탄시논-IIA는 쥐 심외부 지방 조직에서 IL-33/ST-2 신호 변화를 통해 심근경색 후 심섬유증을 감쇠하는 매개

요약

이 연구는 Tanshinone IIA(Tan IIA)가 동물 모델과 분자 도킹에서 확인된 바와 같이, IL-33/ST2 조절을 통해 심근경색 후 섬유증을 완화한다는 것을 보여주며, ELISA와 웨스턴 블롯으로 검증되었습니다.

초록

심근경색(MI)은 심상동맥질환의 한 형태로, 종종 심근섬유증을 유발하며, 이는 심장 기능 장애와 심부전의 주요 원인입니다. 심외부 지방 조직(EAT)은 사이토카인 매개 심장 기능 조절을 통해 심혈관 병리에 점점 더 관여하고 있습니다. 탄시논 IIA(TanIIA)는 살비아 밀티오리자에서 유래한 지성 화합물로, 항염증, 항산화, 항섬유화 특성을 보입니다. 본 연구는 TanIIA가 심근근섬유증 후 심근섬유증을 완화하는 치료 잠재력을 평가하고, 체내 실험과 사리코 분석을 결합한 통합적 접근법을 통해 그 기전을 탐구하는 것을 목표로 했습니다. 마우스 MI 모델이 구축되었고, 분자 도킹을 통해 TanIIA가 인터루킨-33/성장 자극 발현 유전자 2(IL-33/ST2) 신호 전달 경로의 핵심 성분에 결합하는지 평가하였습니다. 연구 결과는 TanIIA 치료가 심장 기능을 유의미하게 향상시키고 조직학적 손상을 감소시키며 심근섬유증을 완화했으며, N-말단 전뇌 나트리이뇨 펩타이드(NT-proBNP)와 고민감도 심장 트로포닌 I(hs-cTnI)의 혈청 수치를 감소시켰음을 보여주었습니다. TanIIA는 혈청, 심근, EAT에서 염증 반응과 산화 스트레스를 완화시켰습니다. 기전적으로 TanIIA는 IL-33과 ST2 발현을 하향 조절하고, 골수계 분화 인자 88(MyD88)/핵 인자 카파-B(NF-κB) 경로를 억제하며, 형질전환 성장 인자-β1(TGF-β1) 수준을 감소시켰습니다. 실리코 분석 결과, TanIIA는 IL-33, ST2, MyD88, NF-κB p65에 대해 강한 결합 친화력을 보였으며, ST2에 대해 가장 안정적인 상호작용이 예측되었습니다. 종합적으로 이 발견들은 TanIIA가 IL-33/ST2 축의 다중 표적 억제를 통해 EAT와 관련된 염증과 산화 스트레스를 조절함으로써 심근근섬유증을 완화한다는 것을 시사한다. 이러한 결과는 TanIIA가 경색 후 심근섬유증 관리에 유망한 치료제로 자리매김하는 것을 뒷받침합니다.

서론

심근경색은 장기간 허혈로 인한 심근세포 사망으로 병리학적으로 정의되며, 여전히 생명을 위협하는 심혈관 사건¹입니다. 재관류 전략과 약물치료의 큰 발전에도 불구하고, MI는 전 세계적으로 이환율과 사망률의 주요 원인으로 남아 있습니다 ^2,3,4,5,6. 심근경색의 주요 병태생리학적 결과 중 하나는 심근섬유증으로, 세포외 기질 단백질의 과도한 침착으로, 이는 이후 부작용 임상 결과의 주요 결정 요인입니다⁷. 이 섬유화 흉터는 심실벽 파열 예방에 필수적이지만, 종종 복잡한 염증 및 세포 간 신호 경로 ^5,7,8,9,10에 의해 시작되는 부적응적 수리 과정이 됩니다. 기능성 심근을 비수축성 흉터 조직으로 대체함으로써, 부적응성 섬유화는 심실 경직성 증가, 진행성 심장 기능 장애, 궁극적으로 심부전으로 이어집니다 ^9,11. 따라서 경색 후 섬유증을 특이적으로 표적으로 하고 완화하는 새로운 약물 치료법을 연구하는 것은 장기 환자 이환율과 사망률을 개선하는 중요한 치료 목표입니다.

