재다능한 기반을 제공합니다.

초록

메타게놈 차세대 시퀀싱(mNGS)은 임상 및 연구 환경에서 편향되지 않은 병원체 검출과 숙주 전사 프로파일링을 위한 강력한 도구로 부상했습니다. 중추신경계(CNS) 감염 진단에 대한 유용성이 점점 인정받고 있지만, 뇌척수액(CSF) 샘플은 낮은 핵산 함량과 분해에 대한 취약성 때문에 독특한 도전 과제를 안고 있습니다. 본 연구는 CSF mNGS에 맞춘 Illumina 시퀀싱 플랫폼을 위한 최적화된 연구 기반 프로토콜을 제시하며, 샘플 처리, 핵산 추출, 라이브러리 준비, 시퀀싱, 생물정보학 분석 과정을 아우릅니다. 모세관 전기영동의 대안을 포함하여 고자원 및 저자원 환경에 적응할 수 있는 품질 관리 접근법도 제공됩니다. 이 연구는 두 가지 대표적인 코호트, 즉 고도의 NovaSeq 기반 워크플로우와 비용 의식적인 NextSeq 기반 워크플로우를 통해 프로토콜의 견고함을 입증합니다. 이들 코호트에서 50% 이상의 사례에서 병원체가 검출되어 자원이 제한된 적응에도 불구하고 이 방법의 진단 잠재력이 있음을 강조했습니다. 이 프로토콜은 재현 가능한 CSF mNGS를 촉진하여 신경감염병 연구 및 진단 분야에서 다양한 응용의 기초를 제공합니다.

서론

메타게놈 차세대 시퀀싱(mNGS)은 주어진 환경 또는 숙주 샘플 내에서 광범위한 핵산 스펙트럼을 검출할 수 있게 하는 점점 더 널리 사용되는 분자 기법입니다. 샘플 내 대부분의 유전 물질을 증폭하고 시퀀싱함으로써, mNGS는 존재할 수 있는 특정 미생물에 대한 선입견 없는 가설을 요구하지 않습니다. mNGS는 드문 병원체나 감염병의 비정형 증상 검출과 같은 다양한 임상 환경에서 진단 도구로 유용함을 입증했습니다 1,2,3. 더 나아가, mNGS 분석법이 생성하는 RNA 시퀀싱 데이터로도 숙주 전사 프로필을 포착하여, 연구자들이 다양한 질병 상태에 대한 숙주 면역 반응을 더 잘 이해할 수 있도록합니다. mNGS가 다양한 임상 및 연구 맥락에 적용 가능해지고, 최근 수십 년간 제네릭 시퀀싱 비용이 급격히 감소함에 따라이 기술의 사용이 크게 증가했습니다.

특히 mNGS는 진단이 여전히 어려운 중추신경계(CNS) 감염 탐지에 유망한 결과를 보였습니다. 임상 mNGS 검사가 도입되기 전, 캘리포니아 뇌염 프로젝트는 주 전역에서 뇌염의 원인을 조사했으며, 분자 검사 확대와 상세한 임상 평가를 활용했음에도 불구하고 절반 이상의 사례가 진단되지 않은 상태로 남아 있음을 발견했습니다8. 이제 20년이 넘은 지금, 임상적으로 검증된 뇌척수액(CSF) mNGS 분석법이 7년간 중추신경계 감염 의심 환자의 약 15%의 뇌척수에서 병원성 미생물의 존재를 검출했습니다7. 더불어, 감염성 진단이 확진된 환자 중 5명 중 1명은 이 임상 CSF mNGS 분석법으로만 진단받았으며, 이 검사 방법의 유용성을 강조합니다7. 또한, mNGS 분석법 9,10,11에서 생성된 숙주 전사체를 바탕으로 다양한 중추신경계 감염 가능성을 예측할 수 있는 잠재력도 연구에서 입증되었습니다.

