형광 추적체를 이용한 마우스 치은성 상피 장벽의 기능 평가

Summary

이 프로토콜의 목표는 다양한 분자 크기의 형광 표지된 덱스트스트란을 생 체 내 치은염 표면에 국소적으로 도포한 후, 단일 광자 현미경 시스템을 이용한 체외 영상을 통해 쥐 치은상피 장벽의 무결성을 정량적으로 평가하는 표준화된 접근법을 제공하는 것입니다.

Abstract

치은골 상피 장벽은 구강 면역과 항상성 유지에서 중요한 최전선 방어 역할을 합니다. 온전한 상피 장벽은 구강 환경에서 유해 물질의 침투를 효과적으로 방지하며, 그 붕괴는 치주염 및 구강 편평면과 같은 질환의 발병 기전과 밀접하게 연관되어 있습니다. 여기서 우리는 쥐에서 치은골 상피 장벽의 완전성을 평가하기 위한 국소 적용 기반 방법을 확립하였습니다. 먼저, 2% 카복시메틸셀룰로오스나트륨에 각기 다른 분자량(40 또는 70 kDa)의 형광 표지된 덱스트랜스 혼합물을 어금니 부위의 순순 치은부에 국소적으로 적용하였다. 30분간의 잠복 후 상악골을 해부하여 맞춤형 홀더에 고정하여 단일 광자 현미경 시스템을 이용한 즉각적인 영상 촬영을 수행했습니다. 이 접근법은 상피층 전반에 걸쳐 다양한 크기의 트레이서를 시각화하고 정량화할 수 있게 하여, 구강 염증, 상처 치유, 질병 모델링 연구에 적용할 수 있는 치은골 상피 장벽의 무결성을 기능적으로 측정할 수 있게 합니다.

Introduction

치은상피 장벽은 구강 내에서 중요한 방어 인터페이스로, 물질 수송을 선택적으로 조절하여 조직의 완전성을 유지하면서 미생물 침입을 방지합니다^1. 층이 분리된 편평상피가 촘촘한 접합 복합체로 서로 연결되어 있는 이 동적 구조는 세포 간 투과성을 정밀하게 조절하여 미생물, 고분자 및 용질의 비선택적 침투를 제한합니다². 여러 요인이 치은염 장벽의 완전성을 손상시킬 수 있습니다. 구강은 인체에서 두 번째로 다양한 미생물 군집을 보유하고 있으며, 700종 이상의 박테리아가 치아 표면, 잇몸 틈새, 구강 점막 ^3,4에 서식합니다. 치은조직을 덮고 있는 상피세포는 이 밀집된 미생물 환경에 지속적으로 노출되어 있습니다⁵.

치주 병원체(예: 포르피로모나스 치지발리스)가 분비하는 병원성 인자, 특히 지포다당류는 상피 장벽 기능을 교란하여 치은염 조직의 염증 반응을 유발하고 병리학적 진행을 촉진하는 것으로 나타났습니다 ^6,7. 염증 매개체와 기계적 스트레스 요인은 장벽 기능 장애를 더욱 악화시켜 구강 질환에 대한 감수성을 높인다⁸. 경구 프로바이오틱스는 치은골 상피 장벽의 안정성을 촉진하여 치주 질환 예방에 도움을 줄 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 미생물과 치은상피세포 간의 장벽 조절 상호작용에 대한 생물학적 상호작용은 여전히 대부분 밝^{혀지지 않았습니다}. 따라서 상피 장벽 기능을 신뢰할 수 있는 평가 방법 개발이 매우 중요합니다.

단광자 레이저 주사 현미경은 고해상도와 확립된 검출 시스템으로 인정받아 특히 체외 조직 샘플 검사에 유용하게 입증되었습니다¹⁰. 첨단 영상 기법은 잇몸 장벽 특성 평가를 크게 향상시킵니다. 상피세포가 표면에서 약 100μm 떨어진 곳에 위치한 치은골 조직의 표면적 특성은 이러한 영상 접근법에 이상적으로 적합합니다. 우리 연구는 다양한 분자량의 형광 표지된 덱스트랜스를 세포 투과성 추적자로 활용하여 체 외 평가 기법을 확립했습니다. 단광자 레이저 주사 현미경과 결합하여 이 방법은 치은골 상피 장벽 기능을 정량화하여 치주 질환의 기전과 잠재적 치료 개입에 대한 통찰을 제공합니다.