전통 중국 의학인 살비아 밀티오리자(단셴)와 그 다양한 제제는 심혈관 질환 관리에 널리 사용되고 있습니다. 탄시노네 IIA는 주요 지방친화성 성분으로, 항동맥경화, 항심근 허혈, 항산화 효과 등 여러 심장 보호 특성을 가진 것으로 평가됩니다 12,13,14,15. 기전적으로 TanIIA는 다양한 신호 전달 경로를 조절하여 항염증 및 항섬유화 효과를 발휘^합니다. 특히 TanIIA는 지방세포를 직접 표적으로 하여 염증 반응을 억제하고 세포 기능 장애를 완화하는 것으로 입증되었습니다¹⁸. 그러나 이러한 TanIIA의 보호 효과가 심외부 지방 조직까지 확장되는지는 아직 밝혀지지 않았습니다.

독특한 내장 지방 저장소인 심외막 지방 조직은 관상동맥질환(CAD), 심방세동(AF), 심부전의 발병 기전과 강하게 관련이 있습니다. 심근과 심외막 내장 층 사이에 위치한 해부학적으로 근막층 없이 EAT는 인접한 심장 구조^{19, 20, 21, 22}와 직접 파라크린 소통을 촉진합니다. 생리학적 상태에서 EAT는 심장 보호 기능을 하여 대사 지원을 제공하고 항염증 및 항산화 아디포카인 20,21,23,24,25,26을 방출합니다. 반대로, 병리학적 상태에서는 EAT가 염증 촉진, 산화 촉진, 섬유화 매개 작용의 원이 되어 심장 재형성을 촉진합니다 27,28,29,30. 이에 따라 TanIIA가 새로운 신호 전달 경로를 통해 심외막 지방의 염증 반응과 산화 스트레스를 완화하여 심근섬유증을 억제할 수 있다는 가설이 제기되었습니다.

인터루킨-33은 사이토카인³¹의 IL-1 계열에 속하며, 심혈관계에서 강력한 항비대 및 항섬유화 효과로 알려져 있습니다²⁵. 그 생물학적 효과는 ST2라는 독특한 수용체 복합체를 통해 매개되며, ST2는 두 가지 아이소폼으로 존재합니다: 신호를 시작하는 막관통수용체(ST2L)와 IL-33을 격리하는 용해성 미끼수용체(sST2)입니다³². 임상적으로 혈청 sST2 수치는 심근경색(MI) 후 급성 상승하여 심부전 및 심근염의 부작용에 대한 강력한 예후 지표 33,34,35,36 역할을 합니다. 정형적인 IL-33/ST2L 신호전달 연쇄 반응은 어댑터 단백질 MyD88의 모집과 TRAF6의 활성화를 포함하며, 이를 통해 NF-κB 억제제(IκB)의 인산화 및 분해와 그 결과로 NF-κB^37,38의 핵 전위를 일으킵니다. 이 경로는 다른 주요 염증 사이토카인들과 복잡하게 연결되어 있습니다; 예를 들어, IL-33/MyD88 신호는 항염증 사이토카인 IL-10³⁹의 분비를 촉진할 수 있으며, 염증성 사이토카인 TNF-α은 NF-κB를 활성화하여 IL-33 발현을 유도함으로써 염증 반응을 증폭시킬 수 있다^40,41. 중요한 점은 IL-33과 ST2 모두 지방 조직에서 발현되며, 국소 항염증 효과를 발휘하는 것으로 여겨진다는 것입니다 31,42,43. 그러나 TanIIA의 심장 보호 효과가 IL-33/ST2 축의 조절과 관련되는지는 아직 밝혀지지 않았습니다.

