자외선 A-유도 피부 광노화 모델에서 성장인자 베타 1/SMAD 신호전달의 호노키올 조절 연구 프로토콜

요약

이 프로토콜은 호노키올이 인간 피부 섬유아세포와 마우스 피부에서 UVA에 의해 유도된 광 노화를 완화하는지, TGF-β1/Smad 경로를 활성화하고 MMP 발현을 감소시키는지 조사합니다.

초록

목 련(Magnolia officinalis)에서 유래한 핵심 성분인 호노키올(HNK)은 피부 질환 치료에 잠재력이 있습니다. 현재 HNK가 피부에서 자외선 A(UVA)로 인한 광손상에 미치는 영향과 작용 기전은 명확하지 않습니다. UVA 유도를 통해 HDF 세포와 무모 생쥐 피부의 광 노화 손상 모델을 구축했습니다. HNK가 정상 HDF 세포와 UVA 유도 HDF 세포의 생존력에 미치는 영향은 세포 생존성 분석법을 통해 조사되었습니다. HDF 세포 내 SOD, GSH, CAT, MDA 수치는 다양한 키트를 사용해 측정하였고, ROS 수치는 DCFH-DA와 디하이드로에티듐을 사용해 측정하였습니다. SA-β-갈락토시다아제와 TUNEL 염색은 HDF 세포에서 노화와 세포자사멸사를 검출했으며, 유세포분석은 세포 주기 진행을 평가했습니다. 병리학적 염색을 통해 피부의 조직병리학적 손상을 평가하였다. 또한 면역형광 및 웨스턴 블롯을 사용하여 Ki67, 콜라겐, 기질 금속단백효소(MMP), TGF-β1/Smad 경로 관련 단백질 수준을 평가하였습니다. HNK(2.5-10 μM) 처리는 정상 HDF 세포 생존력에 부정적인 영향을 미치지 않았으나, UVA에 의한 HDF 세포 손상을 완화하여 산화 스트레스와 세포자멸사를 감소시켰습니다. UVA는 HDF 세포의 노화를 유도하고, S상 정지를 유도하며, Ki67을 하향 조절하고, 콜라겐 함량을 감소시키고, MMP 발현을 증가시켰으며, HNK는 이러한 UVA 유발 이상을 효과적으로 완화시켰다. 또한 UVA는 생쥐 피부에서 주름이 깊어지고, 수분 함량과 콜라겐 함량을 감소시키며, 상피 두께를 증가시킨 반면, HNK 피하 주사는 피부 조직의 병리학적 손상을 완화하고 수분과 콜라겐 함량을 증가시켰습니다. 더 나아가, HNK는 TGF-β1/Smad 경로를 활성화했고, TGF-β1 억제제는 HDF 세포에서 광노화 손상에 대한 HNK의 보호 효과를 SB431542했습니다. 결론적으로, HNK는 TGF-β1/Smad 경로를 활성화하여 MMP 발현을 감소시켜 HDF 세포와 마우스 피부에서 UVA 유도 광 노화를 억제함으로써 광노화 손상을 완화할 잠재력을 가지고 있습니다.

서론

피부 노화 과정은 복잡하며 두 가지 주요 형태로 나뉩니다: 자연 노화와 광 노화¹. 연구에 따르면 피부 노화의 80%에서 90%가 환경 내 외부 요인(예: 자외선, 대기 오염)에 의해 발생하며, 그중 장기간 자외선에 의한 광노화가 가장 심각한 영향을 미친다고 합니다 ^2,3. 자외선은 UVC, UVB, UVA로 나뉩니다. UVC가 오존층을 통과할 수 없기 때문에, 현재 광 노화 연구는 UVA(320-400 nm)와 UVB(280-320 ^nm)에 집중되어 있습니다. UVB와 비교했을 때 UVA는 에너지가 낮지만, 표피를 통과해 진피 깊숙이 침투하는 데 더 강합니다. 이는 심각한^{피부 노화}의 중요한 원인입니다. 이전 연구들은 HaCaT 세포에 57 mJ/^{cm 2} UVB 및 20 J^{/cm 2} UVA 조사가 초래하는 손상이 비교할 만한 수준임을 보여주었다^. 피부 광노화는 피부의 기능과 구조에 변화를 일으키며, 특히 피부 표면 조직이 처지고, 주름이 깊어지며, 콜라겐 손실, 육안으로 보이는 회색 피부 색 현상으로 나타납니다; 심한 경우에는 다양한 양성 전암성 병변과 종양이 발생할 수 있습니다 ^9.10. 노화와 노화 방지에 관한 연구가 증가함에 따라, 광노화의 건강 위험은 전 세계적으로 가장 중요한 건강 문제 중 하나가 되었습니다. 따라서 UVA로 인한 광노화 손상의 병태생리학적 과정을 조사하여 이를 위한 새로운 치료 옵션을 개발하는 것이 매우 중요합니다.