그러나 이 유망한 기술의 접근성은 CSF 샘플 취급 및 처리에 고유한 어려움으로 제한되어 있습니다. 특히, 뇌척척척수 DNA와 RNA의 양은 라이브러리 제제 키트12,13에서 명시된 최소 양보다 종종 적습니다. 핵산 품질도 최적이 아닐 수 있는데, 이는 임상 목적으로 수집된 CSF 샘플이 DNA와 RNAs가 활성 상태를 유지할 수 있는 온도에서 보관되는 경우가 많기 때문입니다. 본 논문은 병원체 검출에 사용할 수 있는 데이터를 생성할 가능성을 극대화하도록 최적화된 일루미나 시퀀싱 플랫폼용 연구 기반 CSF mNGS 프로토콜을 설명합니다(그림 1).

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프로토콜

이 프로토콜은 UCSF 기관심의위원회(UCSF)에서 승인한 연구의 일부로 수집된 샘플을 사용하여 개발되고 테스트되었습니다.

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그림 1: 뇌척수액(CSF) 메타게놈 차세대 시퀀싱(mNGS) 샘플 처리 및 병원체 검출을 위한 분석 워크플로우. 이 도표는 CSF mNGS 습식 실험실 및 생물정보학 경로의 주요 단계를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

1. 뇌척수액 샘플 취급 고려사항

참고: mNGS 결과는 채취 시점에 CSF 라이브러리 준비가 이루어지거나, CSF 샘플을 액체 질소에서 급동 냉동하여 보존한 후 -80 °C15에서 장기 보관하는 경우 최적입니다. 또는 샘플 채취 시 DNA/RNA 차폐와 같은 방부제를 사용하면 상온에서 더 오랜 시간 보관할 수 있습니다16,17. 콜드 체인의 신뢰성에 대한 우려가 있을 때는 이 방법이 더 바람직할 수 있습니다. 또한 불필요한 동결-해동 사이클을 피하는 것도 핵산 무결성 보존에 도움이 되며, CSF 샘플에 대해 여러 분석 워크플로우가 예상된다면 채취 시 샘플을 미리 분리하는 것이 권장될 수 있습니다18,19.

2. 뇌척수액 핵산 추출

주의: 감염성 미생물 전파 위험을 줄이기 위해 장갑과 실험실 코트를 착용한 적절한 생물안전 등급의 캐비닛 안에서 작업하세요. 시약은 삼키거나 흡입하거나 피부에 닿으면 해롭습니다. 사용 후 물질은 지역 규정을 준수하여 유해 화학 폐기물로 폐기합니다.

  1. Quick-DNA/RNA Kit은 일반적으로 핵산 함량이 낮은 샘플에 잘 작동합니다.
  2. CSF 샘플을 얼음 위에서 해동한 후, 각 샘플 100 μL–1 mL를 1.5 mL 튜브에 옮겨 16,000 x g 크기의 4 °C 원심분리기에서 10분간 가열합니다.
  3. 상정액을 조심스럽게 피펫으로 떼어내고, 육안으로는 보이지 않는 펠릿과 100 μL 상상액을 남깁니다.
  4. 나머지 100 μL 상원액과 펠릿에 100 μL DNA/RNA 쉴드를 첨가한 후 피펫으로 완전히 혼합합니다.
  5. 그 후 DNA/RNA 용해 버퍼 600 μL와 피펫 혼합물을 혼합하여 용액이 균질해질 때까지 추가합니다.
  6. 제조사가 설명한 보 충 부록 A에 설명된 DNA/RNA 추출 프로토콜의 나머지 부분을 따르며, CSF에 특화된 다음과 같은 중요한 수정사항을 포함합니다:
    1. 모든 원심분리 단계를 최대 속도(~21,000 x g)로 1분간 수행하며, 마지막 DNA/RNA 세척 단계는 최대 속도로 3분간 진행되어야 합니다.
    2. 샘플을 25 μL 대신 22 μL의 무핵효소 물을 컬럼 매트릭스에 직접 첨가하여 용출한 후, 실온에서 3분간 배양합니다. 부피가 많을수록 일반적으로 컬럼에서 탈출되는 핵산의 총량이 더 많아집니다.
    3. 용출 후에는 플로우 스루를 컬럼 매트릭스에 피펫팅한 후 최대 속도로 1분간 원심분리합니다. 샘플을 새로운 1.5 mL 저장관으로 옮기고, 즉시 라이브러리 준비를 진행하거나 -80 °C에서 보관하세요.