따라서 본 연구는 TanIIA가 IL-33/ST2 경로를 조절하여 심외막 지방 조직에서 발생하는 염증과 산화 스트레스를 완화하여 심근섬유증을 예방한다는 핵심 가설을 검증하기 위해 설계되었습니다. 구체적으로, 우리는 이 치료 작용이 TanIIA가 이 신호 전달 연쇄 반응의 핵심 단백질과 직접 다중 표적 결합에 의해 촉진된다고 가설을 세웠습니다. 이를 검증하기 위해 우리는 이중 접근법을 채택했습니다. 첫째, 심근경색의 쥐 모델을 사용하여 TanIIA의 생 체 내 심장 재형성 완화 효능을 확인하였다. 둘째, 이러한 관찰에 직접적인 분자적 기반을 제공하기 위해 계산 도킹을 통해 TanIIA가 경로의 네 가지 주요 노드인 IL-33, ST2, MyD88, NF-κB p65에 결합할 가능성을 특성화하였습니다. 조직 수준에서 특정 분자 결합 사건에 이르는 메커니즘을 조사함으로써, 본 연구는 TanIIA의 심장 보호 효과에 대한 새로운 기전적 틀을 확립하는 것을 목표로 합니다.

프로토콜

모든 실험 절차와 동물 복지 관행은 장시 중의학대학교 윤리동물위원회의 실험동물 관리 및 사용 윤리 규정(번호)에 엄격히 따라 수행되었습니다. JZLLSC2023-0702), 중국.

분자 도킹 시뮬레이션
TanIIA와 IL-33, ST2L, MyD88, NF-κB p65 간의 직접적인 상호작용을 탐구하기 위해 인실리코 분자 도킹 방식을 사용했습니다. TanIIA의 3D 좌표는 PubChem 데이터베이스에서 얻었으며, 초기 SDF 파일은 이후 PDB 형식으로 변환되었습니다. IL-33(PDB ID: 4KC3), ST2L(PDB ID: 4KC3), MyD88(PDB ID: 7L6W), NF-κB p65(PDB ID: 1NFI)의 결정 구조는 단백질 데이터베이스에서 수집되었습니다. 수용체의 초기 처리는 PyMOL(v2.3.4)에서 수행되었으며, 여기서 물 분자와 원래의 리간드가 제거되었고, 이후 AutoDockTools에서 수소 첨가 및 전하 할당을 위한 추가 준비가 이루어졌습니다. 두 분자 모두 궁극적으로 PDBQT 형식으로 전환되었습니다. AutoDock Vina(v1.1.2)는 활성 사이트를 중심으로 정의된 격자 박스 내에서 도킹 시뮬레이션을 수행하는 데 사용되었습니다. 최적 결합 자세는 가장 낮은 결합 에너지를 기준으로 선택되었고, PLIP 웹 도구를 사용해 상세한 상호작용을 확인했습니다. 최종 도킹 구조는 PyMOL(v2.3.4)을 사용해 시각화되었습니다.

동물
수컷 스프래그-도울리(SD) 쥐, SPF 등급, 6주 되었고 몸무게 200 ± 20g (증명서 번호 SCXK(Su)2023-0009). 쥐들은 12시간의 빛과 어둠 주기, 22 °C ± 2 °C 온도를 포함한 표준화된 조건에서 유지되었습니다. 실험 기간 동안 동물들은 음식과 물에 무제한으로 접근할 수 있었습니다.