전통 중국 약초인 목련 오피시나리스(Magnokiol officinalis)에서 추출한 호노키올(HNK)은 화학 화학식인 C₁₈H₁₈O₂¹¹의 중요한 생리활성 화합물입니다. HNK는 다양한 약리학적 활성을 보이며, 그 페놀 하이드록실기는 산화에 매우 민감하고 강한 항산화 및 자유 라디칼 청소 효과를 보인다¹². 또한 HNK는 항균, 항염증, 항바이러스, 항종양, 항우울제, 신경보호 및 조기 난소 부전 약리학적 효과 13,14,15,16을 가지고 있습니다. 경구 HNK는 동물 실험과 임상 연구에서 본질적으로 안전하다고 판단되었으며, 유의미한 부작용은 확인되지 않았습니다^{17, 18, 19}. 최근 연구들은 HNK가 UVB로 인한^피부암을 예방하고, UVB로 인한 피부 염증 반응과 DNA 과메틸화를 억제^{하며, 피부} 질환 치료에 잠재적 활용 가능성을 시사합니다. 비타민 C와 레스베라트롤 등 널리 사용되는 광노화 방지제와 비교할 때, HNK는 뚜렷하고 우수한 특성을 가지고 있습니다: 지친성 구조가 친수성 비타민 C²²보다 더 우수한 경피 투과성을 제공합니다. 또한 레스베라트롤²³보다 더 높은 광안정성과 생체 내 생체이용률을 보입니다. 이러한 전임상 결과는 HNK가 자외선 유발 피부 광손상에 대한 안전하고 효과적인 스킨케어 제품 및 임상 중재로서 유망한 중개 가능성을 지니고 있음을 뒷받침합니다. 하지만 UVA로 인한 피부 광노화 손상에 대한 HNK 치료의 영향은 아직 보고되지 않았습니다.

성장 인자 변형 인자-β1(TGF-β1)은 세포 성장과 발달, 조직 복구 및 재생, 세포, 조직, 장기의 성장과 발달에 중요한 다기능 사이토카인입니다^24,25. TGF-β1은 주로 Smad 단백질 계열의 구성원을 통해 세포에 신호를 보내며, 이는 하위 표적 유전자의 전사를 특이적으로 조절하는 것으로 나타났습니다. TGF-β1 신호가 활성화되면 Smad2와 Smad3의 인산화가 일어납니다^26,27. 최근 연구들은 TGF-β1/Smad 경로와 피부 섬유증 및 광노화 사이에 강한 연관성을 보여주었습니다^28,29. 포유류에서 라파마이신을 표적으로 삼는 것이 쥐 피부 조직에서 TGF-β1/Smad 경로를 활성화하여, 피부 수분 유지와 피부 장벽 유지에 중요한 세라마이드 합성을 촉진한다는 보고가^{있습니다.} 특히, HNK가 간별 세포에서 TGF-β1/Smad 경로를 조절하여 간^섬유증을 완화시켰다는 보고가 있습니다. 따라서 HDF 세포에서 2.5–10 μM HNK 처리와 무모 마우스에서 5 mg/kg 또는 10 mg/kg HNK 개입을 통해 UVA 유발 광노화 손상의 세포 및 마우스 모델이 구축되어, HNK가 광 노화 손상에 미치는 영향과 TGF-β1/Smad 경로를 조절하는 잠재적 역할을 탐구하였습니다. 이 연구는 UVA로 인한 피부 광손상에 대한 새로운 치료 전략을 개발하는 것을 목표로 했습니다.

프로토콜

모든 세포 배양 실험은 기관 생물안전 지침에 따라 수행되었으며, 생물안전 레벨 2(BSL-2) 실험실 조건 하에서 수행되었습니다. 동물 실험은 중국 인민해방군 합동 물류지원군 988병원 동물윤리위원회(승인번호: 2023-089)의 승인을 받아 수행되었다.

모든 실험 절차는 실험동물의 관리 및 사용에 관한 기관 및 국가 지침을 엄격히 준수하여 수행되었습니다. 실험 종료 시점에 쥐들은 복막 내 주사 100 mg/kg의 펜토바르비탈 과다복용으로 안락사되었습니다. 수용, 치료, 샘플링 과정에서 동물의 고통을 최소화하기 위한 모든 노력이 이루어졌습니다. 프로토콜에 사용되는 시약, 화학물질, 장비 및 소프트웨어는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 세포 배양 및 가공