3. CSF RNA 라이브러리 준비

주의: 적절한 생물안전 캐비닛 안에서 장갑과 실험실 코트를 착용하여 수행하십시오. 시약은 삼키거나 흡입하거나 피부에 닿으면 해롭습니다. 사용 후 물질은 지역 규정을 준수하여 유해 화학 폐기물로 폐기합니다.

참고: 시작 전 중요한 고려사항: mRNA 분리에는 rRNA 고갈이 추가적인 비드 클린 단계가 필요 없고(이는 사용 가능한 mRNA의 수율을 줄일 수 있음), 일부 신경침습성 RNA 바이러스 전사체는 폴리아데닐화 과정이 없기 때문에 폴리아데닐화 농축보다 rRNA 고갈이 선호됩니다. ERCC(외부 RNA 대조 컨소시엄) RNA 스파이크-인은 품질 관리 조치로 추가할 수 있으나, 반드시 필요한 것은 아닙니다. 추출 후 RNA가 -80°C에 저장되어 있다면, 시작 전에 얼음 위에서 해동하세요.

  1. RNA 단편화 및 프라이밍: 폴리머라제 연쇄반응(PCR) 튜브 내 피펫 혼합: 3.5 μL RNA 샘플, 0.5 μL 1:2500 희석된 ERCC 스파이크인, 4 μL 1가닥 반응 완충제(5x), 1 μL 무작위 프라이머, 1 μL 1:100 희석된 rRNA (재료표). 열사이클러에서 가열된 뚜껑을 105 °C로 설정하고, 샘플을 75 °C에서 2분, 70 °C에서 2분, 65 °C에서 2분, 60 °C에서 2분, 55 °C에서 2분, 37 °C에서 5분, 25 °C에서 5분에 배양합니다.
  2. 1가닥 cDNA 합성: 피펫으로 분해되고 프라이밍된 RNA(10 μL)를 8 μL 무뉴클레아제 물 및 2 μL 1가닥 합성 효소 혼합물과 혼합합니다. 열사이클러에서 가열된 뚜껑을 105 °C로 설정하고, 샘플을 25 °C에서 10분, 42 °C에서 15분, 70 °C에서 15분씩 배양합니다.
  3. 두 번째 가닥 cDNA 합성: 피펫을 첫 번째 가닥 합성 DNA(20 μL)와 8 μL 두 번째 가닥 합성 반응 버퍼, 4 μL 두 번째 가닥 합성 효소 혼합물, 그리고 48 μL 무핵효소 물과 혼합합니다. 열사이클러에서 16°C에서 1시간 동안 가열된 뚜껑을 끄고 배양합니다.
  4. SPRI 자기 비드 1.8배(144 μL)를 사용하여 자기 비드 정제(보충 부록 B)를 수행합니다. 53 μL 뉴클레아제 없는 물에 용출하고, 정제된 이중 가닥 cDNA 포함 최종 상청액 50 μL을 깨끗한 무뉴클레아제 PCR 튜브로 옮깁니다. 이 시점에서 필요하다면 샘플을 -20°C에서 하룻밤 안전하게 냉동할 수 있습니다.
  5. cDNA 라이브러리 종료 준비: 샘플을 -20°C에서 하룻밤 보관한 경우, 재시작 전에 얼음 위에서 해동합니다. 피펫은 정제된 ds-cDNA(50 μL)와 7 μL 종단 준비 반응 버퍼 및 3 μL 종단 준비 증소 혼합액과 혼합합니다.
  6. 열사이클러에서 20°C에서 30분, 65°C에서 30분간 가열된 뚜껑을 끄고 배양합니다.
  7. 어댑터 연결(얼음 위에서 이 단계 수행): 뉴클레아제가 없는 물에 어댑터를 1:100 희석합니다. 최종 준비 반응 혼합물(60 μL)을 30 μL 라이게이션 마스터 믹스, 1 μL 라이게이션 증강제, 2.5 μL 1:100 희석 어댑터가 들어있는 튜브에 피펫 삽입합니다. 어댑터가 별도의 첨가되도록 반드시 (예: 리게이션 마스터 믹스나 리게이션 인핸서와 미리 혼합되지 않아) 어댑터 이머 형성을 방지해야 합니다.
  8. 열사이클러에서 20°C에서 15분간 가열된 뚜껑을 닫은 채 배양합니다.
  9. 즉시 SPRI 자기 비드 0.9배(87 μL) 비율을 사용하여 자기 비드 정제(보충 부록 2)를 진행하십시오.
  10. 17 μL 무핵효소 물에 용출한 후, 최종 상정액 15 μL을 깨끗한 무핵효소 PCR 튜브로 옮깁니다
  11. 바코드 PCR: 정제된 어댑터 결합 cDNA(15 μL)를 3 μL USER 효소, 25 μL Q5 마스터 믹스, 10 μL 고유 바코드 프라이머가 포함된 튜브에 피펫 삽입합니다. 열사이클러에서 가열된 뚜껑을 105 °C로 설정하고, 샘플을 37 °C에서 15분, 98 °C에서 30초간 배양한 뒤, 98 °C에서 10초, 65 °C에서 75초간 19회 배양합니다. PCR을 마무리할 때 65°C에서 5분간 배양하세요.
  12. 0.8배 비율의 자기 비드(43 μL)를 사용하여 최종 자기 비드 정제를 수행합니다. 23 μL 뉴클레아제 없는 물에 용출한 후, 마지막 구슬 분리 단계 후 20 μL를 깨끗한 뉴클레아제 프리 PCR 튜브로 옮깁니다. 이 시점에서 필요하다면 샘플을 -20°C에서 하룻밤 안전하게 냉동할 수 있습니다.

