이 프로토콜은 저투입 마우스 대변 샘플에서 단쇄 지방산을 유도 없이 분리하는 2상 산-용매 추출 방법을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
이 글은 저투입 쥐 대변 샘플에서 단쇄 지방산(SCFA)을 추출하는 프로토콜을 2상 산-용매 추출 전략으로 설명합니다. 이 방법은 약 20–50mg의 개별 대변 투입을 위해 설계되었으며, 희석된 염산과 에틸 아세테이트를 사용하여 유도화 없이 상 분리를 가능하게 합니다. 이 프로토콜은 대변 균질화, 산성화, 유기 용매 분배, 저온 원심분리로 구성되며, 연구실에서 흔히 구할 수 있는 표준 실험실 장비를 사용하여 수행할 수 있습니다. 추출 후, SCFA는 일상적인 가스 크로마토그래피 기반 플랫폼에서의 후속 분석에 적합합니다. 프로토콜의 성공적 실행은 개별 마우스 샘플에서 아세테이트, 프로피오네이트, 부티레이트 등 주요 대변 SCFA에서 입증된 특징적인 보존 시간에서 명확히 해소된 SCFA 피크를 감지함으로써 나타난다. 이 프로토콜은 제한된 샘플 물질에서 대변 SCFA 추출을 위한 표준화된 워크플로우를 제공하면서도 일상적인 분석 워크플로우와의 호환성을 유지함으로써 소동물 연구에서 흔히 발생하는 절차적 문제를 해결합니다.
서론
이 프로토콜은 저투입 마우스 대변 샘플에서 단쇄 지방산(SCFA)을 추출할 수 있도록 개발되었으며, 이는 일상적인 가스 크로마토그래피(GC) 기반 분석과 호환되는 형식입니다. SCFA는 6개 미만의 탄소 원자를 가진 휘발성 유기 지방산으로, 주로 아세트산, 프로피온산, 부티르산 등이 포함되며, 소화되지 않는 식이섬유를 통해 장내 미생물군에서 생성됩니다. 대변 물질이 제한적이고 행동, 대사, 생리적표현형과 연관된 소동물 연구에서 개별 마우스의 대사산물을 정량화하는 것이 자주 필요합니다. 따라서 동물별 SCFA 측정에 의존하는 실험 설계를 지원하기 위해서는 실용적이고 저투입 추출 워크플로우가 필요합니다.
기존 대변 SCFA 분석법에는 여러 방법론적 제약이 존재합니다. SCFAs의 휘발성, 낮은 함량, 생물학적 매트릭스의 복잡성 때문에 대변 샘플에서 SCFA를 정량하는 것은 여전히 분석적으로 어려운 과제입니다7. 표준 워크플로우는 파생화 단계, 대용량 샘플, 자동 액체 취급, 특수 균질화 플랫폼, 고체 추출 컬럼 8,9,10,11과 같은 특수 장비를 요구하는 경우가 많습니다. 이러한 요구사항은 특히 동물당 대변 배출량이 최소하고 종단 또는 유전자형 특이적 샘플링이 흔한 쥐 연구에서 접근성과 확장성을 제한할 수 있습니다 12,13,14. 그 결과, 소량의 분변 투입물에서 SCFA를 유도화 없이 추출할 수 있으면서도 표준 가스 크로마토그래피 워크플로우와 호환되는 프로토콜에는 방법론적 격차가 남아 있습니다.
여기서 설명한 프로토콜은 희석된 염산과 에틸 아세테이트를 이용한 2상 산-용매 추출 전략을 사용하여 이 공백을 해결합니다. 작업 흐름은 대변 균질화, 산성화, 유기 용매 분배, 저온 원심분리로 구성되며, 작은 대변 투입량으로 작동하도록 설계되었습니다. 추가 화학적 변형 단계나 특수 샘플 준비 플랫폼이 필요한 유도체 기반 워크플로우와 달리, 이 프로토콜은 표준 실험실 장비를 이용한 일상적인 GC 기반 분석과 호환되는 형식으로 SCFA를 직접 추출할 수 있게 합니다.