1. 섬유아세포 배양 배양액에서 인간 피부 섬유아세포(HDF)를 배양합니다. 배양물을 37°C에서 5%_CO2가 포함된 포화 습도 환경에서 유지하세요.
2. 배양지는 3일마다 교체하고, HDF가 합류할 때는 1:3 비율로 전달하세요.
3. UVA 램프(방출 스펙트럼: 320-400 nm)로 HDF를 5 J/cm²의 선량으로 照射합니다.
4. UVA 30분 가사 후 즉시 신선한 배지를 보충하세요. 8일 연속으로 하루 1회 UVA 방사선 검사를 반복하세요³².
5. 용량 선별 실험에서 2.5, 5, 10, 20, 40 μM HNK로 HDF를 24시간 또는 48시간 동안 처리^합니다. HDF를 2.5, 5 또는 10 μM HNK로 24시간 처리한 후 이후 실험에서는 UVA 방사선(5 J/cm²)을 실시합니다.
6. HDF를 10 μM HNK에 4시간 노출시키고, 10 μM TGF-β1 억제제 SB431542으로 24시간 인큐베이팅한 후, HNK+SB431542 그룹에서 UVA(5 J/cm²)로 조사합니다.

2. 세포 생존성 평가

1. HDF를 96웰 배양 플레이트에 1×10^{4 세포/} 웰 밀도로 접종합니다.
2. 여러 처리 후 각 웰에 10 μL 10% 수용성 테트라졸륨 염 시약을 추가하여 최종 부피는 100 μL로 만들고, 37°C에서 1.5시간 동안 어둠 속에서 배양합니다.
3. 마이크로플레이트 리더기를 사용해 세포의 OD450 값을 측정합니다.

3. 초산화물 디스뮤타아제(SOD), 말론디알데히드(MDA), 카탈라아제(CAT), 글루타티온(GSH) 수치 측정

1. HDF를 1mL 미리 냉각한 PBS(0.01 M, pH 7.4)로 세척하고, SOD 분석 키트에서 추출한 200 μL SOD 샘플 준비액을 얼음 위에 올려 용해 세포에 15분간 첨가합니다.
2. 용해액을 8000 × g 에서 4 °C에서 5분간 원심분리한 후 상청액을 분석 샘플로 채취합니다.
3. BCA(비신코닌산) 단백질 분석 키트를 사용해 상정액의 단백질 농도를 측정하고, 샘플을 50 μL 부피에 50 μg 총 단백질로 조절하세요.
4. 50 μg 단백질 샘플을 SOD 분석액과 혼합하여 최종 반응량 200 μL로 만들고, 37 °C에서 어둠 속에서 30분간 배양한 후 OD450 값을 측정합니다.
5. SOD 검사에 사용되는 동일한 세포 용해액 상청액을 사용하고, 각 검사 키트를 사용해 CAT, GSH, MDA 수치를 측정하세요.

4. 세포 ROS 수치 측정

1. HDF 세포를 다른 조건으로 처리하고, 500 μL PBS로 두 번 세척한 후 10 μM 활성산소종 형광 프로브 500 μL와 잘 섞어 37 °C에서 빛을 피한 곳에서 20분간 배양합니다.
2. 실온에서 1000 × g에서 5분간 원심분리하여 세포를 수집한 후, 500 μL PBS로 두 번 세척합니다.
3. 세포를 500 μL 세포 배양 배지에 재현탁한 후 유세포분석으로 염색을 분석합니다.
4. 유동 세포분석 소프트웨어를 사용해 형광 강도를 기록한 후, 형광 강도를 바탕으로 ROS 수준을 계산합니다. ROS가 높을수록 녹색 형광이 더 강해집니다.

5. 노화 연관 β-갈락토시다제(SA-β-갈락토시다제) 염색

1. HDF를 6웰 배양 플레이트에 1×10 밀도로 씨앗 뿌리고^{6개의 세포} 를 웰에 부착하여 배양합니다. 여러 번 치료 후 HDF를 2mL PBS로 한 번 세척하세요.
2. 각 웰에 1mL β-갈락토시다제 고정액을 첨가하고, 고정액과 함께 실온에서 세포를 15분간 배양합니다.
3. 세포를 2 mL PBS로 3번 세척하고, 각 웰에 1 mL 염색 작업 용액을 추가한 후 37°C에서 어두운 밤새 배양합니다.
4. 광학 현미경으로 세포를 관찰하고 사진을 찍으세요(노화 세포는 파란색으로 보입니다).