4. 뇌척척수 DNA 라이브러리 준비

주의: 적절한 생물안전 등급의 캐비닛 안에서 장갑과 실험실 코트를 착용하세요. 시약은 삼키거나 흡입하거나 피부에 닿으면 해롭습니다. 사용 후 물질은 지역 규정을 준수하여 유해 화학 폐기물로 폐기합니다.

  1. 추출된 DNA가 -20°C에서 하룻밤 동안 보관되었다면, 다시 시작하기 전에 얼음 위에서 해동하세요.
  2. DNA 단편화 및 최종 준비: 1가닥 반응 완충제를 소용돌이 처리하여 완전히 혼합하고, 피펫으로 혼합하여 침전물을 재현탁합니다. 추출한 DNA 3.5 μL, 뉴클레아제 무첨가물 22.5 μL, 1가닥 반응 완충액 7 μL, 1가닥 효소 혼합물 2 μL 혼합물을 피펫 혼합합니다.
  3. 열사이클러에서 가열된 뚜껑을 105 °C로 설정하고 샘플을 37 °C에서 5분간 배양한 뒤, 65 °C에서 30분간 배양합니다.
  4. 어댑터 연결과 바코딩 PCR 과정은 DNA 및 RNA 라이브러리에 대해 동일합니다. "CSF RNA 라이브러리 준비"의 7–10절을 분해하고 말단 준비된 DNA와 함께 반복하여 DNA 라이브러리 준비를 완료합니다.