이 방법은 제한된 양의 쥐 대변 물질에서 SCFA 추출이 필요한 연구, 특히 개별 단위 측정이 필요하거나 샘플 가용성이 실험 설계에 제약을 주는 경우에 적합합니다. 이 방법은 대변 샘플에서 흔한 SCFA(C2–C6)의 GC 기반 분석에 적합하지만, 유도화 의존적 검출, GC 감도를 초과하는 초미량 정량, 전신 SCFA 농도 평가가 필요한 응용에는 적합하지 않습니다.
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프로토콜
미국 매사추세츠주 보스턴에 위치한 매사추세츠 제너럴 브리검(MGB) 동물 상임위원회는 사용된 동물 수를 최소화하기 위해 설계된 이전 동물 프로토콜을 승인했습니다. 이 프로토콜은 미국 국립보건원(NIH) 지침과 규정을 준수합니다. 이 원고는 ARRIVE 지침에 따라 작성되었습니다. 프로토콜 다이어그램은 그림 1에 나타나 있으며, 필요한 재료는 재료표에 나열되어 있습니다.
그림 1: 프로토콜 다이어그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
1. 대변 샘플 수집 및 준비
- 신선한 대변(~30 mg) 샘플을 별도의 1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브에 채취하세요. 각 샘플의 정확한 대변 투입량을 기록하여 SCFA 농도를 정확히 정규화할 수 있도록 하세요.
참고: 각 샘플에 대해 깨끗한 바이알, 장갑, 핀셋을 반드시 포함하세요. 모든 유리기구와 악기는 사용 전에 반드시 오토클레이션되어야 합니다. 이 프로토콜은 샘플당 약 20–50 mg의 대변 입력량에 대해 검증되었으며, 대표적인 입력으로 ~30 mg을 사용했습니다. 추출량은 이 범위 내에서 일정하게 유지됩니다. - 샘플에 맞는 원심분리기 바이알 수를 배치하고 라벨을 붙입니다.
- 희석된 염산(0.5 M; pH 1–2)을 초순수수에 천천히 첨가하여 조제합니다.
주의: HCl은 부식성이 있습니다; 피부, 눈, 호흡기에 심한 화상을 입힐 수 있습니다. 흡입하기 위험합니다. - 샘플을 실온에서 30–45분 또는 완전히 해동할 때까지 해동합니다.
2. 샘플 균질화 및 산성
- 각 원심분리기 바이알에 0.5 M HCl 용액 255 μL을 추가합니다.
- 새 바이알을 가져와서 70% 에탄올을 채워서 핀셋 청소용으로 사용하세요. 핀셋을 에탄올에 담갔다가 깨끗한 종이 타월 위에 말려서 청소하세요.
주의: 에탄올은 가연성이며 피부와 눈을 자극할 수 있습니다; 증기 흡입은 어지러움을 유발할 수 있습니다. - 공개를 용기에 넣고 70% 에탄올을 채워 모든 공이 완전히 잠길 때까지 에탄올 욕조를 설치하세요.
- 샘플 박스에서 올바른 샘플을 가져와. 바이알 뚜껑을 열고 대변 샘플 1개(~ 30mg)를 제거하세요.
- 대변 샘플을 해당 원심분리기 바이알에 넣으세요.
- 모든 샘플을 올바른 원심분리기 바이알에 넣으면, 에탄올 욕조에서 공을 제거하세요. 공을 깨끗한 종이 타월로 말리세요.
참고: 각 샘플마다 새 공을 사용하세요. - 공개를 사용해 배설물 샘플을 적절히 으깨고 녹이세요, 그림 2 참조. 분변 샘플을 분쇄하여 눈에 띄는 고체 조각이 없는 균일한 현탁액이 나올 때까지 분쇄합니다.
그림 2: 공자로 대변 샘플을 갈아 내는 모습.새로 채취한 대변은 SCFA 분석을 위해 균일한 농도를 만들기 위해 갈아집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
- 사용한 공은 나중에 세척할 수 있도록 빈 상자에 넣으세요.