6. 세포주기 분석

1. 6웰 플레이트에 HDF를 1×10⁶ 셀/웰로 시딩; 여러 치료 후 2mL PBS로 세포를 두 번 세척합니다.
2. 1000 × g에서 실온에서 5분간 원심분리하여 세포를 채취하고, 70% 에탄올(세포 고정제) 1mL를 추가한 후 피펫팅으로 부드럽게 혼합합니다. 고정된 셀을 4°C 냉장고에 12시간 보관하세요.
3. 프로필디움 요오다이드(PI, 최종 농도 50 μg/mL)와 RNaseA(최종 농도 200 μg/mL)를 PBS에 혼합하여 세포 염색 용액 1개 샘플당 500 μL을 준비합니다. 세포를 500 μL 염색액에 노출시키고, 37°C에서 어두운 환경에서 30분간 배양합니다.
4. 유세포분석을 이용해 형광 강도를 평가합니다. 유세포계를 이용해 세포주기 분석을 수행합니다.

7. 튠 착색

1. 서로 다른 처리군의 HDF 세포를 4% 파라포름알데히드 1mL에 노출시키고 상온에서 30분간 배큐합니다.
2. 0.3% Triton X-100을 포함한 PBS 1mL를 세포에 첨가하고 실온에서 5분간 배양합니다.
3. 세포를 PBS로 두 번 세척한 후, 500 μL TUNEL 분석액을 떨어뜨려 세포를 고르게 덮으세요. 37°C에서 어두운 환경에서 1.5시간 부양하세요.
4. 세포를 덮기 위해 DAPI 염색 용액 200 μL을 추가하고, 빛이 없는 곳에서 25 °C에서 10분간 배양합니다.
5. 형광 신호 보존 매체로 세포를 밀봉한 후 형광 현미경으로 관찰 및 사진을 찍습니다(TUNEL 양성 세포는 녹색 형광을 보입니다).

8. 면역형광 염색

1. 서로 다른 처리군의 HDF 세포를 12웰 플레이트에 씨앗 처리합니다. 세포 밀도가 50%-60%에 도달하면 세포를 4% 파라포름알데히드 1mL에 노출시키고 상온에서 25분간 배양합니다.
2. 5% 소 혈청 알부민(BSA) 1mL를 떨어뜨리듯 넣어 세포 표면을 차단하고, 상온에서 30분간 배양합니다.
3. 1차 항체 Ki67(1:300), 콜라겐 I(1:100), 기질 금속단백효소(MMP)-1(1:50), 또는 MMP-3(1:100)를 500 μL 점하순으로 첨가하고, 4°C에서 하룻밤 배큐합니다.
4. 다음 날, 500 μL 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 표지 2차 항체(1:100)를 37°C에서 빛에서 1시간 배양합니다.
5. 세포를 덮기 위해 DAPI 염색액 200 μL을 추가하고, 빛을 피한 곳에서 10분간 배양한 뒤 형광 현미경으로 관찰한 후 영상 분석 소프트웨어로 분석합니다(콜라겐 I 및 MMP-1 양성 세포는 붉은 형광을, Ki67과 MMP-3 양성 세포는 녹색 형광을 보입니다).

9. 엘리사

1. MMP-1 또는 MMP-3 ELISA 키트 플레이트 웰에 HDF 배양 상원액 100 μL을 첨가하고, 37°C에서 2시간 배양합니다.
2. 웰을 200 μL PBS로 3번 세척한 후, 각 웰에 해당 항체 100 μL을 추가한 후 37°C에서 어두운 환경에서 1시간 배양합니다.
3. 웰을 200 μL 세척 완충제(키트에 제공)로 3번 헹군 후 과잉 용액을 털어내고, 100 μL 스트렙타비딘-HRP 100 μL 샘플로 37°C에서 30분간 어두운 환경에서 배양합니다.
4. PBS로 세척한 후, 키트 설명서에 따라 기질 A와 B를 100 μL 추가하고 37°C에서 어두운 환경에서 10분간 배양합니다.
5. 종결액 50 μL를 추가하고 잘 섞은 후 마이크로플레이트 리더기로 OD₄₅₀ 값을 평가한 후 농도를 계산합니다.

10. 사진 노화 손상 마우스 모델 구성

1. SPF 등급의 암컷 SKH1 무모 마우스(15-20g, 4-5주 된 경우)를 22°C, 습도 55%-60%에서 기숙시키며, 자율적으로 먹이와 물을 섭취할 수 있게 하세요. 식품 용기, 물병, 식수구를 포함한 시설을 정기적으로 소독하세요.
2. 쥐를 무작위로 대조군(n=6)과 모델 그룹(n=18)에 배정합니다. 모델 그룹 마우스에 0.35 J/cm² 의 UVA를^8주간 방사선으로 투여했습니다. UVA 노출 없이 같은 환경에서 집 대조군 쥐를 사용했습니다.
3. 모델 그룹 쥐를 3개의 하위 그룹(n=6개)으로 균등하게 나누세요.
4. UVA 방사선 중 두 개의 하위 그룹(각각 5 mg/kg HNK 그룹과 10 mg/kg HNK 그룹, 10 mg/kg 용량, 10 mg/kg 용량)을 주 2회 피하 주사로 투여합니다. UVA 방사선 조사 중 세 번째 소그룹(UVA 그룹으로 기록)에 주 2회 100 μL 식염수 피하 주사를 투여합니다.
5. 성공적인 모델링 후 피부 주름 형성과 수분 함량을 평가하세요³⁵.
6. 복강 내 나트륨 펜토바르비탈(100 mg/kg)으로 쥐를 안락사시키고, 추가 실험을 위해 등쪽 피부 조직을 채취합니다.