5. 도서관 품질 관리 및 풀링

  1. DNA 정량 키트와 해당 형광도계를 통해 샘플 라이브러리의 농도를 정량화하세요. 수질 조절은 다른 샘플에 비해 훨씬 낮거나 측정 불가능해야 합니다.
  2. 샘플 라이브러리 크기를 자동 모세관 전기영동기에서 분석하여 평가하세요.
  3. 또는 자동 모세관 전기영동기가 없을 경우, 일루미나 범용 프라이머로 PCR 반응을 수행하여 샘플의 1-2 μL을 증폭한 후, 최종 산물 10 μL의 전기영동을 2% 아가로스 겔에 수행합니다. 사용 후 물질은 지역 규정을 준수하여 유해 화학 폐기물로 폐기합니다.
    참고: 최적 라이브러리 길이는 약 400–500 염기쌍이므로, 라이브러리 크기가 원하는 것보다 크거나 짧을 경우 향후 분할 인큐베이션을 이에 맞게 조정해야 합니다. 또한, 약 150염기쌍 길이의 어댑터 이물질체 존재를 평가하는 것이 매우 중요한데, 이는 두 어댑터 분자가 삽입물 서열 없이 의도치 않게 결합할 때 발생합니다. 소량이라도 어댑터 다이머는 플로우셀에서 효율적으로 집단되고 서열화되어 시서열 분석 중 사용 가능한 리드 비율을 줄입니다. 따라서 어댑터 다이머가 존재한다면, SPRI 자기 비드의 0.8배 비율로 추가 자기 비드 정제를 수행하세요. (참고로, 샘플의 >10%가 어댑터 다이머라면, 대부분의 어댑터 다이머를 제거하려면 2-3라운드의 자기 비드 정화가 필요할 수 있습니다.)
  4. 동일한 시퀀싱 실행 내에서 샘플 간 유사한 시퀀싱 깊이를 유지하기 위해서는 각 샘플의 등몰 량을 풀어내는 것이 필요합니다. 라이브러리 크기가 모든 샘플에서 유사하다면, 각 RNA 라이브러리의 동등 한 질량을 모아 각 DNA 라이브러리별로 별도로 반복합니다.

6. 시퀀싱 고려사항

  1. 모은 샘플들은 이제 일루미늄 시퀀싱 장치에서 시퀀싱 준비가 완료되었습니다. 시퀀싱을 자체 시퀀싱(특수 시퀀싱 코어 시설이 아닌 사내 진행)할 경우, 시퀀싱 장치 지침에 따라 풀을 시약에 적재하기 전에 반드시 변성 및 희석하여 시약에 적재해야 합니다(대부분의 일루미나 시퀀싱 플랫폼에서 일반적으로 농도는 4 nM입니다).
  2. Illumina 플로우 셀의 예상 데이터 산출량을 실행에서 다중화된 샘플 수로 나누어 추정한 시퀀싱 깊이를 계산합니다.
    참고: 원하는 시퀀싱 깊이를 결정하는 것은 비용, 사용된 시퀀싱 장치, 실험 목적 등 여러 요인에 따라 달라집니다. 아래 대표성 결과 섹션에 서로 다른 시퀀싱 깊이의 두 가지 예시가 제시되어 있습니다.