- 펄스형 소용돌이 믹서를 최대 속도로 10초간 소용돌이로 시료를 소용돌이로 만들고, 튜브는 단단히 덮여 있습니다.
참고: 원심분리기 바이알은 혼합물이 흘러나가지 않도록 단단히 덮어야 합니다.
3. SCFA 추출 및 상 분리
- 샘플을 16,000 × g 에서 4°C에서 10분간 원심분리하여 원심분리기의 적절한 균형을 확보합니다.
- 원심분리기를 작동시키면 샘플에 해당하는 새 원심분리기 바이알에 라벨을 붙입니다. 원심분리가 완료되면 샘플을 원심분리기에서 꺼내세요.
- 200 μL 피펫을 120 μL로 설정하세요. 원심분리 후 펠릿 교란을 피하면서 120 μL의 수성 상원액을 조심스럽게 수집하세요. 상청액을 새로 라벨링된 원심분리기 바이알로 옮기고 펠릿을 버립니다.
- 상상액과 함께 새로 표시된 바이알에 같은 양(120 μL)의 에틸 아세테이트를 추가합니다. 이 작업을 모든 샘플에 대해 반복하세요.
주의: 에틸 아세테이트는 가연성이 있으며 피부, 눈, 호흡기를 자극할 수 있습니다. 증기 흡입과 장시간 접촉을 피하세요. - 샘플을 다시 원심분리기로 옮겨. 원심분리기가 적절히 균형을 잡고 로터 뚜껑이 단단히 고정되어 있는지 확인하세요. 2,374 × g 에서 4 °C에서 20분간 돌립니다.
- 원심분리 후에는 하부 수용상을 교란하지 않고 상부 유기 상 120 μL을 조심스럽게 수집합니다. 추출한 SCFA 함유 상청액을 새로 라벨이 붙은 원심분리기 바이알로 옮깁니다.
참고: 수집된 부피는 120 μL 미만일 수 있습니다. 계면에 유제가 있다면 원심분리를 연장하거나 시료를 얼음 위에 냉각하여 상이 분리될 때까지 진행하세요. 대변 물질 없이 병렬로 처리되는 절차적 빈 샘플은 시약이나 취급으로 도입된 SCFA의 배경 수준을 평가하기 위한 선택적 품질 관리 단계로 포함될 수 있습니다. - 이전 바이알을 점검하여 아래층이 실수로 뽑히지 않았는지 확인하세요.
참고: 산성 첨가와 유기 용매 취급 단계는 휘발성 또는 증발 손실을 최소화하기 위해 가능한 한 튜브를 덮어 신속하게 수행해야 합니다.
4. 추출물 취급 및 저장
- 추출 상자를 찾아 적절히 라벨을 붙인 후, 추출한 샘플을 그 안에 넣으세요.
참고: 유기 상 채취 후 추출물을 −20 °C에서 최대 24시간 동안 뚜껑이 씌워진 튜브에 보관한 후 장기 보관을 위해 −80 °C로 옮겨 안전하게 일시정지할 수 있습니다. - 상자를 -80°C 냉동고에 넣어 SCFA 분석을 기다리세요.
참고: 에틸 아세테이트와 SCFA는 모두 매우 휘발성이 높기 때문에, 추출된 샘플은 −80 °C에서 저장 후 신속히 분석해야 합니다. 장기 보관은 샘플 무결성을 저해할 수 있습니다.
5. 가스 크로마토그래피 분석
- GC로 추출한 SCFAs를 30, 300, 20 mL/분의 유량으로 각각 30, 300, 20 mL/분의 유량으로 분석합니다. 분석을 위해 유기 추출물 1 μL 알리코트를 주입합니다.
- 정량적 응용의 경우, 앞서 설명한 내부 표준 및 교정 절차(예: 2-에틸부티르산)를 포함하세요.
참고: 자세한 기기별 설정은 참고된 방법14에 제공되어 있습니다.