본 연구에서 확립된 프로토콜은 국소화된 젤 기반 추적자 전달과 3차원 체외 영상 촬영을 결합하여, 치은상피 장벽 평가의 독특한 도전 과제를 해결하기 위해 특별히 최적화되어 있습니다. 첫째, 기존의 정맥 주사 추적자 주입 방법(표 1)은 국소화된 미세 상피 부위의 외부 물질에 대한 투과성을 정확히 평가하지 못합니다¹¹. 둘째, 전통적인 조직학적 접근법은 탈석화와 절절 작업을 필요로 하는데, 이는 조직 구조를 방해하고 노동 집약적이고 시간이 많이 소요됩니다 12,13,14. 반면, 저희 프로토콜은 복잡한 국소 표면에서 효과적인 추적자 고정을 위해 고접착성 젤을 사용합니다. 더 나아가 3D 이미지를 통해 산상피 내 추적자 침투 깊이와 분포를 정확하고 비파괴적으로 정량화하여 조직의 공간적 구조를 완전히 보존합니다. 따라서 이 방법은 복잡하고 제한된 구강 환경에서 치은상피 장벽 기능을 고해상도로 시공간적으로 평가하는 데 특히 적합합니다.

Protocol

모든 실험 절차는 베이징대학교 보건과학센터 동물 연구 윤리 위원회의 승인을 받았으며, 실험동물 관리 및 사용 가이드(NIH 간행물 번호 85-23, 1996년 개정)를 준수하였습니다. 이 과정에서 실험 동물들은 통증과 불편함을 최소화하기 위해 신중하게 치료받았습니다.

마우스 치은상피에서 생 체 내 투과성 평가를 위한 각 작업 단계의 세부 사항은 아래에 설명되어 있습니다(그림 1A). 여기서는 연결과 Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis) 유도 마우스 치주염 모델에서 상피 장벽 기능을 검출한 사례를 제시했습니다. 모든 직원은 실험실 동물 복지와 멸균 기술에 대한 종합 교육을 받았습니다.

1. 동물 취급

1. 연구 전반에 걸쳐 표준 특정 병원체 없는(SPF) 조건과 12시간 빛/어둠 주기 하에 사육동물을 제공하고 자유롭게 음식과 물을 제공한다.
2. 마취제 및 추적제 제조 및 투여
   1. 프로토콜 기간 내내 멸균 상태를 유지하고, 75% 에탄올로 세척된 도구를 사용하세요.
   2. 실험에는 8-10주 성체 연령대의 수컷 야생형(WT) C57BL/6J 마우스를 사용한다. 쥐를 세 그룹으로 나누는데, 대조군(치료되지 않음)과 두 실험군(결찰 및 P. gingivalis 유도 마우스 치주염 모델)입니다.
      참고: 그룹화할 때는 나이와 체중이 잇몸 상피 투과성에 미치는 영향을 줄이기 위해 체중과 주령이 비슷한 쥐를 선택해야 합니다. 결속 유도 및 P. gingivalis에 의한 마우스 치주염 모델은 일반적으로 사용되는 치주염 마우스 모델입니다. 상세한 모델링 프로토콜은 연결로 유도된¹⁵ 및 P. gingivalis에 의해^{유도된 쥐} 치주염 모델 문헌을 참고하시기 바랍니다.
   3. FITC 표지된 덱스트란(40 kDa; FD40) 및 로다민 B 표지된 덱스트란(70 kDa; RD70)을 사용하여 대응하는 FITC 및 로다민 필터를 사용하여 뚜렷한 신호 검출을 보장합니다.
   4. 추적자를 희석하세요. 이 프로토콜을 따르기 위해 FD40(1 g/L)과 RD70(1 g/L)을 2% 카복시메틸셀룰로오스 젤에 혼합하여 4 °C에서 보관합니다.
   5. 복강 내 주사로 1.25% 트리브로모에탄올(체중 200 mg/kg, 체중 15-17 μL/g)을 주사하여 쥐를 마취합니다.
      참고: 트리브로모에탄올 용액은 빛에 민감합니다. 테르트-아밀 알코올은 가연성, 휘발성 및 자극성 유기 용매입니다. 준비, 취급, 투여와 관련된 모든 절차는 반드시 화학 연기 후드나 매우 잘 통풍되는 장소에서 이루어져야 하며, 점화원에서 철저히 떨어져 있어야 합니다. 직원은 장갑, 화학 방화 고글, 실험복 등 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용해야 합니다. 폐기물 처리: 폐기물 트리브로모에탄올 용액, 삼아밀 알코올, 그리고 모든 오염된 용품(예: 주사기, 피펫 팁, 장갑)은 기관의 환경 보건 및 안전(EHS) 규정과 가연성 및 독성 화학물질 프로토콜에 엄격히 따라 유해 화학 폐기물로 수집 및 폐기되어야 합니다.
3. 마취 중에는 피드백 제어 온열 패드를 사용해 체온을 37± 0.5 °C로 유지하세요. 각막 건조를 방지하기 위해 에리스로마이신 눈 연고를 바르세요.
   참고: 연구 기간 동안 모든 동물에게 적절한 치료를 제공하세요.
4. 수술 후에는 동물을 따뜻하고 조용한 회복 케이지에 단독으로 두어 완전히 움직일 때까지 보관하세요. 동물을 하루 두 번 48시간 동안 관찰하고, 정상적인 자세, 활동, 먹이 행동을 평가한 후 완전히 회복한 후에야 다시 집 우리에 다시 들여보내세요.
5. 구강을 입 개그로 벌린 채 5 μL에서 50 μL 양의 두 개 이상의 분자량 준투과성 추적자를 대금구석 구순 치은골 표면에 국소적으로 바르세요(그림 1B). 30분 정도 떠나세요. 동물이 혼합물을 삼키면 다시 발라주세요.
6. 상악골 분리
   1. 투과성 추적자를 30분 동안 적용한 후, 쥐를 판지 위에 고정시키고 등을 대신하게 한 뒤 팔다리를 테이프로 감습니다.
   2. 고정 후에는 구강을 열어 상악골을 분리합니다. 주변 조직을 부드럽게 제거하고 PBS로 표본을 꼼꼼히 헹구세요.
   3. 상악골을 유리 슬라이드 위에 올려놓고, 양쪽에 모델링 점토를 배치해 샘플 위에 커버슬립을 안전하게 부착할 수 있게 합니다.