7. 병원체 검출을 위한 데이터 분석

  1. 병원체 검출을 위한 메타게놈 분석을 수행하기 위해 오픈소스 웹 기반 플랫폼인 Chan Zuckerberg ID(CZID, https://www.czid.org, Illumina mNGS Pipeline v8.3)를 활용하세요. CZID는 또한 명령줄 인터페이스를 통해 샘플을 업로드하거나 Illumina BaseSpace 계정에서 CZID로 직접 전송할 수 있는 옵션도 제공합니다. CZID mNGS 데이터 분석에 대한 자세한 개요는 https://chanzuckerberg.zendesk.com/hc/en-us/articles/13770737266196-Guide-to-mNGS-Data-Analysis 에서 확인할 수 있습니다
  2. CZID에 로그인하여 "업로드"를 클릭하고, 분석 유형을 선택해 "metagenomics"를 선택한 후 시퀀싱 실행에서 입력된 fastq 파일을 선택하세요. 각 샘플에 대해 샘플명, 샘플 유형(CSF), 뉴클레오타이드(RNA 또는 DNA) 등 필요한 정보를 입력하세요.
    참고: 업로드된 파일은 CZID 파이프라인을 통해 자동 처리되며, STAR, Bowtie2, Trimmomatic, PriceSeq, GSNAP 등 여러 계산 도구를 통합하여 저품질 리드와 인간 리드 시퀀스를 제거합니다. 파이프라인은 각각 Minimap2와 DIAMOND 소프트웨어 프로그램을 통해 국립생명공학정보센터(NCBI) 뉴클레오타이드(NT)와 단백질(NR) 데이터베이스를 활용하여 필터링된 서열을 정렬하고 조립합니다. 최종 CZID 산출물에는 각 샘플에 대해 NT/NR 분류군 수와 연속 개체수(조립 과정에서 생성된 연속적이고 겹치는 구간)가 포함됩니다.
  3. 처리가 완료되면 샘플이 포함된 프로젝트 폴더를 클릭하고 요약 대시보드로 이동합니다.
  4. 아래로 스크롤하여 샘플당 리드 수(사용한 Illumina 플로우 셀 및 시퀀싱 러닝에서 다중화된 샘플 수와 비교), 품질 관리 필터링을 통과한 리드 비율, 중복 압축 비율을 확인하여 편향된 PCR 과다증폭 여부를 평가하세요.
  5. CSF 샘플 채취 과정이나 추출/라이브러리 준비 중에 획득된 환경 핵산 조각에 의한 오염의 존재는 흔한 현상입니다20. 박테리아, 곰팡이, 기생충 판독이 진정 양성인지 판단하기 위해, 정규화된 판독 수(백만 당 독도, rPM)를 활용한 잠재적 방법을 고려할 수 있습니다:
    1. CZID 내에서 직접 배경 모델을 생성하여(예: 추출, 준비, 시퀀싱된 수질 샘플을 사용해) 배경 모델과 비슷하거나 풍부도가 낮은(따라서 오염을 대표할 가능성이 있는 rPMs)을 필터링하세요. 프로젝트 폴더 내에서 각 수자원 제어 샘플을 확인한 후 "배경 모델"을 클릭하여 생성하세요. 각 샘플을 분석할 때 배경 모델을 선택하고 "임계값 필터"를 클릭하면 "NTZ 점수"> 1(또는 그 이상)을 적용하여 가능한 오염물질을 걸러냅니다.
    2. 예: rpM샘플 > 10*(평균 rPM통제), 또는 log10(rPM 샘플)보다 최소 1 로그 높은 rPM임계값(전체 평균 rPM 코호트)과 같이 미리 지정된 rPM 임계값을 활용하세요. 먼저, 프로젝트 페이지에서 각 샘플을 확인한 후 다운로드를 클릭한 후 "결합 샘플 분류군 결과"를 선택하여 각 샘플별 rPM을 다운로드하세요. 결과된 .csv 파일은 필요에 따라 R이나 Stata와 같은 통계 소프트웨어를 사용해 분석할 수 있습니다.
      참고: 바이러스 병원체의 상대적 풍부도가 낮기 때문에, 신경침습 가능성이 알려진 바이러스와 바이러스 게놈과 일치하는 최소 한 번의 리드는 양성 결과로 간주되어야 하며(이상적으로는 반복 mNGS 또는 병원체 특이적 임상 검사를 통해 확인되어야 합니다). 또한, 분석 파이프라인은 fastq 파일의 각 리드 가 NCBI 데이터베이스에서 가장 가능성이 높은 참조 유전체와 계산적으로 정렬되어야 합니다. 그 결과, 일부 리드는 특정 병원체에 대해 비교적 비특이적일 수 있으며, 이론적으로는 CZID에 할당된 특정 분류군보다는 광범위한 생물체에 맞춰져 있을 수 있습니다. 이러한 위험을 고려할 때, 긍정적인 호출을 수동으로 확인하려면 웹 기반 NCBI BLAST 도구를 통해 정렬을 확인해야 합니다(특정 분류군의 구체적 리드는 해당 분류군 옆의 블라스트 아이콘을 클릭하여 CZID에서 NCBI BLAST로 직접 전송할 수 있습니다).