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결과
위 프로토콜은 추출된 대변 샘플 수에 해당하는 120 μL 추출된 SCFA 알리코트를 얻었을 것입니다. 추출 프로토콜의 성공적 실행은 신호 강도가 배경 잡음보다 높은 특성적 보존 시간에서 명확히 해소된 SCFA 피크의 존재로 표시됩니다. 설명한 대로 수행하면, 프로토콜은 샘플 간 정량적 비교에 적합한 대변 SCFA 프로필을 생성합니다. 우리는 8가지 SCFA를 정량화했습니다: 아세트산, 프로피온산, 부티르산, 이소부티르산, 발레릭산, 이소발레릭산, 헥사노산, 그리고 2-에틸부티르산(내부 표준)(그림 3)2.
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토론
이 프로토콜은 소량 마우스 대변 샘플에서 SCFAs를 효율적이고 재현 가능하게 추출할 수 있도록 여러 중요한 단계를 포함하고 있습니다. 이 프로토콜은 희석된 염산과 에틸 아세테이트의 정해진 양을 이용한 2상 산-용매 추출 시스템을 사용하며, 이는 저분자량 약한 유기산으로서의 SCFA의 물리화학적 특성에 맞춰 조정되어 있습니다. 산성화는 SCFA를 양성자 형태로 전환시켜 대변 기질과의 이온 상호작용을 줄이고 이후 상 분리 시 분배를 촉진합니다. 저온 원심분리와 표준화된 소용돌이 분석을 도입하여 효과적인 상 분리를 촉진하면서 이들 화합물과 관련된 휘발성 손실을 최소화합니다. 철저한 균질화와 제어된 와류 혼합을 결합하면 균일한 샘플 분산이 보장되며, 이는 매트릭스 관련 SCFA를 방출하고 샘플 전반에 걸쳐 일관된 추출을 달성하는 데 필수적입니다. 또한, 고정된 마이크로 부피 이동과 정의된 유기상 수집은 유도자별 변동성을 유도하거나 특수 계측 장비 없이 감소시킵니다. 이 단계...
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공개 사항
저자들은 이해 상충을 선언할 필요가 없습니다.
감사의 글
국립보건원(NIH)이 장이잉에게 R21AG065606 및 R21AG08176을 통해 제공한 연구비 지원과 보튼 가문 재단, 탕 가문의 장이잉 기부에 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 원심분리기 | ThermoFisher | 75003424 | "Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge" |
| 원심분리기 바이알 | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 마이크로튜브 랙 | Millipore Sigma | HS29025F-5EA | |
| 에틸 아세테이트 | ThermoFisher | 022912.K2 | HPLC Grade, ≥99.5% |
| 녹색 페스틀 | Fisher Scientific | 50-189-9195 | |
| HCl | Fisher Scientific | SA49 | ACS 인증 (10 N, 스톡 용액); 사용을 위해 0.5 M으로 희석 |
| 1000 µL 피펫 | USA Scientific | 7110-1000 | |
| 1000 µL 피펫 팁 | USA Scientific | 1111-2821 | |
| 에탄올 | Fisher Scientific | BP82011 | 분자 생물학 등급, 70% 용액 |
| 200 µL 피펫 | USA Scientific | 7100-2200 | |
| 200 µL 피펫 팁 | USA Scientific | 1110-1800 | |
| 핀셋 | ThermoFisher | 046638.KT | |
| 보텍스 | Fisher Scientific | 50-136-7909 | "Research Products International Corp VORNADO Miniature Vortex Mixer, Purple Cup" |
참고문헌
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- Zhou, H., et al. Glia-to-neuron conversion by CRISPR-CasRx alleviates symptoms of neurological disease in mice. Cell. 181 (3), 590-603.e16 (2020).
- Zhao, G., Nyman, M., Jönsson, J. A. Rapid determination of short-chain fatty acids in colonic contents and faeces of humans and rats by acidified water-extraction and direct-injection gas chromatography. Biomed Chromatogr. 20 (8), 674-682 (2006).
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