11. 피부 콜라겐 I 함량 측정

1. 쥐 등쪽 피부 조직 50mg을 채취하여 액체 질소로 완전히 분쇄한 후, 500 μL 미리 냉각된 RIPA 용해 버퍼로 얼음 위에 30분간 용해합니다.
2. 용해액을 8000 × g 에서 4 °C에서 5분간 원심분리한 후 상원액을 채취한 뒤, 제조사 지침에 따라 프로콜라겐 I C 펩타이드 검사 키트를 사용해 콜라겐 함량을 측정합니다.

12. 헤마톡실린과 에오신(HE) 염색

1. 쥐 피부 조직을 10 mL 4% 파라포름알데히드에 상온에서 24시간 고정하고, 50%, 75%, 95%, 100%에 5분간 탈수한 후 파라핀에 박고 4 μm 조각으로 절단합니다.
2. 슬라이스를 65°C에서 8시간 구운 후, 자일렌에 각각 10분씩 두 번 탈파라핀화한 뒤, 상온에서 그라디언트 에탄올에 다시 수화합니다.
3. 헤마톡실린 용액으로 8분간 염색하고, 흐르는 수돗물로 1분간 씻고, 분화 용액으로 30초간 분별한 뒤, 실온에서 에오신으로 1분간 염색하세요.
4. 염색된 슬라이스를 구배 에탄올로 탈수하고, 자일렌으로 투명하게 만들고, 마운팅 배지로 밀봉한 후 현미경으로 관찰합니다(세포핵은 청보라색으로 보이고, 세포질, 콜라겐 섬유, 적혈구는 정도 차이가 있지만 분홍색을 띱니다).

13. 매손 염색

1. Masson 트리크롬 염색 키트³⁶을 사용해 쥐 피부 조직의 파라핀 부분을 염색합니다. 파라핀 절편을 자일렌에 두 번씩 각각 10분씩 제거하고, 바이거트 철 헤마톡실린 염색액을 넣고 10분간 염색합니다.
2. 산성 에탄올 분화 용액으로 30초간 분별하고, 흐르는 수돗물로 5분간 헹군 후, Ponceau-fuchsin 염색액으로 실온에서 10분간 점차 착색합니다. 매슨의 블루 용액으로 역청색을 한 후 증류수로 1분간 세척하세요.
3. 증류수의 비율로 약산 작업 용액을 준비합니다: 키트에 포함된 약산 용액 = 2:1; 1mL의 연산 작용액을 떨어뜨리듯 넣고 실온에서 30초간 세척합니다.
4. 과잉 액체를 부어 1mL 인산몰리브산 용액을 떨어뜨리고, 실온에서 2분간 처리하세요. 약한 산성 작용액 1mL를 떨어뜨리며 넣은 후 30초간 세척합니다.
5. 과잉 액체를 부어내고, 1mL 아닐린 블루 스테인 용액을 드롭 방향으로 넣은 후 1분간 스테인을 발라. 1mL 연산 작업 용액을 떨어뜨리듯 넣고 30초간 세척합니다.
6. 95% 에탄올에 빠르게 2초간 건조하세요. 절대 에탄올에 두 번, 각 10초씩 탈수하세요.
7. 건조 후에는 자일렌으로 구역을 치우고 중성 접착제로 부착하세요. 현미경으로 각 그룹의 콜라겐 섬유 분포를 관찰하세요(콜라겐 섬유는 파란색으로 보이고, 근섬유, 세포질, 적혈구는 밝은 빨간색이며, 세포 핵은 뚜렷한 청흑색으로 보입니다).

14. 피부 조직 ROS 수치 측정

1. 절제 후 1시간 이내에 준비한 쥐 피부 조직의 냉동 조각을 가져와, 1mL 세정액을 전체 절면 표면에 떨어뜨리듯 바른 후 실온에 10분간 두세요.
2. 세척액을 털어낸 후 10 μM 활성 산소종 프로브 1mL를 떨어뜨리듯 부어 절면을 고르게 덮습니다; 빛에서 떨어진 37°C에서 30분간 부화합니다.
3. 절편을 PBS로 두 번 헹구고 커버 슬립을 추가한 후 형광 현미경으로 관찰하세요(ROS 양성 부위는 붉은 형광을 보이며, ROS 수준이 낮을수록 적색 형광 신호가 약해집니다).