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결과

도서관 품질 관리
DNA/RNA 추출 후 추출된 DNA의 측정 농도는 일반적으로 1–10 ng/μL입니다. 그러나 추출된 RNA의 농도는 종종 pg/μL 수준이기 때문에 분광광도계로는 검출되지 않는 경우가 많습니다. 라이브러리 준비 후, 정제된 및 증폭된 cDNA와 DNA 라이브러리는 일반적으로 각각 0.5–10 ng/μL 및 10–30 ng/μL 농도를 유지합니다. 그림 2A 의 모세관 전기영동 및 전기영동도 데이터는 과분열된 cDNA 샘플 라이브러리를 보여주며, 어댑터 다이머를 포함하고 있습니다. 풀링 및 시퀀싱 전에 어댑터 다이머는 0.8배 자기 비드 대 샘플 비율을 사용하여 추가 비드 정화 과정을 통해 제거해야 합니다. 반면, 그림 2B 의 데이터는 어댑터 다이머 오염이 심하지 않은 고품질 cDNA 라이브러리를 보여주며,...

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토론

원하는 시퀀싱 깊이, 사용되는 시퀀싱 플랫폼, 품질 관리 장비 가용성에 따라 이 프로토콜에 변경이 필요할 수 있는 중요한 고려사항이 있습니다. 그럼에도 불구하고, 여기 제시된 두 대표 코호트는 광범위한 실험 조건에서 강인한 병원체 검출이 가능함을 보여줍니다. 구체적으로, 코호트 B는 여러 비용 절감 조치—얕은 깊이 시퀀싱, ERCC 대조군 제외, 프로토콜의 소형화, 그리고 전통적인 젤 전기영동(바이오분석기나 테이프스테이션 대신)을 품질 관리에 사용한 것—에도 불구하고 샘플에서 다양한 신경침습 병원체가 여전히 검출되었음을 입증했습니다.

프로토콜 기간 중 성공 가능성을 극대화하기 위해 여러 중요한 단계와 고려사항이 있습니다. 추출 과정(특히 DNA/RNA 쉴드 첨가 전)에는 원치 않는 RNA 분해를 방지하기 위해 효율적으로 작업하는 것이 중요합니다. 라이브러리 준비의 여러 단계에서 혼합물을 완전히 혼합하여 균질화를 보장하고...

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공개 사항

M.R.W.는 로슈/제넨텍, 노바티스, 카이버나 테라퓨틱스로부터 별도의 연구 보조금을 받고 있으며, 델브 바이오(Delve Bio Inc.)의 창립자이자 이사회 멤버입니다. 그는 화이자, 버텍스 파마슈티컬스, 오로 메디신스, 인댑타 테라퓨틱스에 컨설팅 서비스를 제공했습니다.

감사의 글

이 연구는 국립보건원(NIH) 포가티 국제센터의 지원 D43TW009343번 지원으로 지원받았습니다. 지난 수년간 다양한 연구 응용 분야를 위한 mNGS 프로토콜 개발과 최적화에 기여해 주신 윌슨 연구실, UCSF, CZI의 많은 연구진들께 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.2mL PCR 튜브 스트립에펜도르프30124359
1.5 mL DNA 로바인드 튜브에펜도르프30108051
1.5 mL 안전 잠금관에펜도르프30120191
ERCC RNA 스파이크인 믹스써모피셔4456740
고감도 D1000 시약애질런트5067-5585
Invitrogen Collibri 라이브러리 앰프 마스터 믹스써모피셔A38539050
마스터사이클러 x50써모피셔6311000010
일루미나용 NEBNext 멀티플렉스 올리고뉴잉글랜드 바이오랩스7335S/L
NEBNext 울트라 II DNA 라이브러리 준비 키트뉴잉글랜드 바이오랩스E7645
일루미늄용 NEBNext 울트라 II RNA 라이브러리 준비 키트뉴잉글랜드 바이오랩스E7770
NextSeq 500/550 하이 출력 키트 v2.5 (150 사이클)일루미나20024907
넥스트세퀀스 550일루미나해당 없음
QIAseq FastSelect -rRNA HMR 키트퀴아겐334386
Qubit 1X dsDNA 고감도 분석 키트큐비트Q33230
큐비트 4 형광도계써모피셔해당 없음
퀵DNA/RNA 마이크로프렙 플러스 키트  자이모D7005
테이프스테이션 4150애질런트G2992AA

참고문헌

  1. Chiu, C. Y., Miller, S. A. Clinical metagenomics. Nat Rev Genet. 20 (6), 341-355 (2019).
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