2. 단일 광자 현미경 설치

1. 해리된 마우스 상악골을 맞춤 설계된 샘플 홀더에 조심스럽게 위치시켜 영상 촬영을 위한 안정적인 위치를 확보하세요.
2. 25×/NA 1.0 수중 물에 담긴 대물렌즈가 장착된 직립형 단광자 현미경을 사용하여 상악골 아래에 장착된 지지 영역에 초점을 맞추어 이미지를 획득합니다.
   참고: 추적자 젤을 제거한 직후 형광 신호가 보여야 합니다.

3. 상악 영상

1. 상악 내 두 번째 어금니의 구강면에서 관심 있는 부위를 선택한 후 즉시 영상 촬영을 시작하세요.
2. 상악치은면에서 시작해 깊이 100-200 μm까지 1μm 단계의 Z-스택 이미지를 획득하여 3차원(3D) 재구성을 수행합니다.
3. 상악골의 상피 장벽 투과성을 평가하기 위해 Z 시리즈 영상을 수행하세요. 참조된 소프트웨어에서 소프트웨어 매개변수를 다음과 같이 설정하세요:
   1. 파일 메뉴에서 새 폴더를 만들고 데이터셋에 대한 설명 이름을 할당하세요.
   2. 획득 탭에서 XY 포맷을 512 × 512, 해상도 0.99 μm/픽셀로 설정하세요.
   3. 줌 팩터를 1로 설정하세요.
   4. 여기 파장을 488 nm(FD40)와 561 nm(RD70)로 설정하고, 방출 창은 각각 500-550 nm와 570-620 nm로 설정합니다.
      참고: 게인 값은 각각 50(488nm)과 60(561nm)로 설정되었습니다.
   5. Z 시리즈 및 3D 이미징을 위해서는 ND 획득 모드를 선택하세요. Z-스텝 을 1 μm 으로 설정하세요(필요에 따라 조정).
4. 매개변수가 설정되면, 라이브 모드를 선택하여 영상 창 내 개별 및 합쳐진 형광 채널에서 치은골 부위를 시각화합니다.
5. 매개변수 설정 후 획득을 시작하려면 '지금 실행' 을 클릭하세요.