15. 생화학적 지표 검사

1. 마우스 혈청을 채취하고 해당 분석 키트의 지침에 따라 검출 시약을 준비하세요.
2. 마우스 혈청에서 아스파르트산 트랜스아미나제(AST)와 알라닌 트랜스아미나제(ALT)의 활성을 각 키트를 사용하여 측정합니다.
3. 마우스 혈청 내 혈중 요소 질소(BUN)와 크레아티닌(CRE) 농도를 각 키트를 사용하여 측정하세요.

16. 서부 블롯

1. 50mg의 조직 또는 1×10개의⁶ 세포를 채취한 후, 200 μL RIPA 용해 버퍼를 사용해 30분간 얼음 위에 용해하여 단백질을 얻습니다.
2. 8000 × g에서 4 °C에서 5분간 원심분리기로 원심분리하여 상청액을 채취합니다. BCA 단백질 농도 분석 키트를 사용하여 세포와 조직의 단백질 함량을 평가합니다.
3. 샘플 단백질을 12% SDS-PAGE 겔에 전기영동으로 수행하고, 분리된 단백질을 4°C에서 PVDF 막으로 옮깁니다.
4. PVDF 멤브레인을 5% BSA로 3시간 실온에서 차단하세요. 막을 TBST(20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.1% Tween-20 포함)로 3번 세척한 후, 4°C에서 1차 항체(P53 (1:1000), P21 (1:1000), P16 (1:100), 콜라겐 I (1:1000), 사이클린 A2 (1:500), 사이클린 의존 키나제 2 (CDK2, 1:1000), MMP-1 (1:500), MMP-3 (1:1000), TGF-β1 (1:1000), Smad2 (1:1000), Smad3 (1:1000), p-Smad2 (1:1000), 또는 p-Smad3 (1:1000)
5. 둘째 날에는 TBST로 막을 3번 세척한 후, 1mL의 염소 항토끼 IgG(1:10000)와 함께 실온에서 2시간 배양합니다. 500 μL 증강 화학발광(ECL) 시약을 막에 고르게 적용한 후, 젤 이미징 시스템으로 검사합니다.
6. 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 회색 값 분석을 수행합니다. 상대 표현 수준을 GAPDH 회색 값과 그 비율로 표현하라.

17. 통계 분석

1. 시험 관 내 세포 기반 검사에서는 모든 실험이 독립적으로 세 번 반복됩니다(n=3, 생물학적 복제).
2. 생 체 내 동물 실험에서는 그룹당 6마리의 쥐(n=6)가 포함되며, 이는 실험실 동물 복지와 윤리에 관한 3R 원칙을 준수합니다.
3. 모든 결과는 표준편차± 평균으로 표현됩니다. 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 통계 분석을 수행합니다. 데이터 정규성은 샤피로-윌크 검정을 사용하여 검증되었다.
4. 정규 분포 데이터의 경우, 다중 그룹 비교에는 일원 ANOVA를, 그룹 간 쌍별 비교에는 Tukey의 사후 검정을 사용합니다. 비정규 분포 데이터의 경우, 비모수 Kruskal-Wallis 검정을 적용합니다. P< 0.05는 유의미한 차이를 나타냅니다.
5. 그래프 소프트웨어를 사용해 그래프를 생성하세요.

결과

HNK는 UVA에 의해 발생하는 HDF 세포의 산화 스트레스 손상을 완화합니다
24시간 또는 48시간 동안 다양한 농도의 HNK 처리가 HDF 세포의 생존력에 미치는 영향을 세포 생존성 검사를 통해 적절한 농도와 치료 기간을 선별하기 위해 조사되었습니다. 결과는 2.5, 5, 10 μM의 HNK가 24시간 또는 48시간 치료 후 정상 HDF 세포의 생존 능력에 유의미한 영향을 미치지 않으며, 이 용량에서 HNK가 정상 세포에 무독성임을 입증했습니다. 특히, 2.5, 5, 10 μM 농도에서 HNK는 UVA로 인한 HDF 세포 생존력 저하를 완화하여, HNK가 HDF 세포를 UVA 손상으로부터 보호하며, 24시간 처리 효과가 48시간 때보다 더 우수함을 시사합니다. HNK 농도를 20 및 40 μM으로 올렸을 때, 정상 HDF 세포와 UVA 처리 HDF 세포 모두의 생존 가능성이 현저히 감소하여, 높은 농도의 HNK(20-40 μM)가...