실험 프로토콜
좌전하강(LAD) 관상동맥을 결찰하여 심근경색의 쥐 모델을 구축하였습니다. 가짜 수술을 한 쥐들은 LAD 결찰 없이 동일한 수술 절차를 받았다. 간단히 말해, 쥐들은 1% 펜토바르비탈나트륨(50 mg/kg) 복강내 주사로 마취를 받았고, 이어서 기관내 삽관 및 인공호흡을 시행하였다. 심장을 노출하기 위해 왼쪽 흉강 절개술이 시행되었습니다. 그 후 LAD는 4-0 비흡수성 봉합사로 결찰되었습니다. 성공적인 심근 유도는 연속 심전도에서 ST-분절 상승과 좌심실 전벽의 가시적 백색 현상으로 확인되었습니다. 수술 후 쥐들은 3일간 세폭시틴 나트륨(200 mg/kg/d, 단일 투여)을 투여했습니다. 수술 후 24시간 후, 생존한 쥐들은 무작위로 6개 그룹(n=10명)으로 배정되었습니다:

샴 그룹: 복막 내 식염수 주사(1 mL·^kg-1·^day-1)를 받았습니다.

심근경색 그룹: 복막 내 식염수 주사(1 mL·^kg-1·^day-1)를 받았습니다.

TanIIA-L 그룹(저용량): TanIIA 복막 내 주사(7.5 mg·^kg-1·^day-1)를 받았습니다.

TanIIA-M 그룹(중용량): 복막 내 주사 TanIIA(15 mg·^kg-1·^day-1)를 받았습니다.

TanIIA-H 그룹(고용량): 복막 내 TanIIA 주사(30 mg·^kg-1·^day-1)를 받았습니다.

XST 그룹(양성 대조군): 발사르탄 경구 투여(30 mg·^kg-1·^day-1).

모든 치료는 28일 연속으로 매일 투여되었습니다. TanIIA와 XST 용량은 이전 연구와 예비 미^{공개 데이터를 바}탕으로 선정^{되었습니다.}

심전도(ECG) 및 심초음파
치료 28일 후, 심장 기능을 흉부 초음파 검사로 평가하였다. 2% 이소플루란 마취(운동 모드) 하에서 M-모드 이미지를 촬영하여 좌심실 이완기/수축기 직경(LVIDd/s)을 측정하였습니다. 좌심실 박출률(LVEF)과 좌심실 단축률(LVFS)은 이후 3회의 연속 심장 주기 평균에서 산출되었습니다. 또한, 수술 전, 결찰 후 15분 및 실험 평가 지점에서 심전도가 기록되어 심장 전기 활동을 모니터링하였습니다.

샘플링 및 2,3,5-트리페닐테트라졸륨 클로라이드(TTC) 염색
복부 대동맥에서 혈액을 1370 × g 에서 15분간 원심분리하여 혈청을 분리했고, 혈청은 -80°C에 저장되었습니다. 심장과 심외부 지방 조직은 신속히 절제되고 무게를 측정했습니다. 분자 분석을 위해 EAT와 경색 경계 조직을 액체 질소에 급동하여 -80 °C에 저장했습니다. 다른 조직 샘플은 조직학적 검사를 위해 4% 파라포름알데히드에 고정하였다. 추가로, 선정된 심장은 -20°C에서 냉동한 후 절절된 후 TTC로 염색하여 경색 크기를 평가하였습니다. 재료와 동물 조직은 실험실 안전 규정을 준수하여 사용되고 취급됩니다.

조직학적 검사
조직병리학적 평가를 위해 파라핀 절편을 헤마톡실린과 에오신(H&E) 염색하여 심근 형태를 관찰하였다. Masson의 삼색 염색법은 심근섬유증의 정도와 심외막 지방세포의 크기를 평가하는 데 사용되었으며, 콜라겐 부피 분율(CVF)도 정량화되었습니다. 또한, 경각되지 않은 부위의 I형과 III형콜라겐 비율은 피크로시리우스 레드(PSR) 염색법으로 결정되었습니다. 모든 절면은 정량적 분석을 위해 디지털 스캔되었습니다.