4. 투과성 측정

1. FD40과 RD70의 형광 강도를 서로 다른 채널로 나누세요. 배경 뺄셈은 필요하지 않습니다; Z축 슬라이스를 병합합니다. 그 후 ImageJ 소프트웨어를 사용해 형광 강도를 계산하여 투과성을 평가하고 상피 장벽 기능을 나타냅니다.
   1. 파일을 클릭하고 열기를 선택해 단광자 현미경으로 촬영한 상악 사진을 엽니다.
   2. 이미지 메뉴로 가서 분석 위해 이미지 유형을 8비트 형식으로 변경하세요.
      참고: 형광현미경과 공초점 시스템으로 촬영된 이미지는 일반적으로 RGB 형식이며 형광 강도 측정에 직접 사용할 수 없습니다. 개별 채널로 나누거나 흑백 이미지를 직접 가져와야 합니다.
   3. 분석 메뉴를 열고 측정값 집합을 선택한 후 면적, 평균, 기준을 체크하세요. 확인 버튼을 눌러 확인하세요.
   4. 분석할 채널을 선택하고 임계값을 조정하세요: 이미지로 이동 | 조정 | 임계점. 시스템은 기본적으로 기본값과 알고리즘을 자동으로 적용하며, 일반적으로 빨간색을 사용해 선택한 영역을 표시합니다.
      참고: 형광 이미지는 일반적으로 검은 배경을 가지므로, 어두운 배경 옵션도 선택하세요.
   5. 측정 매개변수 설정: 분석 으로 이동하여 측정값 설정을 선택하세요. 대화 상자에서 평균 회색값 과 임계값 제한을 체크하세요. 마지막으로, 확인 버튼을 누르세요.
      참고: 결과 표에 이미지 이름이 나타나도록 디스플레이 라벨 을 확인하는 것이 실험 그룹을 더 쉽게 식별할 수 있도록 하는 것이 권장됩니다.
   6. 측정 수행: 자유손 선택 도구를 선택하세요. 커서를 사용해 치은조직 쪽의 형광 신호 영역 윤곽을 수동으로 정밀하게 따라 그려보세요. 분석 클릭 | 측정. 결과 표가 나타나며, IntDen 은 형광 강도를 나타냅니다.
2. 결과를 스프레드시트에 복사해 계산하고, 그래프를 위해 가져오기로 하세요.
3. 상대형광강도 계산: 먼저, 대조군의 평균 형광 강도를 계산합니다. 그 다음 각 실험군의 형광 강도 값을 대조군 평균으로 나누어 상대 형광 강도를 구합니다.

Results

표준화된 프로토콜에 따르면, 치은염 조직을 포함한 마우스 상악골은 맞춤 설계된 홀더에 장착되었습니다(그림 1C). 현미경 검사 결과 치은골에서 녹색(FD40)과 빨간색(FD70) 형광 신호가 발견되어 상피 장벽을 통한 추적자 투과가 확인되었습니다. 눈 렌즈 아래에서 관심 영역을 확인한 후, 소프트웨어를 사용해 이미지를 촬영했습니다. 대조군에서는 두 형광 추적자가 주로 치은골 표면에 국한되어 있었습니다. 소량의 FD40과 RD70이 치은골 상피를 통해 침투하여 미세구조적 특징을 명확히 드러냈다. 결찰군과 P. gingivalis 치료 그룹 모두에서 FD40과 RD70이 잇몸 상피로 유의미하게 유일하게 침투되는 것이 관찰되었으며(그림 2A), 이는 잇몸 상피 장벽을 통한 추적자 전위가 현저히 증가함을 나타내며, 치주염 중 잇몸 상피 장벽 기능이 교란되...

Discussion

치은상피는 박테리아 침입에 대한 필수적인 물리적 장벽 역할을 하며, 구강 미생물은 병원성 인자로 장벽의 무결성을 방해하거나 유지를 촉진함으로써 이중 조절 능력을 보입니다. 이러한 생물학적 상호작용은 궁극적으로 조직의 항상성 또는 질병 진행을 결정합니다^17,18. 이러한 기반 위에 우리는 이러한 메커니즘을 더 깊이 탐구하기 위한 혁신적인 방법론적 접근법을 개발했습니다. 이 기법은 국소 추적자 적용과 단일 광자 현미경 영상을 결합하여 마우스 치은골 상피 장벽 기능을 정량적으로 평가할 수 있는 실험 시스템을 만듭니다. 표준화된 운영 절차와 정량적 분석 방법의 도입은 구강 점막 장벽 조사의 정밀도와 재현성을 크게 향상시킵니다.

이 방법에는 여러 중요한 프로토콜 단계가 있습니다. 먼저, 주요 절차 순서는 2% 카복시메틸셀룰로...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
40 kDa FITC-labeled dextran	Sigma Aldrich	78331
70 kDa rhodamine B-labeled dextran	Sigma Aldrich	R9379
Blunt tissue separation nickel	Beijinghuabo Company	NZW28
carboxymethylcellulose	MREDA	M049898
Disposable sterile syringe	Zhiyu Company		1 mL
ImageJ 소프트웨어	National Institutes of Health
Microtubes	Axygen	MCT-150-C	1.5 mL
NIS-Elements AR 이미지 소프트웨어	Nikon
Phosphate buffered saline 1x	Servicebio	G4207-500
Single photon microscope Nikon A1 MP+	Nikon
Tissue scissors	Beijinghuabo Company	M286-05