토론

자외선은 세포와 유기체에 해를 끼치는 환경 요인 중 하나입니다. 이전 연구들은 UVA가 높은 투과력을 가진 자외선이^{지구 표면에} 도달하는 주요 자외선 유형이라고 보고했습니다. 섬유아세포는 진피에서 중요한 기능적 세포이며, 노화가 직접적이든 간접적이든 피부 노화를 유발할 수 있습니다^. HDF 세포 모델과 무모 쥐 모델에서 UVA에 의해 유발된 광노화 손상은 피부 광노화 연구에 널리 사용되고 있습니다^40,41. 따라서 UVA에 의한 광노화 손상의 세포 및 동물 모델은 이전 연구들을 참고하여 구축되었습니다(HDF 세포는 8일 연속 하루 5 J/cm², 쥐는 8주간 0.35 J/cm²)^32,

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
ALT 활성 검사 키트	비요타임 바이오테크놀로지, 상하이, 중국	P2711M	알라닌 트랜스아미나제 활성 탐지 키트
앰플렉스 레드 CRE 분석 키트	비요타임 바이오테크놀로지, 상하이, 중국	S0291S	크레아티닌 검출 키트
안티페이드 마운팅 매체	비요타임 바이오테크놀로지, 상하이, 중국	P0126	형광 신호 보존 매체
AST 활동 분석 키트	비요타임 바이오테크놀로지, 상하이, 중국	P2715S	아스파르트산 트랜스아미나제 활성 검출 키트
BCA 단백질 분석 키트	비요타임 바이오테크놀로지, 상하이, 중국	P0012	단백질 농도 측정 키트
BSA	시그마-올드리치, 세인트루이스, 미주리, 미국	V900933	비특이적 결합을 위한 차단 시약
BUN 분석 키트	비요타임 바이오테크놀로지, 상하이, 중국	S0574S	혈중 요소 질소 검출 키트
CAT 분석 키트	비요타임 바이오테크놀로지, 상하이, 중국	S0051	카탈라제 활성 탐지 키트
CCK-8 시약	시그마-올드리치, 세인트루이스, 미주리, 미국	96992	수용성 테트라졸륨 염으로 구성된 세포 생존성 분석 용액
CDK2 항체	인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드, 미국	PA5-79024	CDK2 검출을 위한 1차 항체
화학발광제(ECL)	메드켐익스프레스, 뉴저지주 몬머스 정션, 미국	HY-K1005	향상된 화학발광 검출 시약
콜라겐 I 항체	인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드, 미국	PA1-26204	콜라겐 I 검출을 위한 1차 항체
사이클린 A2 항체	인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드, 미국	PA5-34682	사이클린 A2 검출을 위한 1차 항체
DAPI 염색 솔루션	시그마-올드리치, 세인트루이스, 미주리, 미국	D9542	핵 염색 염료
DCFH-DA 형광 프로브	메드켐익스프레스, 뉴저지주 몬머스 정션, 미국	HY-D0940	반응성 산소종 형광 탐침
미분 해법	비요타임 바이오테크놀로지, 상하이, 중국	C0161	헤마톡실린 분화 단계용 시약
디하이드로에티듐 프로브	비요타임 바이오테크놀로지, 상하이, 중국	S0063	활성산소종 탐침
섬유아세포 배양 배양	Sunncell Biotechnology Co., Ltd., 우한, 후베이, 중국	SNPM-H342	섬유아세포 성장을 위한 완전 배양지
FITC 표지된 염소 항토끼 IgG	인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드, 미국	F-2765	플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 표지 2차 항체
유세포검사	BD 바이오사이언스, 캘리포니아주 산호세	BD FACSCaliburTM	유세포계
플로우조 소프트웨어	BD 바이오사이언스, 캘리포니아주 산호세	v10.8	유세포분석 소프트웨어
형광 현미경	라이카, 하이델베르크, 독일	DM IL이 이끄는	형광 영상용 현미경
GAPDH 항체	인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드, 미국	PA1-987	단백질 정규화를 위한 내부 대조 항체
젤 영상 시스템	인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드, 미국	아이브라이트 CL1500	단백질 검출을 위한 영상 시스템
염소 항토끼 IgG	인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드, 미국	31460	면역 검출을 위한 2차 항체
그래프패드 프리sm 9.0 소프트웨어	그래프패드 소프트웨어, 캘리포니아주 샌디에이고, 미국	프리즘 9.0	그래프 작성 소프트웨어
GSH 분석 키트	비요타임 바이오테크놀로지, 상하이, 중국	S0053	글루타티온 성분 검출 키트
고폭탄 염색 키트	비요타임 바이오테크놀로지, 상하이, 중국	C0105S	조직 형태 분석을 위한 조직학적 염색 키트
HNK	메드켐익스프레스, 뉴저지주 몬머스 정션, 미국	HY-N0003	호노키올, 생리활성 화합물
인간 피부 섬유아세포	Sunncell Biotechnology Co., Ltd., 우한, 후베이, 중국	SNP-H342	인간 1차 피부 섬유아세포