면역조직화학
파라핀이 포함된 심근 절편은 탈파라핀 및 재수화되었습니다. 항원 채취는 시트레이트 버퍼(pH 6.0)를 사용하여 수행되었습니다. 절편은 3% BSA로 차단한 후, 콜라겐 I, 콜라겐 III, IL-33, ST2, MyD88, NF-κB p65, TGF-β1에 대한 1차 항체와 함께 4°C에서 하룻밤 배양하였습니다. 이후 절편은 HRP 표지된 2차 항체와 상온에서 1시간 동안 인큐베이션되었습니다. 염색은 DAB로 시각화되었고, 핵은 헤마톡실린으로 교환 염색되었습니다. 이미지는 디지털 스캐너로 촬영되어 이미지 분석 소프트웨어로 분석되어 양성 염색의 통합 광학 밀도(IOD)를 정량화하였습니다.

효소 결합 면역흡착 분석법
혈청 샘플에서 hs-cTnI, NT-proBNP, IL-33, ST2의 농도가 정량되었습니다. 또한 혈청, 심근 균질세포, 심장 외피 지방 조직 용해체에서 IL-10과 TNF-α 수치를 측정하였습니다. 모든 분석은 제조사 프로토콜에 따라 상업적으로 판매되는 효소 결합면역흡착법(ELISA) 키트를 사용하여 수행되었습니다.

서부 블롯팅
조직 균질에서 총 단백질을 추출하였으며, 농도는 비신코닉산(BCA) 분석으로 측정되었습니다. 동량의 단백질은 나트륨 도데실 황산염-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE)으로 분리되어 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 막으로 전달되었습니다. 5% 무지방 우유로 차단한 후, 막을 IL-10, 종양괴사 인자 α(TNF-α), IL-33, ST2, NF-κB p65, TGF-β1, GAPDH(1:1000)에 대한 1차 항체와 함께 4°C에서 하룻밤 배양하였다. 이후 막을 HRP 결합 2차 항체(1:5000)와 함께 인큐베이팅하고 ECL 시약으로 시각화하였다. 밴드 강도는 소프트웨어로 정량화되었고, 단백질 수치는 내부 대조군으로 GAPDH로 정규화되었습니다.

통계 분석
모든 통계 분석은 의료 통계 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다. 데이터는 평균의 표준오± 평균으로 제시됩니다. 두 독립 그룹 간 비교에는 t-검정이 사용되었습니다. 여러 그룹의 경우, 일방향 또는 이중 ANOVA 후 Tukey 사후 검정이 적용되었습니다. 모든 분석에서 P < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.

결과

심근경색 쥐에서 TanIIA가 심장 기능에 미치는 영향 (그림 1)
건강 상태 및 체중 변화: MI 그룹의 쥐는 복부 팽창을 동반한 전반적인 상태가 좋지 않았으며, TanIIA 그룹의 쥐는 건강 상태가 개선되고 음식과 물 섭취가 증가하며 활동량이 증가했습니다. 4주 후, TanIIA 그룹 쥐들 사이에서 MI 그룹 쥐들에 비해 체중이 유의미하게 증가하는 것이 관찰되었습니다(P < 0.01)(그림 1A). 사망 원인은 심근손상 또는 심부전과 관련이 있었으며, 치료군은 심근경색군에 비해 생존율과 사망 지연 기간이 유의하게 높았습니다(P < 0.05)(그림 1B).

토론

본 연구는 심근경색 후 TanIIA가 심근섬유증에 미치는 영향과 그 기전을 조사합니다. 주요 발견은 다음과 같습니다: (1) TanIIA는 심장 섬유증을 억제하여 심장 재형성을 완화하고 심장 기능을 향상시킵니다. (2) TanIIA는 심외막 지방의 염증 반응과 산화 스트레스를 완화하여 심근섬유증을 억제하는 것으로 밝혀졌습니다. (3) TanIIA는 IL-33/ST2 신호 경로를 통해 항섬유화 효과를 매개합니다.