IBM SPSS 통계 26.0 소프트웨어	IBM 코퍼레이션, 아몬크, 뉴욕, 미국	IBM SPSS 통계 26.0	통계 분석 소프트웨어
ImageJ 소프트웨어	웨인 라스밴드, 미국 국립정신건강연구소	버전 1.54h	이미지 분석 소프트웨어
Ki67 항체	인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드, 미국	MA5-14520	세포 증식 마커 검출을 위한 1차 항체
광학 현미경	라이카, 하이델베르크, 독일	DM3000	밝시야 영상을 위한 광학 현미경
마송 트리크롬 스테인 키트	솔라비오, 베이징, 중국	G1340	콜라겐 및 결합조직 염색 키트
MDA 분석 키트	비요타임 바이오테크놀로지, 상하이, 중국	S0131S	말론디알데히드 수치 검출 키트 (지질 과산화 마커)
마이크로플레이트 리더	서모피셔 사이언티픽, 월섬, 매사추세츠, 미국	1410101	세포 기반 분석용 흡수도 측정 기기
MMP-1 항체	인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드, 미국	PA5-27210	기질 금속단백효소-1 검출을 위한 1차 항체
MMP-1 ELISA 키트	효소 결합 생명공학, 상하이, 중국	ML038199	생물학적 샘플에서 MMP-1의 정량적 검출
MMP-3 항체	앱캠, 케임브리지, 매사추세츠, 미국	AB52915	기질 금속단백효소-3 검출을 위한 1차 항체
MMP-3 ELISA 키트	효소 결합 생명공학, 상하이, 중국	ML105322	생물학적 샘플에서 MMP-3의 정량적 검출
중성 검	비요타임 바이오테크놀로지, 상하이, 중국	C0173	장착 매체
P16 항체	인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드, 미국	PA5-20379	P16 단백질 검출을 위한 1차 항체
P21 항체	인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드, 미국	MA5-14949	P21 단백질 검출을 위한 1차 항체
P53 항체	앱캠, 케임브리지, 매사추세츠, 미국	ab131442	P53 단백질 검출을 위한 1차 항체
파라포름알데히드	솔라비오, 베이징, 중국	P1110	세포 및 조직 고정 시약
사설 탐정	비요타임 바이오테크놀로지, 상하이, 중국	ST512	세포주기 분석에서 DNA 염색을 위한 프로피듐 요오다이드
프로콜라겐 I C 펩타이드 분석 키트	일본 도쿄 타카라	MK101	콜라겐 합성 검출 키트
p-Smad2 항체	인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드, 미국	44-244G	인산화된 Smad2 검출을 위한 1차 항체
p-Smad3 항체	인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드, 미국	44-246G	인산화된 Smad3 검출을 위한 1차 항체
PVDF 막	인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드, 미국	88520	서부 블롯을 위한 단백질 전달막
RIPA 용해 완충제	비요타임 바이오테크놀로지, 상하이, 중국	P0013B	세포 및 조직 용해액을 위한 단백질 추출 완충제
RNaseA	비요타임 바이오테크놀로지, 상하이, 중국	ST579	DNA 염색 중 RNA 제거를 위한 리보뉴클레아제
SA-&β;-갈락토시다제 염색 키트	비요타임 바이오테크놀로지, 상하이, 중국	C0602	세포 노화 탐지 키트
SB431542	메드켐익스프레스, 뉴저지주 몬머스 정션, 미국	HY-10431	TGF-& 베타; 1 신호 전달 경로 억제제
SDS-PAGE 겔	인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드, 미국	WG1403BX10	단백질 전기영동을 위한 폴리아크릴아마이드 겔
SKH1 무모 쥐	바이탈리버, 베이징, 중국		피부 사진 노화 연구를 위한 동물 모델
Smad2 항체	인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드, 미국	51-1300	Smad2 검출을 위한 1차 항체
Smad3 항체	인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드, 미국	51-1500	Smad3 검출을 위한 1차 항체
SOD 분석 키트	비요타임 바이오테크놀로지, 상하이, 중국	S0101S	슈퍼옥사이드 디스뮤타제 활성 탐지 키트
TGF-& 베타; 항체 1개	앱캠, 케임브리지, 매사추세츠, 미국	AB215715	TGF-및 베타에 대한 1차 항체; 1 탐지
트리톤 X-100	시그마-올드리치, 세인트루이스, 미주리, 미국	X-100	세포막 투과성을 위한 비이온 세제
TUNEL 분석 솔루션	비요타임 바이오테크놀로지, 상하이, 중국	C1086	DNA 단편화를 위한 세포자멸사 검출 시약
자일렌	시그마-올드리치, 세인트루이스, 미주리, 미국	247642	조직 탈파라핀화를 위한 유기 용매