심근경색은 높은 이환율과 사망률을 가진 심혈관 질환으로, 환자의 삶의 질과 예후에 중대한 영향을 미칩니다^46,47. 심근경색(MI)으로 인한 사망률 감소에 상당한 진전이 있었음에도 불구하고, 경색 후 심근섬유증은 여전히 중요한 병리학적 과정으로 남아 있습니다. 이 질환은 심실 확장과 좌심실 기능 저하를 동반하...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
BCA 단백질 정량 키트	써모 피셔 코퍼레이션	PICPI23223
CAT 키트	그리고 nbsp; 상하이 효소 링크 생명공학	202211202
콜라겐 I 항체	우한 서비스바이오 바이오테크놀로지 유한회사	GB114197
콜라겐 III 항체	선양완레이비오 생명공학유한회사(Shenyang Wanleibio Biotechnology, Ltd)	WL03186
GAPDH 항체	세포 신호 기술 주식회사	#5174
그래프패드 프리즘	그래프패드 소프트웨어 코퍼레이션	버전 9.0
GSH 키트	그리고 nbsp; 상하이 효소 링크 생명공학	202211131
H& 전자 염색 솔루션	베이징 솔라비오 테크놀로지 주식회사	H8070; G1100
HRP 표지 염소 항토끼 IgG 항체	베이징 솔라비오 테크놀로지 주식회사	그리고 nbsp; SE134
Hs-cTnI  장비	상하이 위안제에 바이오테크놀로지 유한회사	20220808
그리고 nbsp; IL-10 항체	선양완레이비오 생명공학유한회사(Shenyang Wanleibio Biotechnology, Ltd)	WL03088
IL-10  장비	상하이 위안제에 바이오테크놀로지 유한회사	202211172
IL-33  장비	상하이 위안제에 바이오테크놀로지 유한회사	202211192
IL-33 항체	선양완레이비오 생명공학유한회사(Shenyang Wanleibio Biotechnology, Ltd)	WL04438
ImageJ 소프트웨어	국립보건원(NIH)	피지 버전
이미지 프로	미디어 사이버네틱스, 미국	버전 6.0
수컷 스프래그-도울리(SD) 쥐	장쑤성 지취 야오캉 생명공학 유한회사	SCXK(Su)2023-0009
매슨 스테인 키트	우한 볼프 생명공학 유한회사	20221218
MDA 키트	그리고 nbsp; 상하이 효소 링크 생명공학	202211171
MyD88 항체	선양완레이비오 생명공학유한회사(Shenyang Wanleibio Biotechnology, Ltd)	WL02494
NT-proBNP  장비	상하이 위안제에 바이오테크놀로지 유한회사	20220805
핵 계수 카파-B(NF-&카파; B)(p65) 항체와 nbsp;	앱마트 코퍼레이션	TP56372
오픈 바벨	오픈 소스 화학정보학 툴킷 프로젝트	버전 2.3.2
폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 막	메르크 밀리포어	R9M2784
PSR 솔루션	베이징 솔라비오 테크놀로지 주식회사	G1472
SOD 키트	그리고 nbsp; 상하이 효소 링크 생명공학	202211201
ST2 항체	프로틴테크 그룹 코퍼레이션	11920-1-AP
ST2 키트	상하이 위안제에 바이오테크놀로지 유한회사	202211183
통계 제품 및 서비스 솔루션(SPSS)	IBM 코퍼레이션	버전 26.0
설포탄시논 나트륨 주사	상하이 제약 제1생화학 제약 유한회사	2012303
초민감 ECL 발광 시약	대롄 메이룬 생명공학 유한회사	MA0186
TGF-& 베타; 항체 1개	ABclonal Corporation	A2124
타이탄빈 발사르탄 캡슐	후난 첸진 샹장 제약유한회사	211120
TNF-&α; 그리고 nbsp; 장비	상하이 위안제에 바이오테크놀로지 유한회사	202211202
TNF-&α; 항체	선양완레이비오 생명공학유한회사(Shenyang Wanleibio Biotechnology, Ltd)	WL01581
TTC 해결책	푸저우 파이진 바이오테크놀로지 주식회사	20210620
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